CN101999318B - 一种枫杨组织培养繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枫杨组织培养繁殖方法，其采用枫杨优良单株根部萌条为外植体，经消毒后接种在含有启动培养基的培养瓶中，以普通日光灯为光源，每日照光16小时，温度22～25℃、湿度为50％～65％，培养45天，分化长成试管芽苗，然后经剪切，转接于含有增殖培养基的培养瓶中，进行增殖培养，不断增殖，再剪切后接种于含有壮苗培养基的培养瓶中，进行壮苗培养，25天后去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3～4片叶片，接种于含有生根处理产生根原基培养基的培养瓶中，进行生根培养6～10天，清洗后移栽到含有泥炭和黄心土的体积比为3∶2的基质中，20天后生根成活。本发明所述的枫杨生根率达89％以上，且种苗质量好。

Description

一种枫杨组织培养繁殖方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养繁殖方法，具体地说，是涉及一种枫杨的组织培养繁殖方法。
背景技术
枫杨是我国长江中下游地区广泛分布的一种重要乡土树种，其为胡桃科落叶乔木，树枝具有片状髓，裸芽外部有褐色毛，下部生有无柄的潜芽，具有羽状复叶，叶的边缘具有细锯齿，其果实为近球形，具两长圆形或长圆状披针形的果翅，长2厘米至3厘米，花期4月至5月，果熟期8月至9月，枫杨喜光，喜温暖湿润的气候，也较耐寒，对土壤要求不严，根深且主根明显、侧根发达，萌蘖性强，其木材色浅、质轻、少翘裂、易于加工，可供家具、农具、胶合板、纤维板、火柴盒、造纸等用材，同时，枫杨还是长江中下游地区江河滩地兴林灭螺及综合开发的主要造林树种之一，还广泛栽植作园庭树或行道树。
传统的枫杨采用种子播种繁殖、扦插、压条繁殖，而上述方法中的种子播种繁殖速度非常慢，而由于枫杨生长期有“伤流”，扦插、压条的繁殖方式使得成活率很低，且获得的种苗质量参差不齐，由于选育的优良种质资源少，传统方法很难在短期内获得大量优质种苗。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种方法简单、繁殖速度快、种苗质量好的枫杨组织培养繁殖方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种枫杨组织培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)选材及消毒处理：采用经选育的枫杨优良单株根部萌发的10～20厘米长萌条茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％酒精消毒45秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒8～10分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％，培养45天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，对芽苗进行增殖培养，使其不断增殖，直至达到所需要的繁殖生产规模，如可达2000～3000瓶时进入下一步骤；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养6～10天；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为：3∶2，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先遮光培养10天，后逐渐见光，20天后生根成活，在培养40～45天后，进行全光照；
其中，所述的启动培养基为：每升基本培养基+0.05～0.2mg N-苯基-N′-(2-氯-4-吡啶基)脲(4PU-30)+0.75～1.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.02～0.1mg吲哚丁酸(IBA)；
所述的增殖培养基为：每升基本培养基+0.2～0.5mg噻苯隆(TDZ)+1.2～2.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.04～0.1mg吲哚丁酸(IBA)+1000～2000mg活性炭(Charcoal)；
所述的壮苗培养基为：每升基本培养基+0.1～0.4mg噻苯隆(TDZ)+1.0～1.5mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.08～0.2mg吲哚丁酸(IBA)+1000～2000mg活性炭(Charcoal)；
所述的生根处理产生根原基培养基为：每升基本培养基+0.3～0.6mgα-萘乙酸(NAA)+0.5～0.8mg吲哚丁酸(IBA)+2000～3000mg活性炭(Charcoal)。
进一步，所述的基本培养基包括常量元素、微量元素、铁盐和有机成分。
其中，常量元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾(KNO3)                950～1900mg/L；
硝酸铵(NH4NO3)              412.5～825mg/L；
磷酸二氢钾(KH2PO4)          170～255mg/L；
硫酸镁(MgSO4·7H2O)         370～462.5mg/L；
氯化钙(CaCl2·2H2O)         440～550mg/L。
微量元素的组分和其对应的浓度如下：
碘化钾(KI)               0.83mg/L；
硼酸(H3BO3)              6.2mg/L；
硫酸锰(MnSO4·4H2O)      22.3mg/L；
硫酸锌(ZnSO4·7H2O)      8.6mg/L；
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)    0.25mg/L；
硫酸铜(CuSO4·5H2O)      0.025mg/L；
氯化钴(CoCl2·6H2O)      0.025mg/L。
铁盐的组分和其对应的浓度如下：
乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)      37.3mg/L；
硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)             27.8mg/L。
有机成分的组分和其对应的浓度如下：
肌醇           100mg/L；
甘氨酸               2mg/L；
盐酸硫胺素(VB1)      0.1mg/L；
盐酸吡哆醇(VB6)      0.5mg/L；
烟酸(VPP)            0.5mg/L；
蔗糖(sucrose)        30g/L；
琼脂(agar)           5.5g/L。
本发明的有益效果是：本发明通过组织培养的方法来进行枫杨种苗的培养，只需要通过选育一个优良的品种，即可进行，且能够保持原植株的优良性状，繁殖速度非常快，能在短期内生产出大量的优质种苗，大大提高了繁殖的效率，满足各种需求，同时，利用本发明所述的生产方法，种苗的成活率高，种苗质量好。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，详细说明本发明的具体实施方式：
实施例1
基本培养基的配置：
其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：
硝酸钾(KNO3)950mg/L、硝酸铵(NH4NO3)412.5mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)440mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)27.8mg/L。
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L、蔗糖(sucrose)30g/L、琼脂(agar)5.5g/L。
利用上述的基本培养基配置启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根处理产生根原基培养基。
其中，启动培养基：每升基本培养基+0.1mg N-苯基-N′-(2-氯-4-吡啶基)脲(4PU-30)+0.75mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.02mg吲哚丁酸(IBA)；
增殖培养基：每升基本培养基+0.2mg噻苯隆(TDZ)+1.2mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.04mg吲哚丁酸(IBA)+1000mg活性炭(Charcoal)；
壮苗培养基：每升基本培养基+0.1mg噻苯隆(TDZ)+1.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.08mg吲哚丁酸(IBA)+1000mg活性炭(Charcoal)；
生根处理产生根原基培养基：每升基本培养基+0.3mgα-萘乙酸(NAA)+0.8mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)。
将上述的配置好的启动培养基注入培养瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM2。
枫杨组织培养繁殖步骤如下：
(1)选材及消毒处理：采用经选育的枫杨优良单株根部萌发的10～20厘米长萌条茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％酒精消毒45秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒8～10分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％，培养45天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，对芽苗进行增殖培养，使其不断增殖，一个周期25天的繁殖倍数为3.85，生长高度达3.2cm，直至达到所需要的繁殖生产规模，如可达2000～3000瓶时进入下一步骤；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养6～10天；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为：3∶2，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先遮光培养10天，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达89.8％，在培养40～45天后，进行全光照，可实现枫杨的工厂化生产。
实施例2：
基本培养基的配置：
其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：
硝酸钾(KNO3)1900mg/L、硝酸铵(NH4NO3)825mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)255mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)462.5mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)550mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)27.8mg/L。
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L、蔗糖(sucrose)30g/L、琼脂(agar)5.5g/L。
利用上述的基本培养基配置启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根处理产生根原基培养基。
其中，启动培养基：每升基本培养基+0.2mg N-苯基-N′-(2-氯-4-吡啶基)脲(4PU-30)+1.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.1mg吲哚丁酸(IBA)；
增殖培养基：每升基本培养基+0.5mg噻苯隆(TDZ)+2.0mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.1mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)；
壮苗培养基：每升基本培养基+0.4mg噻苯隆(TDZ)+1.5mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.2mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)；
生根处理产生根原基培养基：每升基本培养基+0.6mgα-萘乙酸(NAA)+0.5mg吲哚丁酸(IBA)+2000mg活性炭(Charcoal)。
将上述的配置好的启动培养基注入培养瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM2。
枫杨组织培养繁殖步骤如下：
(1)选材及消毒处理：采用经选育的枫杨优良单株根部萌发的10～20厘米长萌条茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％酒精消毒45秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒8～10分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％，培养45天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，对芽苗进行增殖培养，使其不断增殖，一个周期25天的繁殖倍数为3.85，生长高度达3.2cm，直至达到所需要的繁殖生产规模，如可达2000～3000瓶时进入下一步骤；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养6～10天；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为：3∶2，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先遮光培养10天，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达92.5％，在培养40～45天后，进行全光照，可实现枫杨的工厂化生产。
实施例3：
基本培养基的配置：
其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：
硝酸钾(KNO3)1450mg/L、硝酸铵(NH4NO3)612mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)210mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)418.5mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)495mg/L；
微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L；
铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)37.3mg/L、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)27.8mg/L。
有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、烟酸(VPP)0.5mg/L、蔗糖(sucrose)30g/L、琼脂(agar)5.5g/L。
利用上述的基本培养基配置启动培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根处理产生根原基培养基。
其中，启动培养基：每升基本培养基+0.05mg N-苯基-N′-(2-氯-4-吡啶基)脲(4PU-30)+0.88mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.06mg吲哚丁酸(IBA)；
增殖培养基：每升基本培养基+0.3mg噻苯隆(TDZ)+1.7mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.07mg吲哚丁酸(IBA)+1500mg活性炭(Charcoal)；
壮苗培养基：每升基本培养基+0.25mg噻苯隆(TDZ)+1.3mg 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.15mg吲哚丁酸(IBA)+1500mg活性炭(Charcoal)；
生根处理产生根原基培养基：每升基本培养基+0.45mgα-萘乙酸(NAA)+0.65mg吲哚丁酸(IBA)+2500mg活性炭(Charcoal)。
将上述的配置好的启动培养基注入培养瓶中，经高温高压消毒20分钟，待用，其中，温度为120-125℃，压力为1.1KG/CM2。
枫杨组织培养繁殖步骤如下：
(1)选材及消毒处理：采用经选育的枫杨优良单株根部萌发的10～20厘米长萌条茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％酒精消毒45秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒8～10分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％，培养45天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，对芽苗进行增殖培养，使其不断增殖，一个周期25天的繁殖倍数为3.85，生长高度达3.2cm，直至达到所需要的繁殖生产规模，如可达2000～3000瓶时进入下一步骤；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养6～10天；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为：3∶2，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先遮光培养10天，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达90.2％，在培养40～45天后，进行全光照，可实现枫杨的工厂化生产。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种枫杨组织培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)选材及消毒处理：采用经选育的枫杨优良单株根部萌发的10～20厘米长萌条茎段为外植体，然后将选取的外植体剪切成2～4cm长的小段，经70％酒精消毒45秒，再用浓度为0.1％的升汞溶液消毒8～10分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；
(2)试管芽苗培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤(1)中消毒后的外植体剪去接触消毒液的伤口，留1～2cm带芽茎段接种在经消毒的含有启动培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％，培养45天，分化长成试管芽苗；
(3)增殖培养：将从步骤(2)中长成的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于经消毒的含有增殖培养基的培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，对芽苗进行增殖培养，使其不断增殖，直至达到所需要的繁殖生产规模；
(4)壮苗培养：将步骤(3)中增殖后的试管芽苗，剪切带有1～2个腋芽的节段或顶芽后，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有壮苗培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行壮苗培养，25天后进入下一步骤；
(5)生根培养：将步骤(4)中经过壮苗培养后的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3～4片叶片，在超净的工作台上及无菌条件下，接种于经消毒的含有生根处理产生根原基培养基的培养瓶中，在光照强度为1000～1500lx，每日光照时间为16小时，温度为22～25℃，湿度为50％～65％的条件下，进行生根培养6～10天；
(6)移栽、成活：将步骤(5)中经生根培养的带有根原基的无根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为：3∶2，然后浇透水，保持温度25～30℃，相对湿度85％以上，先遮光培养10天，后逐渐见光，20天后生根成活，在培养40～45天后，进行全光照；
所述的启动培养基为：每升基本培养基+0.05～0.2mg N-苯基-N′-(2-氯-4-吡啶基)脲+0.75～1.0mg 6-苄基嘌呤+0.02～0.1mg吲哚丁酸；
所述的增殖培养基为：每升基本培养基+0.2～0.5mg噻苯隆+1.2～2.0mg 6-苄基嘌呤+0.04～0.1mg吲哚丁酸+1000～2000mg活性炭；
所述的壮苗培养基为：每升基本培养基+0.1～0.4mg噻苯隆+1.0～1.5mg6-苄基嘌呤+0.08～0.2mg吲哚丁酸+1000～2000mg活性炭；
所述的生根处理产生根原基培养基为：每升基本培养基+0.3～0.6mgα-萘乙酸+0.5～0.8mg吲哚丁酸+2000～3000mg活性炭，
所述的基本培养基包括常量元素、微量元素、铁盐和有机成分，
而所述的常量元素的组分和其对应的浓度如下：
硝酸钾      950～1900mg/L；
硝酸铵      412.5～825mg/L；
磷酸二氢钾  170～255mg/L；
硫酸镁      370～462.5mg/L；
氯化钙      440～550mg/L；
微量元素的组分和其对应的浓度如下：
碘化钾    0.83mg/L；
硼酸      6.2mg/L；
硫酸锰    22.3mg/L；
硫酸锌    8.6mg/L；
钼酸钠    0.25mg/L；
硫酸铜    0.025mg/L；
氯化钴    0.025mg/L；
铁盐的组分和其对应的浓度如下：
乙二胺四乙酸二钠    37.3mg/L；
硫酸亚铁            27.8mg/L；
有机成分的组分和其对应的浓度如下：
肌醇            100mg/L；
甘氨酸          2mg/L；
盐酸硫胺素      0.1mg/L；
盐酸吡哆醇      0.5mg/L；
烟酸            0.5mg/L；
蔗糖            30g/L；
琼脂            5.5g/L。
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