CN111903528B

CN111903528B - 一种药桑冬芽组织培养再生快速繁殖方法

Info

Publication number: CN111903528B
Application number: CN202010951086.1A
Authority: CN
Inventors: 莫荣利; 李勇; 于翠; 董朝霞; 朱志贤; 邓文; 胡兴明
Original assignee: Institute of Economic Crop of Hubei Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Economic Crop of Hubei Academy of Agricultural Science
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: CN111903528A

Abstract

本发明属于植物组培技术领域，公开了一种药桑冬芽组织培养再生快速繁殖方法。本发明以药桑冬芽为外植体，采用DKW为基本培养基，添加ZT和IBA为主要的植物激素，建立了药桑冬芽离体再生快速繁殖技术，药桑冬芽初代培养愈伤组织形成率为为100%，接种35 d后增殖系数可达到6.8~7.3，丛生芽再生率为86.7%~93.3%。不定根再生率可达92%~96.5%，平均不定根数为4.6；利用本发明的方法，药桑培养时间显著缩短，同时获得的不定根无菌苗根系发达，无需在组培室中炼苗驯苗，缓苗期短，移栽后存活率高，适合大规模的推广。

Description

一种药桑冬芽组织培养再生快速繁殖方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种药桑冬芽组织培养再生快速繁殖方法。

背景技术

植物分类学上，药桑属蔷薇目(Rosales)桑科(Moraceae)桑属(Morus)黑桑种(Morus nigra L.)。按着最新的桑树染色体基数研究结果，药桑是显花植物中染色体倍性最高的天然多倍体植株，染色体倍数为二十二倍体(2n＝22x＝308)(Jiao et al.,2020)。药桑原产于伊朗，16世纪引入中国新疆南部地区，药桑的果和叶均具有较高的营养与药用价值，维吾尔族人习惯用药桑的果实治疗扁桃腺炎和喉咙肿痛等炎症以及贫血症等(马延萍，2002；Jiang et al.,2015)。随着药桑生物活性成分及药理作用等相关研究工作的开展(买买提依明等2005，2006)，药桑的药食用功能开发利用已展现出极大的市场潜力，药桑原材料供不应求的矛盾日趋严峻。

新疆南部地区，药桑通常采用芽接和套接法繁殖，但嫁接亲和力弱，成活率较低(买买提依明，2007)；且药桑对生长环境十分苛求，异地引种的成活率极低(曾其伟等2013)，即使嫁接成活，嫁接口表现出“大头小脚”的不亲和现象(李镇刚等2018)。扦插是桑树常用的无性繁殖方法之一，扦插繁殖的桑苗能够保持母株的优良特性且具有操作简便易行、省时省力、设备简单、育苗周期较短等特点(裘晓云等2015)，而采用普通的扦插方法繁殖药桑其生根率非常低(吴曙光等2011)；即使采用专利技术(程嘉翎等2010)对含冬芽的药桑枝条进行扦插试验，其扦插生根率仅15％左右，因此即使是在新疆地区大规模栽培药桑也很少见(阿地力·依克木等2012)。近几年，国内学者开始对适合药桑的离体组培再生繁殖技术进行研究。王茜龄等(2012)、丁天龙等(2013)、曾其伟等(2016)和李镇刚等(2018)以MS为基本培养基，以6-BA和NAA为主要增殖激素，初步建立了药桑冬芽离体组培再生繁殖体系，获得的药桑组培苗在重庆地区和曲靖地区移栽成活，但是冬芽初代培养再生率、继代增殖系数和根系诱导率低。魏佳等(2015)以药桑无菌组培苗为试材，进一步优化继代增殖培养基和根诱导培养基，增值系数最高达到6.8，生根率可达95％，但继代增殖时间和诱导生根时间长，通常为45d，还存在根系变少、叶片变黄等问题。

发明内容

本发明的内容在于提供一种药桑冬芽组织培养再生快速繁殖方法，本方法是以药桑冬芽为材料，进行离体组培繁殖，可以在较短时间内，组培繁殖获得大量的无性种苗，该方法高繁殖率、方便、快捷、低成本、适宜大面积推广，为其产业化生产提供了可能。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种药桑冬芽组织培养再生快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)外植体消毒：取药桑一年生枝的冬芽，取样时间为秋季落叶后到翌年春季萌芽前，消毒；

2)初代培养：芽体消毒后，轻轻剥去外层包被鳞片直至露出绿色真叶，至芽体0.3cm～0.5cm大小，置于初代培养基上进行诱导培养，初代培养基配方为：DKW+2.0～5.0mg/L ZT+0.25～1.0mg/L IBA+28～30g/L蔗糖+6.5～7.5g/L琼脂+1.0～4.0g/L PVP-K30，pH值调至5.8～6.0，其余为水；1500～2500lux光照强度下，每天14～16h的光照培养，培养温度24～26℃；培养25-30d转入继代培养基中；

(3)继代培养：将初代培养获得的无菌苗转入继代培养基中进行增殖扩繁；

继代培养基为D4或D9；

D4配方：DKW+1.0～4.0mg/L 6-BA+1.0～4.0mg/L ZT+0.25～0.75mg/L IBA+28～30g/L蔗糖+6.5～7.5g/L琼脂+1.0～4.0g/L PVP-K30，pH值调至5.8～6.0，其余为水；

D9配方：DKW+2.0～5.0mg/L ZT+0.25～1.5mg/L TDZ+0.25～1.0mg/L IBA+28～30g/L蔗糖+6.5～7.5g/L琼脂+1.0～4.0g/L PVP-K30，pH值调至5.8～6.0，其余为水；

1500～2500lux光照强度下，每天14～16h的光照培养，培养温度24～26℃；培养30-35d，切成1～2cm的茎段(含2～3个腋芽)置于继代培养中继续扩繁增殖；或者培养20-25d直接接种至生根培养基中；

4)生根培养：将无菌苗接种至生根培养基中进行生根培养；

生根培养基为R2或R2；

R2配方：1/2DKW+0.25～1.5mg/L IBA+28～30g/L蔗糖+6.5～7.5g/L琼脂+1.0～4.0g/L PVP-K30，pH值调至5.8～6.0，其余为水；

R3配方：1/2DKW+1.0～3.5mg/L IBA+28～30g/L蔗糖+6.5～7.5g/L琼脂+1.0～4.0g/L PVP-K30，pH值调至5.8～6.0，其余为水；

光照培养20～30d，1500～2500lux光照强度下，每天14～16h的光照培养，培养温度24～26℃，形成白色不定根；

5)炼苗、移栽：将经生根诱导培养再生不定根的完整植株，按照本领域的常规方式进行炼苗，移栽。

以上所述的方法中，优选的，是将生根诱导培养基中的无菌苗连同培养瓶置于塑料薄膜温室大棚中闭盖炼苗2～3d，然后将松盖炼苗2～3d(将组培瓶盖拧开轻置于瓶口)，去盖炼苗1～2d，棚内温度25～35℃，将琼脂用自来水彻底冲洗干净，然后栽植于装有腐殖质土、草炭、蛭石、珍珠岩(4种基质的体积比为3～5:1～3:1～3:1～3)的花盆中，采用干土栽植稍微压实，浇透水后用透明塑料杯倒扣保湿(塑料杯底部扎孔透气)，5～7d后去掉塑料杯让其正常生长。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明以药桑冬芽为外植体，采用不同于现有技术的培养基配方(以MS为基本培养基，添加6-BA和NAA为主要的植物激素)，采用DKW为基本培养基，添加ZT和IBA为主要的植物激素，建立了药桑冬芽离体再生快速繁殖技术。

药桑冬芽初代培养愈伤组织形成率为为100％，且冬芽容易萌发、展叶抽生新梢，再生率为96％，接种30d后增殖系数为3.16，且后期的继代增殖培养中，茎基部愈伤组织形成率为100％，腋芽萌发及丛生芽形成较多。接种35d后增殖系数可达到6.8～7.3，丛生芽再生率为86.7％～93.3％。继代培养基培养后的无菌苗置于生根培养基，培养15d后便可见不定根的形成，25d后统计不定根再生率可达92％～96.5％，平均不定根数为4.6；后便可进入炼苗、驯化、移栽等过程，移栽成活率为96％。较现有技术相比，从初代培养、继代增殖培养及生根培养的整个过程，与现有技术相比，时间显著缩短。

本发明操作简单，繁殖率高，生产成本低，繁殖周期短，适宜于工厂生产应用。以一棵完整的药桑组培苗为例进行增殖培养，35d为一个继代周期，增殖系数以7.3计算，一年中可扩繁的苗数见下表。

天数(d)	35	70	105	140	175	210	245	280
									苗数(棵)	7.3	53	389	2839	20724	151285	1104380	8061974

利用本发明制备的药桑不定根无菌苗，无需在组培室炼苗，可直接置于环境更为恶劣的温室大棚进行，缓苗时间短，移栽存活率为95％以上。

附图说明

图1为利用本发明的方法制备的不定根无菌苗的根系示意图；

其中，左图为利用实施例1的方法制备的不定根无菌苗；右图为利用实施例2的方法制备的不定根无菌苗。

具体实施方式

本发明实施例所使用的试剂，如未特别说明，市售的均为实现本发明。所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。本发明实施例所用的药桑拉丁文是Morusnigra L.

实施例1：

一种药桑冬芽组织培养再生快速繁殖方法，其步骤如下：

1)外植体消毒：秋季落叶后至翌年春季发芽前期间，取药桑1年生枝上的芽即冬芽。将芽体表面刷洗干净，再于流水下冲洗30～60min，晾干至芽体表面没有水渍，无菌条件下，将晾干的冬芽置于灭过菌的广口瓶中，用75％(体积比)的酒精溶液浸泡30s，期间不断摇晃，倒掉酒精，再用1.0g/L的升汞溶液浸泡消毒8～10min，消毒期间不断摇晃广口瓶以保证消毒过程的均匀彻底。然后取出芽体置于另一灭过菌的广口瓶中用无菌水清洗6-8遍，得到待接种材料；

2)初代培养：芽体消毒后，轻轻剥去外层包被鳞片直至露出绿色真叶，至芽体0.3cm～0.5cm大小，置于初代培养基上进行诱导培养，初代培养基配方为：DKW+4.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+3g/L PVP-K30，pH值调至6.0，其余为水。1500～2500lux光照强度下，每天16h的光照培养，培养温度24～26℃，培养30d后转入继代培养基中。

冬芽基部愈伤组织诱导率计算方式：愈伤组织诱导率＝(形成愈伤组织的外植体数目/总外植体数目)×100％；

冬芽萌发再生率计算方式：再生率＝(萌发抽梢的外植体数目/总外植体数目)×100％。

培养30d后统计结果显示，初代培养基对药桑冬芽愈伤组织的诱导率为100％，且冬芽容易萌发、展叶抽生新梢，再生率分别为96％，接种30d后增殖系数为3.16；

3)继代培养：将初代培养获得的无菌苗转入继代培养基中进行增殖扩繁，继代培养基D9配方：DKW+4.0mg/L ZT+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+3g/LPVP-K30，pH值调至6.0，其余为水。

1500～2500lux光照强度下，每天16h的光照培养，培养温度24～26℃；

一部分无菌苗以继代周期35d进行继代培养扩繁，即将无菌苗切成1～2cm的茎段(含2～3个腋芽)置于继代培养基中继代培养。组培苗基部愈伤组织诱导率为100％，增殖系数可达到7.3，丛生芽再生率为93.3％；

另一部分无菌苗在继代培养基中培养25d后直接接种至生根培养基。

4)生根培养：将培养25d的无菌苗，接种至生根培养基中进行生根培养。

生根培养基配方R2：1/2DKW+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+3g/L PVP-K30，pH值调至6.0，其余为水；光照培养，1500～2500lux光照强度下，每天16h的光照培养，培养温度24～26℃。

培养15d后便可见不定根的形成，25d后统计不定根再生率可达96.5％，平均不定根数为4.6，再生植株叶片绿亮、根系粗壮，须根发生较多(图1)，与现有技术相比(药桑用离体冬芽组织培养和用枝条扦插繁殖的试验，李镇刚等)本发明制备的不定根无菌苗，根部更加粗壮，根系多，更易存活，耐性好。

5)炼苗、移栽：将经过25d生根诱导培养再生不定根的完整植株，连同培养瓶置于塑料薄膜温室大棚中闭盖炼苗2d，然后将松盖炼苗2d(将组培瓶盖拧开轻置于瓶口)，去盖炼苗1d，棚内温度25～35℃，将琼脂用自来水彻底冲洗干净(注意不要损伤根系)，然后栽植于装有腐殖质土、草炭、蛭石、珍珠岩(4种基质的体积比为3:1:1:1)的8cm内径花盆中，采用干土栽植稍微压实，浇透水后用250ml的一次性塑料杯倒扣保湿(塑料杯底部扎孔透气)，7d后去掉塑料杯让其正常生长。移栽后缓苗快，移栽15d后开始抽生新梢，30d后统计移栽成活率为96％。

实施例2：

2)初代培养：芽体消毒后，轻轻剥去外层包被鳞片直至露出绿色真叶，至芽体0.3cm～0.5cm大小，置于初代培养基上进行诱导培养。

初代培养基配方为：DKW+4.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+3g/LPVP-K30，pH值调至6.0，其余为水。1500～2500lux光照强度下，每天16h的光照培养，培养温度24～26℃，培养30d后将无菌苗转入继代培养基中。

30d后统计结果显示该配方培养基对药桑冬芽愈伤组织的诱导率为100％，且冬芽容易萌发、展叶抽生新梢，再生率分别为96％，接种30d后增殖系数为3.16；

3)继代培养：将初代培养获得的无菌苗转入继代培养基中进行增殖扩繁；

继代培养基D4配方：DKW+3.0mg/L 6-BA+3.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+3g/L PVP-K30，pH值调至6.0，其余为水。1500～2500lux光照强度下，每天16h的光照培养，培养温度24～26℃。

一部分无菌苗以继代周期35d进行继代培养扩繁，即将无菌苗切成1～2cm的茎段(含2～3个腋芽)置于继代培养基中继代培养。组培苗基部愈伤组织诱导率为100％，增殖系数可达到6.8，丛生芽再生率为86.7％；

生根培养基配方R3：1/2DKW+2.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+3g/L PVP-K30，pH值调至6.0，其余为水；光照培养，1500～2500lux光照强度下，每天16h的光照培养，培养温度24～26℃。

培养15d后便可见不定根的形成，25d后统计不定根再生率可达92％，平均不定根数为4.0，再生植株叶片绿亮、根系粗壮，须根发生较多。

Claims

1.一种药桑冬芽组织培养再生快速繁殖方法，包括以下步骤：

1）外植体消毒：取药桑一年生枝的冬芽，取样时间为秋季落叶后到翌年春季萌芽前，消毒；

2）初代培养：芽体消毒后，轻轻剥去外层包被鳞片直至露出绿色真叶，至芽体0.3 cm~0.5 cm大小，置于初代培养基上进行诱导培养，初代培养基配方为：DKW+2.0~5.0 mg/L ZT+0.25~1.0 mg/L IBA+28~30 g/L蔗糖+6.5~7.5 g/L琼脂+1.0~4.0 g/L PVP-K30，pH值调至5.8~6.0，其余为水；1500~2500 lux光照强度下，每天14~16 h的光照培养，培养温度24~26℃；培养25-30d转入继代培养基中；

（3）继代培养：将初代培养获得的无菌苗转入继代培养基中进行增殖扩繁；

继代培养基为D4或D9；

D4配方：DKW+1.0~4.0 mg/L 6-BA+1.0~4.0 mg/L ZT+0.25~0.75 mg/L IBA+28~30 g/L蔗糖+6.5~7.5 g/L琼脂+1.0~4.0 g/L PVP-K30，pH值调至5.8~6.0，其余为水；

D9配方：DKW+2.0~5.0 mg/L ZT+0.25~1.5 mg/L TDZ+0.25~1.0 mg/L IBA+28~30 g/L蔗糖+6.5~7.5 g/L琼脂+1.0~4.0 g/L PVP-K30，pH值调至5.8~6.0，其余为水；

1500~2500 lux光照强度下，每天14~16 h的光照培养，培养温度24~26 ℃；培养30-35d，切成1~2 cm的茎段置于继代培养中继续扩繁增殖；或者培养20-25d直接接种至生根培养基中；

4）生根培养：将无菌苗接种至生根培养基中进行生根培养；

生根培养基为R2或R3；

R2配方：1/2DKW+0.25~1.5 mg/L IBA+28~30 g/L蔗糖+6.5~7.5 g/L琼脂+1.0~4.0 g/LPVP-K30，pH值调至5.8~6.0，其余为水；

R3配方：1/2DKW+1.0~3.5 mg/L IBA+28~30 g/L蔗糖+6.5~7.5 g/L琼脂+1.0~4.0 g/LPVP-K30，pH值调至5.8~6.0，其余为水；

光照培养20~30 d，1500~2500 lux光照强度下，每天14~16 h的光照培养，培养温度24~26 ℃，形成白色不定根；

5）炼苗、移栽：将经生根诱导培养再生不定根的完整植株，按照本领域的常规方式进行炼苗，移栽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第5）步是将生根诱导培养基中的无菌苗连同培养瓶置于塑料薄膜温室大棚中闭盖炼苗2~3 d，然后松盖炼苗2~3 d，去盖炼苗1~2 d，棚内温度25~35 ℃，将琼脂用自来水彻底冲洗干净，然后栽植于装有基质的花盆中，采用干土栽植稍微压实，浇透水后用透明塑料杯倒扣保湿，塑料杯底部扎孔透气，5~7 d后去掉塑料杯让其正常生长；

所述的基质包括：腐殖质土、草炭、蛭石、珍珠岩，4种基质的体积比为3~5:1~3:1~3:1~3。