CN111226796B - 铁皮石斛无糖组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种铁皮石斛无糖组织培养方法，涉及无糖组织培养技术领域。包括以下步骤：S1、取铁皮石斛的茎段，消毒，切为含腋芽茎段；S2、将含腋芽茎段接种至萌发培养基，培养至萌发幼芽；S3、将幼芽接种至继代培养基，进行丛生芽增殖，得到无根芽段；S4、将无根芽段转移至容器中，加入培养液进行培养，分时段通入CO₂，通入CO₂时不进行光照，不通入CO₂时进行光照，控制湿度，培养至长出根系，得到幼苗，移植。本发明的无糖组织培养方法，可以缩短铁皮石斛的培养周期，提高植物中的酶活性，提高植物的存活率。

Description

铁皮石斛无糖组织培养方法

技术领域

本发明涉及无糖组织培养技术领域，特别是涉及一种铁皮石斛无糖组织培养方法。

背景技术

中药材在我国具有悠远的历史，人工栽培已逾两千年，随着人们对健康的重视程度的增加，我国总草药需求量也不断增长。大量采挖野生中药材不仅无法满足市场的需求，还会导致中草药资源遭到不可逆转的破坏。因此，国家、企业和个人在中草药的种植和发展上投入了巨大的人力、物力和财力，以期提高中草药的种植水平，弥补市场缺口。

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是当前市场上销量最大，前景最广的林下中药材。铁皮石斛在早一段时间的“石斛热”中出现市场需求量突增的情况，组培工厂为了满足市场用苗量，缩短了炼苗时间，导致石斛苗质量下降，产品滞销。寻找更合适的方法培育优质铁皮石斛苗是满足市场需求的重点。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种铁皮石斛无糖组织培养方法，可以缩短铁皮石斛的培养周期，提高植物中酶的活性，提高植物的存活率。

一种铁皮石斛无糖组织培养方法，包括以下步骤：

S1、取铁皮石斛的茎段，消毒，切为含腋芽茎段；

S2、将含腋芽茎段接种至萌发培养基，培养至萌发幼芽；

S3、将幼芽接种至继代培养基，进行丛生芽增殖，得到无根芽段；

S4、将无根芽段转移至容器中，加入培养液进行培养，按预定时段通入CO₂，通入CO₂时不进行光照，不通入CO₂时进行光照，控制湿度，培养至长出根系，得到幼苗，移植。

植物光合作用过程包括光反应和碳反应两个阶段，不同植物光合作用过程中固定CO₂的方式和所需CO₂的量不同。发明人发现，在培养铁皮石斛时，通入CO₂的时机不当会抑制其生长，而上述无糖组织培养方法，正是利用铁皮石斛的生长特性，分时间段通入CO₂，在通入CO₂时不进行光照，有利于提高铁皮石斛固定CO₂的能力，以及提高光合作用能力。此方法培育的铁皮石斛酶的活性高，幼苗存活率高，无需驯化炼苗即可直接移植，有利于缩短培养周期。

在其中一个实施例中，所述步骤S1具体为：取铁皮石斛的茎段，用0.08-0.12wt％苯扎溴铵溶液震荡消毒20-40s，用水冲洗，用酒精浸泡20-40s，无菌水冲洗，用0.08-0.12wt％氯化汞灭菌8-12min，无菌水漂洗，切成含腋芽茎段。

在其中一个实施例中，通入CO₂的时间段为18:00至次日8:00。

在其中一个实施例中，不通入CO₂的时间段光照强度为4500-4700lx。

在其中一个实施例中，通入CO₂的浓度为1200-1400μmol·mol^-1。该CO₂浓度最适宜铁皮石斛的无糖组织培养。

在其中一个实施例中，所述步骤S4中，按照下述方法控制湿度：第一周控制湿度为90±5％，第二周控制湿度为80±5％，第三周控制湿度为60±5％，第四周控制湿度为50±5％，第五周移植。

在其中一个实施例中，所述萌发培养基选用MS培养基，且包括以下成分：

在其中一个实施例中，所述继代培养基选用MS培养基，且包括以下成分：

在其中一个实施例中，述步骤S4中，所述培养液中包括以下成分：

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的铁皮石斛无糖组织培养方法，有效利用铁皮石斛的生长特性，分时间段通入CO₂，在通入CO₂时不进行光照，有利于提高铁皮石斛固定CO₂的能力，提高光合作用能力。此方法培育的铁皮石斛酶活性高，幼苗存活率高，无需驯化炼苗即可直接移植，有利于缩短培养周期。

附图说明

图1为铁皮石斛的光合速率对CO₂浓度响应图；

图2为铁皮石斛叶片组织细胞大小对比图；

图3为不同生长环境下铁皮石斛气孔的张开对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

一种铁皮石斛无糖组织培养方法，包括以下步骤：

S1、前处理：采收铁皮石斛茎段，用0.1wt％苯扎溴铵溶液震荡消毒30s，流水冲洗20分钟，转移到在超净工作台中用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗1次，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水漂洗3次，切成含腋芽茎段，待用。

S2、接种：将上述含腋芽茎段接种至萌发培养基，萌发培养基选用MS培养基，成分如下：4mg/L 6BA，0.5mg/L NAA、100g/L苹果泥、30g/L蔗糖、6g/L琼脂、2g/L活性碳。

S3、丛生芽增殖：将萌发后组织接种到继代培养基，进行丛生芽增殖，得到无根芽段，继代培养基选用MS培养基，成分如下：2mg/L 6BA、0.5mg/L NAA、100g/L香蕉泥、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、2g/L活性炭。

S4、壮苗生根：将得到的无根芽段移至装有蛭石和河沙的混合基质(预先经121℃灭菌30min)的容器中，该混合基质中，蛭石和河沙的重量份比为3:1，按照培养液和混合基质的体积比为1:1.5的量加入培养液进行培养。培养液中包括以下成分：1.65g/L NH₄NO₃、1.90g/LKNO₃、0.44g/L CaCl₂·2H₂O₈、0.37g/L MgSO₄·7H₂O、0.17g/L KH₂PO₄、0.83mg/L KI、6.20mg/LH₃BO₃、22.30mg/L MnSO₄·4H₂O、8.60mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/LCuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O₅、37.3mg/L Na₂-EDTA·2H₂O。

在培养过程中，维持温度为23-26℃，于每日的18:00至次日8:00通入CO₂，CO₂浓度为1200-1400μmol·mol^-1，通入CO₂时不光照，保持黑暗，于8:00至18:00不通入CO₂，保持光照，光照强度为4600lx。

并且，在培养过程中按照以下方式控制湿度：第一周控制湿度为90±5％，第二周控制湿度为80±5％，第三周控制湿度为60±5％，第四周控制湿度为50±5％，得到铁皮石斛幼苗。

S5、移植：壮苗生根步骤的第五周，将铁皮石斛幼苗移栽。

对比例1

一种铁皮石斛无糖组织培养方法，与实施例1基本相同，区别在于：S4壮苗生根步骤中，在8:00至18:00通入CO₂，同时进行光照。

对比例2

一种铁皮石斛无糖组织培养方法，与实施例1基本相同，区别在于：S4壮苗生根步骤中，控制湿度方式为：第一周控制湿度为90±5％，第二周控制湿度为80±5％，第三周控制湿度为70±5％，第四周控制湿度为60±5％，第五周控制湿度为50％-40％，第六周移苗栽植。

对比例3

一种铁皮石斛无糖组织培养方法，与实施例1基本相同，区别在于：S4壮苗生根步骤中，控制湿度方式为：第一周控制湿度为80±5％，第二周控制湿度为70±5％，第三周控制湿度为60±5％，第四周控制湿度为50±5％，第五周移苗栽植。

对比例4

一种铁皮石斛传统有糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，继代培养之后转到生根壮苗培养基中培养45-60天。

对比例5

一种铁皮石斛驯化苗培养方法，与对比例4的区别在于，经过生根壮苗培养后将瓶苗放到温室大棚中驯化培养30天后洗苗移栽。

实验例1

保持实施例1其他条件相同，在不同CO₂浓度下的测试铁皮石斛对CO₂的响应曲线，结果如图1所示，从图中可以看出，铁皮石斛在CO₂浓度为1200-1400μmol·mol^-1时光合速率最快，净光合作用约为7μmol^-2·S^-1。

实验例2

对实施例1、对比例4-5的铁皮石斛叶片细胞中的海绵组织和栅栏组织宽(W)长(L)进行比较，通过重复性T检验分析，对细胞形态的显著性检验做出结果分析。

铁皮石斛叶片细胞形态如下表所示：

表1.铁皮石斛叶片细胞形态对比

表1的结果表明传统有糖组培、无糖组培和驯化苗的铁皮石斛海绵组织和栅栏组培的细胞W和L均存在极显著的差异。

铁皮石斛叶片组织细胞大小如图2所示，结果表明：有糖组培培育的铁皮石斛细胞要大于无糖组培和驯化苗的铁皮石斛细胞，无糖组培细胞与驯化苗细胞大小(长L宽W)相似。

实施例3

对实施例1、对比例4-5的铁皮石斛叶片细胞中气孔大小进行比较，通过重复性T检验，对气孔形态的显著性检验做出结果分析，结果如下表所示，不同生长环境下两种植物气孔的张开程度如图3所示。

表2.不同培养方式下植物气孔大小比较

表2表明铁皮石斛这两种植物的气孔大小在有糖组培、无糖组培以及驯化这三种培养方式下均存在极显著的差异。

从图3可以看出，铁皮石斛的气孔张开程度均为：传统有糖组培苗>无糖组培苗>驯化苗。传统组培以兼养方式生长，栅栏组织和海绵组织的细胞长，宽均大于无糖组培。植物气孔结构也明显不同，气孔保卫细胞相对较圆，气孔基本呈开放状态，而且张开的幅度很大，呈现出过度开放的状态，而且即使在无光照的条件下气孔也不关闭。在一定条件下，当气孔开口的横径大于纵径或超过两个保卫细胞膨压变化的范围，就会导致气孔不能关闭。从试验中可以发现，这种过度开放的气孔，在无糖组培环境中已经明显得到改善甚至已经不存在，但是传统组培需要通过炼苗之后，才能使气孔正常关闭，少部分气孔仍然处于长期开放的状态。

实施例4

测试实施例1、对比例4-5的铁皮石斛叶片中超氧化歧化酶(SOD)、过氧化物酶Peroxidase(POD)、过氧化氢酶Catalase(CAT)的活性，结果如下表所示。

表3.不同培养方式下酶活性的比较

表3结果表明，相比于传统有糖组培和驯化苗，本发明无糖组培中超氧化歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性显著更高。

实验例5

测试实施例1、对比例1的铁皮石斛不同通气时间生长情况，结果如下表所示：

表4.铁皮石斛对通入CO₂时间生长情况的比较

表4可以看出，铁皮石斛在晚上/无光照情况下通入CO₂(实施例1)与白天/有光照情况下通入CO₂(对比例1)的株高增长量，叶长增长量及叶宽增长量显著提高；在有光照情况下通入CO₂株高增长量、叶长增长量及叶宽增长量与空白对照组(CK)相比差异不显著。

实验例6

实施例1、对比例2-3的铁皮石斛在组培过程中的存活率如下表所所示：

表5.铁皮石斛存活率(％)

综上所述，无糖组培与传统有糖组培相比，铁皮石斛的叶片栅栏组织、海绵组织的形态结构及气孔大小都有显著差异。实验结果表明无糖组培比传统组培SOD、CAT和POD活性明显要高，说明无糖组培植株的活力、抗衰老能力和对逆境的胁迫的反应能力都比传统有糖组培要强。

在无糖组培微环境中，CO₂浓度对不同植物的光合速率有不同的影响，直接影响着植物的光合作用的效果。CO₂通入的时间不同，对植物的生长也有显著性差异。实验结果表明，对于铁皮石斛来说，在无光条件下通入CO₂的效果优于在光照情况下通入的效果且呈现显著性差异。

在无糖组培微环境中，湿度控制对铁皮石斛的存活率有较大的影响。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种铁皮石斛无糖组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取铁皮石斛的茎段，消毒，切为含腋芽茎段；

S2、将含腋芽茎段接种至萌发培养基，培养至萌发幼芽；

S3、将幼芽接种至继代培养基，进行丛生芽增殖，得到无根芽段；

S4、将无根芽段转移至容器中，加入培养液进行培养，按预定时段通入CO₂，通入CO₂的时间段为18:00至次日8:00，通入CO₂时不进行光照，不通入CO₂时进行光照，控制湿度，第一周控制湿度为90±5％，第二周控制湿度为80±5％，第三周控制湿度为60±5％，第四周控制湿度为50±5％，第五周培养至长出根系，得到幼苗，移植。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛无糖组织培养方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：取铁皮石斛的茎段，用0.08-0.12wt％苯扎溴铵溶液震荡消毒20-40s，用水冲洗，用酒精浸泡20-40s，无菌水冲洗，用0.08-0.12wt％氯化汞灭菌8-12min，无菌水漂洗，切成含腋芽茎段。

3.根据权利要求1所述的铁皮石斛无糖组织培养方法，其特征在于，通入CO₂的浓度为1200-1400μmol·mol^-1。

4.根据权利要求1所述的铁皮石斛无糖组织培养方法，其特征在于，不通入CO₂的时间段光照强度为4500-4700lx。

5.根据权利要求1所述的铁皮石斛无糖组织培养方法，其特征在于，所述萌发培养基选用MS培养基，且包括以下成分：

6.根据权利要求1所述的铁皮石斛无糖组织培养方法，其特征在于，所述继代培养基选用MS培养基，且包括以下成分：

7.根据权利要求1-6任一项所述的铁皮石斛无糖组织培养方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述培养液中包括以下成分：

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