CN115777539B - 一种水黄皮组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种水黄皮组织培养方法，包括以下步骤：S1、外植体处理：外植体选取生长状态良好，抗病抗虫性强的单株，选择半木质化并带有休眠芽的侧枝，修剪成小茎段，用清水冲洗后进行消毒；S2、初代培养：将外植体接种到水黄皮培养基中培养，得到初代苗；S3、继代培养：将初代苗切成5cm左右的带叶片的茎段，移植到新的水黄皮培养基中培养四周，得到继代苗。S4、生根培养：将继代苗接种到新的水黄皮培养基，每天光照10小时，控制湿度，光照同时通入二氧化碳，培养六周后进行移栽。本发明提供了一种水黄皮组织培养方法，优选生长状态良好、抗病抗虫性强的单株进行无病繁育，在降低繁育成本的同时还可达到快速繁育的目的。
Description
技术领域
本发明属于植物培养技术领域，尤其涉及一种水黄皮组织培养方法。
背景技术
水黄皮是豆科水黄皮属植物，乔木，高8～15米。生长于溪边、塘边及海边潮汐能到达的地方，木材纹理致密美丽，可制作各种器具；种子油可作燃料；全株入药，沿海地区可作堤岸护林和行道树。
由于水黄皮的种子需要在低温、荫凉和较为干燥的条件下可贮存，但时间短，仅1年左右，且生长的区域以潮湿的滩涂为主，种子易掉入水中，因此采得达到保存要求的种子不容易。水黄皮属于半红树，目前该树种常规的培育方式以室外播种及扦插为主。由于其生长于溪边、塘边及海边，因此在生境地繁育时使用农药培育易造成水环境污染。传统的培育方法培育成本高，繁育效率低，不能满足市场需求。
组织培养是一种高效的无性繁殖方法，既可以提高繁殖效率，又可以保留母株的优良性状，在种苗快繁、良种选育等方面发挥重要作用。然而，目前针对水黄皮的组织培养方法未见报道。
发明内容
基于此，本发明提供了一种水黄皮组织培养方法，优选生长状态良好、抗病抗虫性强的单株进行无病繁育，在降低繁育成本的同时还可达到快速繁育的目的。
一种水黄皮组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、外植体处理：外植体选取生长状态良好，抗病抗虫性强的单株，选择半木质化并带有休眠芽的侧枝，修剪成4～6cm的小茎段，用清水冲洗30分钟后进行消毒；
S2、初代培养：将外植体接种到水黄皮培养基中培养4周，得到初代苗；
S3、继代培养：将初代苗切成5cm左右的带叶片的茎段，移植到新的水黄皮培养基中培养四周，得到继代苗。
S4、生根培养：将继代苗接种到新的水黄皮培养基，每天光照10-12小时，控制湿度，光照同时通入二氧化碳并维持浓度为3000～3500μmol·mol-1，培养六周后进行移栽。
和现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
水黄皮生长需要较多的水分，甚至需要将根部浸泡到水中，但又需要疏水透气的基质让根部保持有足够的氧气以供呼吸。现有的培养基一般只采用蛭石，而本发明为了给水黄皮根部提供更好的生长环境，提出了一种蛭石和稻壳碳混合的培养基，稻壳碳的加入使基质总体疏松程度总体上更接近滩涂的效果，更有利于水黄皮根的生长。
进一步的，所述水黄皮培养基的组分包括蛭石、稻壳碳和培养液，三者的体积比为3：1：4.8，其中培养液的配方如下：
进一步的，步骤S2的具体步骤为：将外植体接种到水黄皮培养基中，控制温度25～27℃，湿度80～85％，每天在光照强度为2000～4000Lux的条件下光照10h，光照的同时通入二氧化碳并维持浓度1000～1500μmol·mol-1，培养4周，得到初代苗；
进一步的，步骤S3的具体步骤为：将初代苗切成5CM左右的带叶片的茎段，移植到新的水黄皮培养基中，控制温度25～27℃，湿度80～85％，每天在光照强度为3000～4000Lux的条件下光照10h，光照的同时通入二氧化碳并维持浓度1800～2500μmol·mol-1，培养四周，得到继代苗。
进一步的，步骤S4中光照强度为3000～4000Lux。
进一步的，步骤S4中控制湿度的方法为：第一周控制湿度为80％，第二周控制湿度为75％，第三周控制湿度为70％，第四周控制湿度为65％，第五和第六周控制湿度为60％。
进一步的，步骤S1中的消毒步骤为：将采集得到的外植体用10％苯扎溴铵溶液清洗，再用5％次氯酸钠溶液浸泡20min，随后清水冲洗干净即可。
和现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明所采用的水黄皮培养基为无糖培养基，不含有蔗糖、葡萄糖、苹果泥或香蕉泥等碳源，在一定程度上避免了微生物的污染，有利于水黄皮快速生长。
(2)本发明为了给水黄皮根部提供更好的生长环境，提出了一种蛭石和稻壳碳混合的培养基，稻壳碳的加入使基质总体疏松程度总体上更接近滩涂的效果，更有利于水黄皮根的生长。
(3)水黄皮长期生活在海边潮汐能到达的地方，其生活环境与一般陆生植物不同，通过对其生境水源及土壤的成分及其对Ca2+和Mg2+离子的吸收分析，本发明大幅提高培养基中Ca2+和Mg2+的含量，有利于水黄皮快速生长。
附图说明
图1为实施例1水黄皮初代苗的生长情况图；
图2为实施例3水黄皮生根幼苗的生长情况图；
图3为实施例5水黄皮生根幼苗的生长情况图；
图4为实施例1水黄皮生根幼苗的生长情况图；
图5为实施例5水黄皮生根幼苗的生长情况图；
图6为实施例1、3和5以及对比例1水黄皮叶片细胞叶绿体观察图。
图6中，A为对比例1，B为实施例1，C为实施例3，D为实施例5。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与术语本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
实施例1：
一种水黄皮组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制水黄皮培养基，水黄皮培养基的成分包括蛭石、稻壳碳和培养液，蛭石、稻壳碳和培养液的体积比为3：1：4.8，其中培养液包含以下成分：30.4g/L NH4NO3、32g/LKNO3、1000mg/L CaCl2·2H2O、2000mg/L MgSO4·7H2O、3.4g/L KH2PO4、1.0g/L NaCl、5mg/LNaHCO3、166mg/L KI、1240mg/L H3BO3、4460mg/L MnSO4·4H2O、1720mg/L ZnSO4·7H2O、50mg/LNa2MoO4·2H2O、5mg/L CuSO4·5H2O、5mg/L CoCl2·6H2O、560mg/L FeSO4·7H2O、7460mg/LNa2-EDTA·2H2O、0.04mg/L NAA。
(2)水黄皮的组织培养
S1、外植体处理：外植体选取生长状态良好，抗病抗虫性强的单株，选择半木质化并带有休眠芽的侧枝，修剪成4-6cm的小茎段，用清水冲洗30分钟后，将采集得到的外植体用10％苯扎溴铵溶液清洗，再用5％次氯酸钠溶液浸泡20min，随后清水冲洗干净即可。；
S2、初代培养：将外植体接种到水黄皮培养基中，控制温度25～27℃，湿度80～85％，每天在光照强度为2000～4000Lux的条件下光照10h，光照的同时通入二氧化碳并维持浓度1000～1500μmol·mol-1，培养4周，得到初代苗；
S3、继代培养：将初代苗切成5CM左右的带叶片的茎段，移植到新的水黄皮培养基中，控制温度25～27℃，湿度80～85％，每天在光照强度为3000～4000Lux的条件下光照10h，光照的同时通入二氧化碳并维持浓度1800～2500μmol·mol-1，培养四周，得到继代苗；
S4、生根培养：将继代苗接种到新的水黄皮培养基，每天在光照强度为3000～4000Lux的条件下光照10小时，控制湿度，光照同时通入二氧化碳并维持浓度为3000～3500μmol·mol-1，培养六周后进行移栽。
并且，在生根培养时按照如下方法控制湿度：第一周控制湿度为80％，第二周控制湿度为75％，第三周控制湿度为70％，第四周控制湿度为65％，第五和第六周控制湿度为60％。
对比例1：
对比例1与实施例1的区别在于步骤(2)中，使用传统MS培养基替换步骤(1)中配制的培养基，其中所述传统MS培养基中CaCl2·2H2O的浓度为440mg/L，MgSO4·7H2O的浓度为370mg/L，将其培养基基质替换为琼脂，并添加蔗糖，其余成分不变。
其余步骤、工艺同实施例1。
对比例2：
对比例2与实施例1的区别在于步骤(2)中，水黄皮培养基的基质为全蛭石基质，其余成分不变。
其余步骤、工艺同实施例1。
实施例2：
实施例2与实施例1的区别在于步骤(1)中，配制的培养基中CaCl2·2H2O的浓度为900mg/L，MgSO4·7H2O的浓度为1750mg/L。
其余步骤、工艺同实施例1。
实施例3：
实施例3与实施例1的区别在于步骤(1)中，配制的培养基中CaCl2·2H2O的浓度为800mg/L，MgSO4·7H2O的浓度为1500mg/L。
其余步骤、工艺同实施例1。
实施例4：
实施例4与实施例1的区别在于步骤(1)中，配制的培养基中CaCl2·2H2O的浓度为1100mg/L，MgSO4·7H2O的浓度为2250mg/L。
其余步骤、工艺同实施例1。
实施例5：
实施例5与实施例1的区别在于步骤(1)中，配制的培养基中CaCl2·2H2O的浓度为1200mg/L，MgSO4·7H2O的浓度为2500mg/L。
其余步骤、工艺同实施例1。
实验例1：
对实施例1-5以及对比例1和对比例2水黄皮培养基污染率进行测定，并对生根后的幼苗生长情况进行测定，结果如下表所示：
表1.水黄皮生根后的幼苗生产情况的比较
从表1可以看出，对比例1使用了传统MS培养基并添加蔗糖，培养基的微生物感染率为26％，而其他实施例以及对比例2均没有微生物感染的现象，可见本方案使用无糖培养基能有效防止微生物感染。组织培养中采用含有更高浓度的Ca2+和Mg2+的培养基有利于幼苗的生长，使用传统MS培养基(对比例1)培养获得的幼苗平均根长和地径在实施例1-5中最短，使用Ca2+和Mg2+浓度最高的水黄皮培养基(实施例5)获得的幼苗平均根长和地径在实施例1-5中最长。对比例1增殖困难，难以继代，但能出现少量根系，移栽后30天内全部死亡，原因与出瓶后的环境与传统培养方式瓶内微环境变化过大及培养基生长中细胞渗透压变化有关。
取实施例1、实施例3、实施例5和对比例1的叶片，使用显微镜观察其叶片细胞中叶绿体的含量，结果如图6所示。从图中可以看到实施例5水黄皮叶片细胞中叶绿体数量最多，对比例1水黄皮叶片细胞中叶绿体数量最少。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种水黄皮组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、外植体处理：选取生长状态良好，抗病抗虫性强的单株，选择半木质化并带有休眠芽的侧枝，修剪成4～6cm的小茎段，用清水冲洗并消毒；
S2、初代培养：将外植体接种到水黄皮培养基中培养4周，得到初代苗；
S3、继代培养：将初代苗切成4～6cm的带叶片的茎段，移植到新的水黄皮培养基中培养四周，得到继代苗；
S4、生根培养：将继代苗接种到新的水黄皮培养基，每天光照10-12小时，控制湿度，光照同时通入二氧化碳并维持浓度为3000～3500μmol·mol-1，培养六周后，获得生根幼苗，然后进行移栽；
所述水黄皮培养基的组分包括蛭石、稻壳碳和培养液，所述蛭石、稻壳碳和培养液的体积比为3：1：4.8，其中培养液的配方如下：
2.根据权利要求1所述的一种水黄皮组织培养方法，其特征在于，步骤S2的具体步骤为：将外植体接种到水黄皮培养基中，控制温度25～27℃，湿度80～85％，每天在光照强度为2000～4000Lux的条件下光照10h，光照的同时通入二氧化碳并维持浓度1000～1500μmol·mol-1，培养4周，得到初代苗。
3.根据权利要求1所述的一种水黄皮组织培养方法，其特征在于，步骤S3的具体步骤为：将初代苗切成5CM的带叶片的茎段，移植到新的水黄皮培养基中，控制温度25～27℃，湿度80～85％，每天在光照强度为3000～4000Lux的条件下光照10h，光照的同时通入二氧化碳并维持浓度1800～2500μmol·mol-1，培养四周，得到继代苗。
4.根据权利要求1所述的一种水黄皮组织培养方法，其特征在于，步骤S4中光照强度为3000～4000Lux。
5.根据权利要求1所述的一种水黄皮组织培养方法，其特征在于，步骤S4中控制湿度的方法为：第一周控制湿度为80％，第二周控制湿度为75％，第三周控制湿度为70％，第四周控制湿度为65％，第五和第六周控制湿度为60％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种水黄皮组织培养方法，其特征在于，步骤S1中的消毒步骤为：将采集得到的外植体用10％苯扎溴铵溶液清洗，再用5％次氯酸钠溶液浸泡20min，随后清水冲洗干净即可。
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