CN115715523B

CN115715523B - 一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法

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Publication number: CN115715523B
Application number: CN202211511052.6A
Authority: CN
Inventors: 阮继伟; 杨春梅; 吴丽芳; 单芹丽; 余蓉培; 卢珍红; 方洪兵
Original assignee: Yuxi Zhuorui Biotechnology Co ltd; Flower Research Institute of YAAS
Current assignee: Yuxi Zhuorui Biotechnology Co ltd; Flower Research Institute of YAAS
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2042-11-29
Also published as: CN115715523A

Abstract

本发明涉及一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法，属于农业技术领域，本发明技术利用滇中地区气候优势，通过闷棚热处理和人工补光提早草莓匍匐茎萌发和生长，将茎尖生长点剥取提前至4月；可显著提高生长点剥取、培养和脱毒效率；当年7月获得脱毒生根苗并作为母株定植开始第一轮扩繁，至11月底采收子苗扦插生根；第二年2月和6月分别用上一轮扩繁的子苗作为母株，进行第二轮和第三轮扩繁，至年底头年构建的1株脱毒种源可扩繁脱毒种苗10万株以上。本发明显著提高了脱毒种源构建效率，避免瓶内扩繁潜在的变异风险；能提前完成脱毒种源构建，高效安排扩繁茬口，可在提高扩繁效率的同时有效降低生产成本。

Description

一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体的说，涉及一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法。

背景技术

草莓(Fragaria x ananassa Duch.)，又名凤梨草莓，属蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)。草莓色泽鲜艳，果实柔软多汁，香味浓郁，酸甜适口，营养丰富，深受国内外消费者的喜爱。草莓种苗以营养繁殖为主；多年常规营养繁殖后植株感病退化严重，草莓品种特性和生产潜能不能完全表现出来，严重制约草莓产业的发展，脱毒健康种苗的构建与推广应用是解决上述问题的有效途径。

云南草莓种苗生产有得天独厚的气候优势，低纬高原的地里位置决定了春天来得早，冬天来得晚，冬无严寒夏季无酷暑的气候条件，种苗产量(生长期长)和质量高；与中高纬度地区相比较短的夏季日照时长和温凉的气候特别有利于草莓花芽分化，自然条件下云南草莓种苗花芽分化早，开花结果也早；选择不同海拔进行育苗，配套相应的肥水管控措施，云南可实现从6至10月连续批量供苗；云南夏季种苗繁育阶段没有台风困扰，也不容易被水涝，生产比较安全稳定。目前云南草莓种苗生产面积超过3万亩，年生产种苗10亿株以上，未来五年云南草莓种苗生产面积有望超过6万亩，将发展成为我国草莓种苗生产的主产区，脱毒种源需求非常大。

脱毒种源的获取是生产健康脱毒种苗的基础。草莓脱毒种源一般通过茎尖生长点、花药培养或超低温处理等手段获取，但生产上用的最多的还是通过茎尖培养获取脱毒种源。扩繁是降低脱毒种源构建的高成本至生产上可接受成本(单价)，并满足产业上对脱毒种苗数量需求的必由之路。目前脱毒种源扩繁生产脱毒苗的路径有2条，即瓶内扩繁和瓶外扩繁；国内主要采用瓶内扩繁，即在组培环节通过在培养基内添加细胞分裂素(通常用BA-6)，多代增殖扩繁到一定的数量，再完成瓶内生根瓶外炼苗，此途径最大的问题是组培环节容易产生变异，特别是花粉发育和花粉量相关性状的变异，对生产造成不可估量的损失；美国和欧洲发达国家主要采用瓶外扩繁，即瓶内获得脱毒种源后不在瓶内扩繁(培养基不添加细胞分裂素)，而通过在大棚内或田间3-5茬(年)的营养繁殖扩繁到一定的数量；此方法的缺点是周期长，时间成本高，病毒再次感染的几率大。

本技术发明方法充分利用滇中地区春天来得早、冬天来得晚、冬无严寒和夏无酷暑的气候优势；春天匍匐茎萌发早，通过早春闷棚热处理和补充人工光照，提早匍匐茎萌发和生长，并将茎尖生长点剥取时间提前至4月底；优化培养流程和培养条件，在当年7月获得生根脱毒种源并作为母株定植开始第一轮种苗扩繁，繁殖至当年11月底采收子苗扦插生根；第二年2月和6月分别用上一轮生产的子苗作为母株进行第二轮和第三轮扩繁，至第二年年底，第一年构建的1株生根脱毒种源可繁殖脱毒种苗10万株以上，‘章姬’等匍匐茎发生量大的品种1株生根脱毒种源可繁殖脱毒种苗15万株以上。本技术避免的瓶内扩繁潜在的变异风险，高效安排扩繁茬口，集成优化肥水管控、温度管理和子苗生根等技术，提高扩繁效率的同时有效降低生产成本，实现草莓脱毒种源快速构建和扩繁，有助于草莓新品种的快速推广应用。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法，包含以下步骤：

S1，在冬季鲜果生产大棚内，根据植株挂果表现和植株的长势，在1月份选择生长健壮、品种纯正的草莓植株打除花序和多余老叶，标记备用；

S2，在3-4月，白天通过闷棚积累太阳热能，控制大棚内温度在36-40摄氏度，催生草莓植株的匍匐茎至5-8条，使得部分匍匐茎分叉产生2个以上茎尖；

S3，采集步骤S2中繁殖的匍匐茎茎尖作为外植体在超净工作台内消毒，在体视显微镜下剥取消毒后的外植体生长点，放入起始培养基内暗培养7天，温度25℃；起始培养基为MS+GA 0.5mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6000mg/L，pH为5.8～6.0；

S4，将暗培养7天后的外植体，转移至一次成苗培养基上培养40-45d，得生根苗；一次成苗培养基为MS+IBA 0.2～0.3mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6000mg/L，pH为5.8～6.0；

S5，取生根苗进行检测，无毒植株进行原种苗炼苗：6月中旬，将无毒的生根幼苗移植至128孔穴盘内，穴盘内填充草炭和珍珠岩按体积8：2混合的栽培基质，浇足定根水后养护于塑料大棚内；在生根幼苗上覆盖一层透明无色塑料薄膜，塑料薄膜四周压在穴盘底部，使生根幼苗处于封闭的环境下保持湿度；在穴盘上方搭拱棚，拱棚上覆盖2层遮光率为80％的遮阳网，定植后第3-4天，生根幼苗新生根系已进入栽培基质30～50mm时揭开所述塑料薄膜，3天后揭开拱棚上第一层遮阳网，再过3天后揭开拱棚上第二层遮阳网；从定植至揭开薄膜期间不浇水，之后适时浇水保持穴盘内栽培基质含水量为45～50％质量分数；定植后第10天和第20天，用繁殖专用肥水配方给幼苗施肥，肥水EC值为1.5S cm^-1，每株浇8～10毫升，定植后第40-45天，穴盘孔内的栽培基质外壁布满新生根，即获得脱毒原种草莓穴盘苗；壮苗专用肥水配方各元素质量比为N:P:K:Ca:Mg:Fe:Mn:Cu:Zn:B:Mo＝100:50:130:80:24:2.5:0.5:0.02:0.05:0.5:0.01，其中硝态氮(NO₃ ^-)和铵态氮(NH₄ ⁺)的分子数量比例为90:10；

S6，第一轮扩繁：7月下旬，将上述脱毒原种草莓穴盘苗定植于大棚内高架基质槽内，相邻两个草莓栽培槽间距1.1～1.2米；草莓栽培槽槽口距地面1000-1200mm；草莓栽培槽内填充栽培基质，所述栽培基质由草炭和珍珠岩或椰糠和珍珠岩按体积比7:3混合而成；通过滴灌向植株供给营养液，定植后至10月中旬采用繁殖专用肥水配方，10月下旬至子苗采收前采用上述壮苗专用肥水配方，营养液的EC值控制在0.8-1.1S cm^-1，PH值控制在5.6-6.0，供给量为200-300毫升/株·天，阴雨天营养液的供给量减半或暂停；与上述壮苗专用肥水配方相比，繁殖专用肥水配方降低了磷肥和钾肥的比例，各元素重量比为N:P:K:Ca:Mg:Fe:Mn:Cu:Zn:B:Mo＝100:25:110:80:24:2.5:0.5:0.02:0.05:0.5:0.01，其中硝态氮(NO₃ ^-)和铵态氮(NH₄ ⁺)的分子数量比例为85:15；正常养护至11月底，一次性剪下匍匐茎上的子苗扦插，扦插后45-50天成苗，每母株可繁殖并获得扦插苗57-70株；扦插具体步骤如下：

a修剪，剪断匍匐茎采收子苗，使子苗至少带6根气生根，打除老叶仅保留1-2片叶，所剪取的每株子苗基部保留一根50～70mm长的匍匐茎；把子苗按重量分大、中、小三类，分类扦插便于管理；

b扦插，将修剪后的子苗插入装有栽培基质的穴盘内，每穴扦插1株，扦插深度以气生根刚好没入栽培基质为准，且将保留的匍匐茎插入穴盘内的栽培基质起固定作用；穴盘内的栽培基质与步骤S5中所述的栽培基质相同，扦插前将栽培基质浇透水一次；

c植株管理，将插有子苗的穴盘置于平整的大棚内地面上或苗床上，并在子苗上覆盖一层透明无色塑料薄膜，塑料薄膜四周压在穴盘下面将穴盘封闭，使子苗处于一个封闭的环境下保持湿度；在穴盘上方搭拱棚，拱棚上覆盖2层遮光率为80％的遮阳网，在扦插后第7-8天，子苗新生根系已进入栽培基质30～70mm时揭开所述塑料薄膜，3天后揭开拱棚上第一层遮阳网，再过3天揭开拱棚上第二层遮阳网；从扦插至揭开薄膜期间不浇水，之后适时浇水保持穴盘内栽培基质含水量为45～50％质量分数，扦插20天后，每周施肥一次，用壮苗专用肥水配方肥水,营养液的EC值控制在0.8-1.1S cm^-1，每株浇30～40毫升；扦插后第40-45天，穴盘孔内的栽培基质外壁布满扦插苗新生根，即为草莓脱毒穴盘苗；

S7，第二轮扩繁：采用塑料圆筒营养钵为母株定植容器，里面填充步骤S5所述栽培基质，填充至钵口下30～40mm为宜；次年2月底，将S6步骤生产的脱毒穴盘苗定植于营养钵内作为母株营养繁殖子苗，每钵2株，定植后浇透水一次，置于大棚内生长，大棚侧窗、顶窗和门都设有防虫网，避免迁飞害虫进入；通过滴灌向植株供给营养液，采用繁殖专用肥水配方，营养液的EC值控制在0.8～1.1S cm^-1，PH值控制在5.6～6.0；

定植于营养钵的母株于3月初开始发生匍匐茎，匍匐茎的双数节产生子苗，当子苗萌发10-30毫米长根系3条以上时，将子苗固定在小营养钵内生根，一钵一苗，营养钵内填充步骤S5所述栽培基质，并在固定子苗前让基质浸透水；以10天为间隔，在新准备的小营养钵内固定新生的子苗，同时给上一批固定的子苗浇一次清水；子苗固定20天后，根系基本包裹住营养钵内基质，已达到采收标准，6月下旬一次性采收营养钵子苗，每母株可繁殖子苗34-45株；

S8，第三轮扩繁：次年6月下旬，采收第二轮扩繁繁殖生根良好的营养钵子苗作为母株定植，重复第一轮扩繁繁殖子苗，正常养护至11月底，一次性采收按第一轮扩繁的方法扦插和养护子苗，每母株可繁殖子苗60-70株；

扦插成活后至下年定植前(2-3月)，尽量打开大棚侧窗和顶窗，让植株接受冬季自然低温的刺激，有利于提高来年植株长势和匍匐茎的萌发量，期间不断打除植株上萌发的花序，减少植株不必要的营养消耗进一步的。

进一步的，所述S3步骤中，外植体的消毒方法为：超净工作台内消毒，用75％(v/v)的酒精表面消毒60s；然后无菌水清洗3次，再于混合消毒液中消毒8～10min，再用无菌水冲洗3次；混合液为每100ml质量浓度为1％的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温-20。

进一步的，所述S2步骤中，在棚内按20只/667m²的密度在植株顶上1.5米高处安装100W白炽灯，日落后打开白炽灯补光直至23:00止。

进一步的，所述S4步骤中，使用LED组合光源光照条件进行一次成苗培养，所述LED组合光源光照条件为：LED红光：LED蓝光：LED白光：LED远红光的光照强度比＝5:1:2:2，LED组合光源下25厘米的位置的光照强度为53～55μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16小时/天，光照阶段培养温度控制在25℃±2℃，无光阶段培养温度控制在20℃±2℃。

进一步的，所述S5步骤中，原种苗炼苗时，除下雨外，保持大棚侧窗和顶窗开放便于通风散气，下雨时关闭大棚避免植株淋雨。

进一步的，所述S6步骤中，扦插前种苗繁育大棚，日出后30分钟内打开大棚侧窗和顶窗通风散气，日落前30分钟关闭大棚侧窗和顶窗保温；扦插后的扦插大棚内早上日出后待棚内植株叶片周围温度上升至30℃以上时，逐步打开侧窗和顶窗湿，日落前1小时30分关闭大棚侧窗和顶窗保温，期间不断打除母株和子苗上萌发的花序、老叶和多余的侧芽，减少植株不必要的营养消耗，按常规栽培技术对植株进行病虫害防治，其中白粉病和红蜘蛛防治药剂7-10天喷雾一次。

本发明的有益效果：

1、本发明采用3月中旬至4月底闷棚热处理、补充人工光源延长光照时间等措施有效增加了匍匐茎和子苗的数量，抑制了茎尖过早花芽分化，提高后续茎尖培养效率和脱毒效率，同时操作简便、成本低。

2、本发明中提早了茎尖生长点剥取时间点，起始培养的设计提高了茎尖(特别是切割较小茎尖)培养的存活率(见表2)，而切割较小的茎尖脱毒率更高；一次成苗培养基和LED组合光源(表2和表3)的创新应用可在40-45天内一次培养获得生根苗，为当年内完成第一轮扩繁留足了时间，提高了时间利用效率。

3、本发明利用了滇中地区的生长期长的气候优势可在2年的时间内合理安排完成外植体的选择与处理、茎尖生长点剥取培养构建脱毒种源、脱毒原种苗炼苗和三轮种苗扩繁，实现1个脱毒原种苗扩繁10万株以上脱毒种苗，节省时间的同时保持了较高的生产效率，推广应用价值高。

4、本发明中繁殖专用肥水配方和壮苗专用肥水配方的搭配使用和温度管理等措施显著提高了子苗繁殖效率和种苗质量，平衡兼顾了子苗繁殖数量和子苗质量；炼苗和子苗扦插初期的水分管理措施高效、节约成本、操作方便。

附图说明

图1是本发明中草莓茎尖生长点剥取与培养示意图，图中左：采种圃采集的匍匐茎茎尖，中：体视显微镜下(80倍)的生长点(含1片叶原基)，右：一次成苗培养40天后的‘章姬’幼苗。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例1

(1)外殖体的选择与处理

2019年1月7日，在云南农业科技园(玉溪江川，海拔1760米)鲜果生产大棚内，根据草莓品种‘章姬’植株挂果表现和植株的长势，选择生长健壮、品种纯正的草莓植株10株并标记备用。2月13日，将优选植株挖出，打除花序和多余老叶(留2-3片叶子)定植到采种大棚内，按常规技术养护，期间不断打除新萌发的花序。

滇中地区春天来得早，3月8日以后上述定植的植株开始萌发匍匐茎，从3月16日至4月28日，利用此阶段晴天多，白天光照充足的气候特点，白天关闭大棚侧窗和顶窗提高棚内温度对植株进行热处理，白天温度控制目标为38℃左右，在植株叶片的高度安装温度探头，探头与大棚侧窗和顶窗控制系统连接，当温度高于40℃时自动打开(大约10厘米，正常开合度的1/4～5)侧窗和顶窗降温,当温度低于36℃以及阴雨天，自动关闭大棚侧窗和顶窗保温。日落后至晚23:00，打开人工光源补光延长光照时间。

4月28日，经上述热处理的植株匍匐茎的平均数量达到7.6条/株，匍匐茎尖平均8.9个/株。

(2)茎尖生长点剥取培养构建脱毒种源

4月28日，采集步骤(1)中的匍匐茎茎尖(30～40mm)作为外殖体在超净工作台内消毒，用75％(v/v)的酒精表面消毒60s；然后无菌水清洗3次，再于混合消毒液中消毒8～10min，再用无菌水冲洗3次；混合液为每100ml质量浓度为1％的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温-20。

将上述消毒后的外殖体在超净工作台内，体视显微镜下(放大80倍)剥取生长点，用手术刀片切下将包含1片叶原基的生长点，放入起始培养基内暗培养7天(4月28日至5月5日)，温度25℃。起始培养基为MS+GA 0.5mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6000mg/L，pH为5.8～6.0。共培养生长点48个，培养7天后成活43个。

5月5日，将上述在起始培养基上暗培养7天的43个外殖体转接至一次成苗培养基培养，一次成苗培养基为MS+IBA 0.2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6000mg/L，pH为5.8；在LED组合光源光照条件下，培养40d，6月14日得生根苗，植株长出2-3片叶子，株高20～30mm,根系2-4条；光照时间为16小时/天，光照阶段培养温度控制在25℃±2℃，无光阶段培养温度控制在20℃±2℃。

上述生根幼苗，各单株取一个叶片，用于实验室检测病毒，检测方法参见《草莓脱毒种苗生产技术规程》(NY/T3032-2016)，39株检测无病毒植株用于后续田间繁殖。

(3)脱毒原种苗炼苗

6月14日，将步骤(2)中获得的生根幼苗移植至128孔穴盘内，穴盘内填充草炭(纤维长度0-10mm)和珍珠岩(粒径3mm)按体积8：2混合的基质,浇足定根水后养护于塑料大棚内，并在子苗上覆盖一层透明无色塑料薄膜，塑料薄膜四周压在穴盘底部，使子苗处于一个封闭的环境下保持湿度；在穴盘上方搭拱棚，拱棚上覆盖2层遮光率为80％的遮阳网，定植后第3天(6月17日)，子苗新生根系已进入栽培基质30～50mm时，揭开所述透明无色塑料薄膜，3天后(6月20日)揭开拱棚上第一层遮阳网，再过3天后(6月23日)揭开拱棚上第二层遮阳网；从定植至揭开薄膜期间不浇水，之后适时浇水保持穴盘内栽培基质含水量为45～50％质量分数，定植后第15天(6月29日)和第25天(7月9日)，用繁殖专用肥水配方肥水(EC值为1.5)，每株浇8～10毫升，定植后第40天(7月24日)，穴盘孔内的栽培基质外壁布满新生根,即获得脱毒原种草莓穴盘苗。

通过开关大棚侧窗和顶窗控制棚内温度和湿度，日出后30分钟内打开大棚侧窗和顶窗通风散气，日落前30分钟关闭大棚侧窗和顶窗保温，下雨时及时关闭大棚避雨。

(4)第一轮种苗扩繁

7月25，将上述脱毒原种草莓穴盘苗定植于大棚内(大棚侧窗、顶窗和门都设有防虫网，避免迁飞害虫进入)高架基质槽内，相邻两个草莓栽培槽间距1.13米；草莓栽培槽槽口距地面1000-1200mm(排水坡度)；草莓栽培槽内填充栽培基质，所述栽培基质由草炭(纤维长度20-40mm)和珍珠岩(粒径3mm)按体积比7:3混合而成，通过滴灌向植株供给营养液，定植后至10月15日采用繁殖专用肥水配方，10月15日至11月23日采用壮苗专用肥水配方，营养液的EC值控制在0.8-1.1dS m-1，PH值控制在5.6-6.0，供给量为200-300毫升/株·天，阴雨天营养液的供给量减半或暂停。11月23日，一次性剪下匍匐茎上的子扦插，每母株繁殖获得扦插苗70株。具体步骤如下：

A修剪，将采收的子苗(至少带6根气生根)老叶打除仅保留1-2片叶，所剪取的每株子苗基部保留一根50～70mm长的匍匐茎；把子苗按重量分大、中、小三类，分类扦插便于管理。

C扦插，将修剪后的子苗插入装有栽培基质的穴盘(50孔，穴孔深70mm)内，每穴扦插1株，扦插深度以气生根刚好没入栽培基质为准，且将保留的匍匐茎插入穴盘内的栽培基质起固定作用；穴盘内的栽培基质与步骤(3)中所述的栽培基质相同，扦插前将栽培基质浇透水一次；

B植株管理，将插有子苗的穴盘置于平整的大棚内地面上，并在子苗上覆盖一层透明无色塑料薄膜，塑料薄膜四周压在穴盘下面将穴盘封闭，使子苗处于一个封闭的环境下保持湿度；在穴盘上方搭拱棚，拱棚上覆盖2层遮光率为80％的遮阳网，在扦插后第7-8天，子苗新生根系已进入栽培基质30～70mm时揭开塑料薄膜，3天后(11月6日)揭开拱棚上第一层遮阳网，再过3天(11月9日)揭开拱棚上第二层遮阳网；从扦插至揭开薄膜期间不浇水，之后适时浇水保持穴盘内栽培基质含水量为45～50％质量分数，扦插20天(11月23日)后，每周施肥一次，用壮苗专用肥水配方肥水(EC值为1.5)，每株浇30～40毫升；扦插后第40-45天，穴盘孔内的栽培基质外壁布满扦插苗新生根,即为草莓脱毒穴盘苗。

通过开关大棚侧窗和顶窗控制棚内温度和湿度。对于种苗繁育大棚，日出后30分钟内打开大棚侧窗和顶窗通风散气，日落前30分钟关闭大棚侧窗和顶窗保温；对于扦插育苗大棚，早上日出后待棚内温度(植株叶片周围)上升至30℃以上时，逐步打开侧窗和顶窗(一般在10:30至11:30之间)通风散湿，日落前1小时30分(一般16:30)关闭大棚侧窗和顶窗保温。繁殖和扦插育苗大棚侧模、顶膜和门都设有防虫网，避免虫害进入。期间不断打除母株和子苗上萌发的花序、老叶和多余的侧芽，减少植株不必要的营养消耗,按常规栽培技术对植株进行病虫害防治，其中白粉病和红蜘蛛防治药剂7-10天喷雾一次。

(5)第二轮种苗扩繁

采用塑料圆筒营养钵(口径内250毫米，高250毫米)为母株定植容器，里面填充步骤B所述栽培基质，填充至钵口下30～40mm为宜。

2020年2月24日，将步骤(4)生产的脱毒穴盘苗定植于营养钵内作为母株营养繁殖子苗，每钵2株，定植后浇透水一次，置于大棚内生长，大棚侧窗、顶窗和门都设有防虫网，避免虫害进入；通过滴灌向植株供给营养液，采用繁殖专用肥水配方，营养液的EC值控制在0.8～1.1S cm-1，PH值控制在5.6～6.0。

上述步骤(5)中定植于营养钵的母株于2020年3月8日开始发生匍匐茎。匍匐茎的双数节产生子苗，当子苗萌发10-30毫米长根系3条以上时，将子苗(用专用塑料叉)固定在小营养钵(塑料圆柱体，口径80毫米，高80毫米)内生根，一钵一苗。

营养钵内填充步骤(1)所述栽培基质，并在固定子苗前让基质浸透水。以10天为间隔，在新准备的小营养钵内固定新生的子苗，同时给上一批固定的子苗浇一次清水。子苗固定20天后，根系基本包裹住营养钵内基质，已达到采收标准。通过开关大棚侧窗和顶窗控制棚内温度和湿度。3月15前，早上日出后待棚内温度(植株叶片周围)上升至30℃以上时，逐步打开侧窗和顶窗(一般在10:30至11:30之间)通风散湿，日落前1小时30分(一般16:30)关闭大棚侧窗和顶窗保温；3月15后，日出后30分钟内打开大棚侧窗和顶窗通风散气，日落前30分钟关闭大棚侧窗和顶窗保温。期间不断打除母株和子苗上萌发的花序、老叶和多余的侧芽，按常规栽培技术对植株进行病虫害防治，其中白粉病和红蜘蛛防治药剂7-10天喷雾一次。

(6)第三轮种苗扩繁

2020年6月28日，采收步骤(5)(第二轮繁殖)繁殖生根良好的营养钵子苗作为母株定植，重复步骤(4)(第一轮繁殖)繁殖子苗，正常养护至11月26日，一次性采收按步骤(4)的方法扦插盒养护子苗，每母株可繁殖子苗70株。

扦插成活后至次年定植(次年2-3月)前，尽量打开大棚侧窗和顶窗，让植株接受冬季自然低温的刺激，有利于提高来年植株长势和匍匐茎的萌发量，期间不断打除植株上萌发的花序，减少植株不必要的营养消耗。

实施例2-3，

实施例2和实施例3与实施例1除表1所列措施不同外，其余措施与实施例1相同，不再赘述。

表1：实施例2、实施例3与实施例1的区别

表2：闷棚热处理及人工补光对促进子苗繁殖和提高茎尖培养和脱毒效率的效果

处理方式	匍匐茎数	匍匐茎茎尖数	茎尖花芽分化率(％)	脱毒率(％)
					常规技术	4.6	5.6	43	70.45
本发明技术	6.3	8.9	2	88.63

注：田间调查时间为2019年4月28日和2020年4月26日，调查对象包括品种‘章姬’和品种‘妙香7号’10株，表格数据为2年2品种的平均值。

茎尖花芽分化率是根据品种‘章姬’2019年和2020年各50个茎尖的解剖观察平均数据，茎尖大小如图1所示。

脱毒效率根据2019年和2020年‘章姬’分别检测43株和45株的平均结果。

常规技术的数据来自同一基地内未进行闷棚和补光处理的对照大棚内植株。

表3：组培阶段培养效率比较研究

注：常规技术的数据来自本技术研发过程中的对照处理，细胞分裂素添加浓度为BA 0.6mg/L。

表4种苗扩繁茬口安排和扩繁效率的比较

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法，其特征在于：包含以下步骤：

S2，在3-4月，白天通过闷棚积累太阳热能，控制大棚内温度在36-40摄氏度，催生草莓植株的匍匐茎至5-8条，使得部分匍匐茎分叉产生2个以上茎尖；在棚内按20只/667 m²的密度在植株顶上1.5米高处安装100 W 白炽灯，日落后打开白炽灯补光直至23:00止；

S3，采集步骤S2中繁殖的匍匐茎茎尖作为外植体在超净工作台内消毒，在体视显微镜下剥取消毒后的外植体生长点，放入起始培养基内暗培养7天，温度25℃；起始培养基为MS+GA 0.5 mg/L +蔗糖30000 mg/L+琼脂6000 mg/L，pH为5.8～6.0；

S4，将暗培养7天后的外植体，转移至一次成苗培养基上培养40-45d，得生根苗；一次成苗培养基为MS+IBA 0.2～0.3mg/L +蔗糖30000 mg/L+琼脂6000 mg/L，pH为5.8～6.0；

S5，取生根苗进行检测，无毒植株进行原种苗炼苗：6月中旬，将无毒的生根幼苗移植至128孔穴盘内，穴盘内填充草炭和珍珠岩按体积8：2混合的栽培基质，浇足定根水后养护于塑料大棚内；在生根幼苗上覆盖一层透明无色塑料薄膜，塑料薄膜四周压在穴盘底部，使生根幼苗处于封闭的环境下保持湿度；在穴盘上方搭拱棚，拱棚上覆盖2层遮光率为80%的遮阳网，定植后第3-4天，生根幼苗新生根系已进入栽培基质30～50 mm时揭开所述塑料薄膜，3天后揭开拱棚上第一层遮阳网，再过3天后揭开拱棚上第二层遮阳网；从定植至揭开薄膜期间不浇水，之后适时浇水保持穴盘内栽培基质含水量为45～50%质量分数；定植后第10天和第20天，用繁殖专用肥水配方给幼苗施肥，肥水EC值为1.5mS·cm^-1，每株浇8～10毫升，定植后第40-45天，穴盘孔内的栽培基质外壁布满新生根，即获得脱毒原种草莓穴盘苗；壮苗专用肥水配方各元素质量比为N :P :K :Ca: Mg: Fe :Mn :Cu :Zn :B :Mo = 100 :50 :130 :80 :24 :2.5 :0.5 :0.02 :0.05 :0.5 :0.01，其中硝态氮和铵态氮的分子数量比例为90:10；

S6，第一轮扩繁：7月下旬，将上述脱毒原种草莓穴盘苗定植于大棚内高架基质槽内，相邻两个草莓栽培槽间距1.1～1.2米；草莓栽培槽槽口距地面1000-1200 mm；草莓栽培槽内填充栽培基质，所述栽培基质由草炭和珍珠岩按体积比7:3混合而成，或者栽培基质由椰糠和珍珠岩按体积比7:3混合而成；通过滴灌向植株供给营养液，定植后至10月中旬采用繁殖专用肥水配方，10月下旬至子苗采收前采用上述壮苗专用肥水配方，营养液的EC值控制在0.8-1.1mS·cm^-1，pH值控制在5.6-6.0，供给量为200-300毫升/株•天，阴雨天营养液的供给量减半或暂停；与上述壮苗专用肥水配方相比，繁殖专用肥水配方降低了磷肥和钾肥的比例，各元素重量比为N :P :K :Ca: Mg: Fe :Mn :Cu :Zn :B :Mo = 100 :25 :110 :80 :24 :2.5 :0.5 :0.02 :0.05 :0.5 :0.01，其中硝态氮和铵态氮的分子数量比例为85:15；正常养护至11月底，一次性剪下匍匐茎上的子苗扦插，扦插后45-50天成苗，每母株可繁殖并获得扦插苗57-70株；扦插具体步骤如下：

a修剪，剪断匍匐茎采收子苗，使子苗其至少带6根气生根，打除老叶仅保留1-2片叶，所剪取的每株子苗基部保留一根50～70 mm长的匍匐茎；把子苗按重量分大、中、小三类，分类扦插便于管理；

c植株管理，将插有子苗的穴盘置于平整的大棚内地面上或苗床上，并在子苗上覆盖一层透明无色塑料薄膜，塑料薄膜四周压在穴盘下面将穴盘封闭，使子苗处于一个封闭的环境下保持湿度；在穴盘上方搭拱棚，拱棚上覆盖2层遮光率为80%的遮阳网，在扦插后第7-8天，子苗新生根系已进入栽培基质30～70 mm时揭开所述塑料薄膜，3天后揭开拱棚上第一层遮阳网，再过3天揭开拱棚上第二层遮阳网；从扦插至揭开薄膜期间不浇水，之后适时浇水保持穴盘内栽培基质含水量为45～50%质量分数，扦插20天后，每周施肥一次，用壮苗专用肥水配方，营养液的EC值控制在0.8-1.1mS·cm^-1，每株浇30～40毫升；扦插后第40-45天，穴盘孔内的栽培基质外壁布满扦插苗新生根，即为草莓脱毒穴盘苗；

S7，第二轮扩繁：采用塑料圆筒营养钵为母株定植容器，里面填充步骤S5所述栽培基质，填充至钵口下30～40 mm为宜；次年2月底，将S6步骤生产的脱毒穴盘苗定植于营养钵内作为母株营养繁殖子苗，每钵2株，定植后浇透水一次，置于大棚内生长，大棚侧窗、顶窗和门都设有防虫网，避免迁飞害虫进入；通过滴灌向植株供给营养液，采用繁殖专用肥水配方，营养液的EC值控制在0.8～1.1 mS·cm^-1，pH值控制在5.6～6.0；

扦插成活后至下年定植前，打开大棚侧窗和顶窗，让植株接受冬季自然低温的刺激，有利于提高来年植株长势和匍匐茎的萌发量，期间不断打除植株上萌发的花序，减少植株不必要的营养消耗。

2. 根据权利要求1所述的一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法，其特征在于：所述S3步骤中，外植体的消毒方法为：超净工作台内消毒，用75％（v/v）的酒精表面消毒60 s；然后无菌水清洗3次，再于混合消毒液中消毒8～10 min，再用无菌水冲洗3次；混合液为每100 ml质量浓度为1％的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温-20。

3. 根据权利要求1所述的一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法，其特征在于：所述S4步骤中，使用LED组合光源光照条件进行一次成苗培养，所述LED组合光源光照条件为：LED红光：LED蓝光：LED白光：LED远红光的光照强度比=5:1:2:2，LED组合光源下25厘米的位置的光照强度为53～55 µmol•m^-2•s^-1，光照时间为16小时/天，光照阶段培养温度控制在25℃±2℃，无光阶段培养温度控制在20℃±2℃。

4.根据权利要求1所述的一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法，其特征在于：所述S5步骤中，原种苗炼苗时，除下雨外，保持大棚侧窗和顶窗开放便于通风散气，下雨时关闭大棚避免植株淋雨。

5.根据权利要求1所述的一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法，其特征在于：所述S6步骤中，扦插前种苗繁育大棚，日出后30分钟内打开大棚侧窗和顶窗通风散气，日落前30分钟关闭大棚侧窗和顶窗保温；扦插后的扦插大棚内早上日出后待棚内植株叶片周围温度上升至30℃以上时，逐步打开侧窗和顶窗，日落前1小时30分关闭大棚侧窗和顶窗保温，期间不断打除母株和子苗上萌发的花序、老叶和多余的侧芽，减少植株不必要的营养消耗，按常规栽培技术对植株进行病虫害防治，其中白粉病和红蜘蛛防治药剂7-10天喷雾一次。