KR101895161B1 - 오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 식물체 형성 방법 - Google Patents

오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 식물체 형성 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 식물체 형성 방법에 관한 것으로 본 발명에 따른 오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 액아배양 방법과 액아배양용 배지는 기본 배지를 이용하는 경우에 비해 현저히 우수한 신초 형성율, 신초 생장, 유식물체 형성율, 발근율 및 묘목의 생장을 이루는 것으로 나타나 농가의 새로운 수익 작물로 오디 수확에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 식물체 형성 방법{Method for plant formation of mulberry 'Cheong Su' cultivar(Morus alba L.) for in vitro mass propagation}
본 발명은 오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 식물체 형성 방법에 관한 것이다.
뽕나무는 장미목 뽕나무과 뽕나무속에 속한 낙엽 교목 또는 낙엽 관목으로 원산지는 온대 및 아열대 지방이고, 세계에 30여 종이 분포하고 있는 것으로 알려져 있으며, 한국에는 산뽕나무로 불리는 산상(山桑, Morus bombycis), 한국에서 일반적으로 재배되는 백상(白桑, Morus alba) 그리고 노상(魯桑, Morus Ihou)의 3종이 재배되고 있다. 줄기의 높이는 3 ~ 10 m로 껍질은 회갈색을 띄며, 어린 가지는 회갈색 내지 회백색에 잔털이 있으나, 점차 잔털이 사라지게 된다. 잎은 난상 원형 내지 긴 타원상의 난형으로 길이는 10 cm 정도이고, 3 ~ 5 갈래로 갈라지며, 잎자루의 길이는 2.0 ~ 2.5 cm 정도이고 잔털이 있다. 꽃은 자웅이체(gonochorism; 암수 딴그루)로 열리고, 열매는 6월에 검붉게 익으며, 구형 또는 타원형으로 그 길이는 보통 1.0 ~ 2.5 ㎝ 정도이다. 잎은 양잠용(누에 먹이)으로 수피(나무 껍질)는 약용 또는 제지용, 열매는 식용 및 약용으로 사용되고 있다.
상기 뽕나무의 열매는 오디라 불리며 한의학에서는 상심 또는 상실 등으로 부르는데, 내열(內熱)에 의한 소갈증(消渴證; 당뇨병) 치료에 쓰이는 것으로 알려져있고, 동의보감 탕액편(湯液篇)에서도 뽕나무의 정영(精英)이 다 모여 있는 것으로 말하면서 '오래 복용하면 흰 머리가 검게 되고 늙지 않는다. 검게 익은 것을 따서 볕에 말린 후 찧어서 가루 낸다. 꿀로 환을 만들어서 오래 복용한다. 또 대부분 술을 빚어 먹는 데, 주로 보하는 작용이 있다.' 라고 하여 오디의 기능성에 대하여 기록하고 있다.
인건비를 비롯한 생산비의 상승으로 종래의 의류 관련 양잠산업은 축소되고 있으나, 뽕나무나 누에 산물이 가지고 있는 기능성 생리활성 물질을 이용하는 기능성 양잠 산업이 새롭게 성장하고 있다. 이의 한 형태로 종래 누에를 사육하고 남은 뽕나무의 부산물로 여겨지던 오디는 혈당강하, 항산화, 노화방지, 항암효과 등의 다양한 기능성이 입증되면서 오디를 이용한 관련 가공산물의 생산 및 판매가 크게 늘어나고 있어 오디를 생산하여 소득을 올리는 농가가 크게 증가하면서 새로운 소득작목으로 자리 잡고 있다. 2007년 국내 재배면적 및 생산량은 744 ha, 2,050 M/T(metric ton)이었으나 2011년에는 1,751 ha, 6,752 M/T으로 증가하였으며, 생산액은 2012년 528 억원으로(농림수산식품부 2012년 자료) 향후 생산 및 수요가 지속적으로 증가할 것으로 예상되고 있다.
이렇듯 뽕나무 열매인 오디의 생산과 이용을 위한 활동은 전 세계적으로 이루어지고 있는데, 특히 오디를 과실화하기 위하여 잎 생산이 주 목적이 아닌 오디 생산용으로 적합한 품종을 육성하고 선발하는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 과거에는 주로 누에 사육을 위한 사료용으로 뽕나무를 재배하여 왔기 때문에 잎 생산용 품종을 육성하여 국내에 보급하였으나, 오디 생산이 새로운 소득원으로 자리잡아 감에 따라 오디 생산용 품종의 육성이 필요한 실정이다. 기존의 뽕잎 생산용 품종인 청일뽕, 수성뽕, 수원뽕 등을 재배하여 오디를 생산하는 경우 과실이 회백색으로 단단하게 굳어지고 썩게 되는 곰팡이 전염병인 오디 균핵병에 걸릴 수 있다. 오디 균핵병은 한국에서 생산되는 오디중 20 ~ 30 % 가량이 균핵병에 의해 손실되는 것으로 알려져 있을만큼 오디 생산에 가장 큰 피해를 주는 병으로 2012년 기준 균핵병에 의해로 약 2,000여 톤 정도 생산량이 감소되어 약 80억 원의 피해가 발행한 바 있다. 또한 뽕잎을 목적으로 재배되던 종래 종은 오디의 크기가 작거나 당도가 높지 않은 등 과실의 품질이 현저히 떨어지는 문제점이 있다.
뽕나무 품종 중 청수(Cheong Su)는 상기 균핵병에 강하며, 수확량도 종래 뽕나무의 오디 수확량보다 높고, 오디의 당도도 15~18 브릭스로 높으며, 과피가 단단하여 보구력 및 저장성이 우수하고, 수확기간이 기존의 잎 생산용 품종과 비교하여 5일 정도가 긴 25 ~ 50일 정도로 농가에서의 취급도 용이하다.
뽕나무의 일반적인 묘목 생산법은 실생묘를 생산하는 것으로서 묘목의 생산기간이 2-3년으로 길고, 노동력의 투입으로 인한 생산비 증가로 인해 묘목 생산업자들이 생산을 기피함에 따라 수요공급 불균형으로 묘목가격이 높아져 구입에 많은 비용이 소요되는 문제점이 있다. 이를 극복하기 위한 묘목 번식방법으로는 대한민국 등록특허 제10-1087735호에서처럼 모체의 영양기관 일부를 분리 발육시켜 독립적인 개체로 만드는 영양번식(營養繁殖, Vegetative propagation) 방법을 주로 활용한다. 종자번식의 경우에는 교배 과정에서 유전적인 분리가 일어나기 때문에 모체와 동일한 특성을 갖는 식물체를 얻기 어려우므로 묘목을 증식하고 생산하는 데에는 영양번식 방법을 주로 사용한다. 그러나 이러한 묘목 양성과정에서는 뿌리 활착율이 낮아 묘목을 생산하는 효율이 떨어지고 묘목 증식율 또한 불균일하여 안정적인 묘목 생산이 어려운 실정으로 신소득 작목인 오디 생산용 뽕나무 신품종인 '청수'의 안정적인 묘목 생산 및 보급을 위하여 관행적인 묘목 번식방법의 문제점을 보완할 수 있는 우량묘 생산기술이 필요하다.
식물의 눈, 잎, 줄기, 뿌리 등의 조직을 인공적인 기내 환경에서 배양하여 온전한 식물체로 생산하는 기술을 '조직배양' 이라고 하는데, 온도 및 습도가 조절되는 배양실 안에서 유리병이나 시험관 등의 배양용기 내에 식물체가 자랄 수 있는 양분을 넣고 오염이 없는 무균상태에서 식물체를 키우는 기술이다. 이러한 조직배양 기술은 계절에 상관없이 연중 묘목 생산이 가능하여 적정한 배양조건이 확립되면 기내 식물체를 일시에 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다. 해외의 경우에는 뽕나무 묘목의 대량생산을 위하여 조직배양 기술을 활용하는 경우가 많은데, 인도, 파키스탄 등에서 보고된 연구 결과에서도 정단(頂端, Apex, 식물체의 분열조직이 발달해 있는 줄기나 뿌리의 말단부분), 액아(腋芽, Axillary bud, 가지 선단부 아래에 잎자루와 가지가 만나는 사이에 생기는 곁눈), 절간(節間, Internode, 식물의 줄기에서 잎이 달려 있는 마디와 마디 사이) 등의 식물체 일부 부위를 채취하여 배양 증식한 후 온전한 뽕나무 어린 식물체가 형성되었음을 확인할 수 있다.
식물체는 여러 종류의 기관 즉 뿌리, 줄기, 잎, 화기 등으로 구성되어 있는데 모든 기관이 분화능(分化能, 분화할 수 있는 능력)을 가지고 있으나, 기관의 종류에 따라 분화능력에 차이가 있기 때문에 적절한 배양기관의 선정은 대단히 중요한데, 대부분 경정부(정단부, Shoot tip), 액아(곁눈, Axillary bud), 잎 절편(엽편, Leaf segment)등을 이용하여 배양한다. 식물이 가지고 있는 고유의 분화능력을 전형성능(全形成能, Totipotency)이라 하는데, 단세포 혹은 식물 조직 일부분으로부터 완전한 식물체가 재생되는 능력을 말한다. 모든 세포가 전형성능을 지니고 있지만 세포 조직의 분화 정도, 채취 부위, 배지의 조성, 배양 환경 등에 따라 발현되는 결과는 현저히 차이가 나므로, 식물의 종류 또는 품종의 종류에 따른 배양 조건의 최적화가 필요하다. 특히 식물의 조직이나 기관이 기내(器內, 배양 시험관이나 유리병과 같은 배양용기 상태)라는 특수한 환경에서 생장 증식하기 위해서는 여러 영양분이 필요한데, 영양분의 요구도는 식물의 종류에 따라 또는 배양조직이나 기관의 종류에 따라서 차이가 나므로 배양하고자 하는 식물이나 조직의 특성에 맞는 배지를 개발하여야 한다. 그중 MS 배지라고 불리는 이 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형 있게 배합한 배지로써 식물 조직배양 시 기본 배지로 널리 사용되고 있다. 이러한 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 최적의 배지조성을 선택하여 배양하여야 하며, 이때 대한민국 등록특허 제10-0815439호에서와 같이 기본배지 이외에도 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 생장조절제 등을 첨가하거나 농도 및 일부 성분의 함량을 변화시켜 사용하는 것이 필요하다. 따라서 오디 생산용 뽕나무 신품종인 '청수'의 기내 대량증식 및 유식물체(어린 식물체) 생산을 위해서는 '청수' 품종에 적합한 조직배양 배지 조성을 찾아내는 것이 매우 중요하다.
이에, 본 발명자들은 오디 생산용 뽕나무 신품종 '청수'의 액아(腋芽, Axiliary bud, 가지 선단부 아래에 잎자루와 가지가 만나는 사이에 생기는 곁눈)내 생장점(生長點, Growing point, 식물의 줄기와 뿌리의 끝에서 세포의 증식, 기관 형성과 같이 세포분열이 일어나는 부분) 부위를 배양하여 이로부터 직접 신초를 형성시키고, 어린 식물체(유식물체)로 다시 분화시킨 후, 이를 외부환경에 적응시키는 기외 순화 과정을 통하여 청수 묘목을 효율적으로 증식하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1087735호 대한민국 등록특허 제10-0815439호
본 발명의 목적은 오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 식물체 형성 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
a) 뽕나무(Morus alba L.) 품종인 '청수'의 액아를 채취하여 생장점을 분리하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 생장점을 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), BAP(6-benzylamino purine), 키네틴(kinetin), 아스코르빈산(Ascorbic acid), 티아민 HCl(Thiamine HCl), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 질산은 및 항균제를 포함하는 신초 유도용 배지에서 배양하여 신초를 유도하는 단계;
c) 상기 단계 b)의 신초를 2,4-D, BAP, 키네틴, 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 질산은, L-아스파라진(L-Asparagine), L-글루타민(L-Glutamine) 및 항균제를 포함하는 신초 생육용 배지에서 배양하여 신초를 생육하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 생육된 신초를 2,4-D, BAP, 키네틴, 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 질산은, L-아스파라진, L-글루타민 및 항균제를 포함하는 유식물체 분화용 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
e) 상기 단계 d)의 유식물체를 BAP, IBA(Indole butyric acid), NAA(Naphthaleneacetic acid), 아스코르빈산. 항균제 및 활성탄을 포함하는 발근 유도용 배지에서 배양하여 뿌리 형성을 유도하는 단계; 및
f) 상기 단계 e)의 뿌리 형성된 유식물체를 기외순화시키는 단계;
를 포함하는 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 액아배양 방법과 액아배양용 배지는 기본 배지를 이용하는 경우에 비해 현저히 우수한 신초 형성율, 신초 생장, 유식물체 형성율, 발근율 및 묘목의 생장을 이루는 것으로 나타나 농가의 새로운 수익 작물로 오디 수확에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 생장점 배양이 된 사진이다.
도 2는 본 발명에 의한 신초 배양이 된 사진이다.
도 3은 본 발명에 의한 유식물체 배양이 된 사진이다.
도 4는 본 발명에 의한 발근 배양이 된 사진이다.
도 5는 본 발명에 의한 기외 순화가 된 사진이다.
도 6은 본 발명에 의해 생장점 단계에서부터 생육된 어린 묘목 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 오디 생산용 뽕나무(Morus alba L.) 청수의 액아배양 방법을 제공한다:
a) 뽕나무(Morus alba L.) 품종인 '청수'의 액아를 채취하여 생장점을 분리하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 생장점을 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), BAP(6-benzylamino purine), 키네틴(kinetin), 아스코르빈산(Ascorbic acid), 티아민 HCl(Thiamine HCl), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 질산은 및 항균제를 포함하는 신초 유도용 배지에서 배양하여 신초를 유도하는 단계;
c) 상기 단계 b)의 신초를 2,4-D, BAP, 키네틴, 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 질산은, L-아스파라진(L-Asparagine), L-글루타민(L-Glutamine) 및 항균제를 포함하는 신초 생육용 배지에서 배양하여 신초를 생육하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 생육된 신초를 2,4-D, BAP, 키네틴, 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 질산은, L-아스파라진, L-글루타민 및 항균제를 포함하는 유식물체 분화용 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
e) 상기 단계 d)의 유식물체를 BAP, IBA(Indole butyric acid), NAA(Naphthaleneacetic acid), 아스코르빈산. 항균제 및 활성탄을 포함하는 발근 유도용 배지에서 배양하여 뿌리 형성을 유도하는 단계; 및
f) 상기 단계 e)의 뿌리 형성된 유식물체를 기외순화시키는 단계.
상기 단계 b)의 신초유도용 배지는 총 배지 1000 중량부 중 2,4-D가 0.1 내지 0.5 중량부, BAP가 0.5 내지 1.5 중량부, 키네틴이 0.1 내지 1 중량부, 아스코르빈산이 0.5 내지 1.5 중량부, 티아민 HCl이 1 내지 3 중량부, 니코틴산이 0.5 내지 1.5 중량부, 피리독신 HCl이 0.5 내지 1.5 중량부, 질산은이 1 내지 3 중량부, 항균제가 0.5 내지 2 중량부를 포함할 수 있다.
상기 단계 c)의 신초 생육용 배지는 총 배지 1000 중량부 중 2,4-D가 0.1 내지 0.5 중량부, BAP가 0.5 내지 1.5 중량부, 키네틴이 0.1 내지 1 중량부, 아스코르빈산이 0.5 내지 1.5 중량부, 티아민 HCl이 1 내지 3 중량부, 니코틴산이 0.5 내지 1.5 중량부, 피리독신 HCl이 0.5 내지 1.5 중량부, 질산은이 1 내지 3 중량부, L-아스파라진이 10 내지 40 중량부 및 L-글루타민이 0.5 내지 2 중량부, 항균제가 0.5 내지 2 중량부를 포함할 수 있다.
상기 단계 d)의 유식물체 분화용 배지는 총 배지 1000 중량부 중 2,4-D가 0.1 내지 1 중량부, BAP가 1 내지 3 중량부, 키네틴이 0.5 내지 2 중량부, 아스코르빈산이 0.5 내지 1.5 중량부, 티아민 HCl이 1 내지 3 중량부, 니코틴산이 0.5 내지 1.5 중량부, 피리독신 HCl이 0.5 내지 1.5 중량부, 질산은이 1 내지 3 중량부, L-아스파라진이 10 내지 40 중량부 및 L-글루타민이 0.5 내지 2 중량부, 항균제가 0.5 내지 2 중량부를 포함할 수 있다.
상기 단계 e)의 발근 유도용 배지는 총 배지 1000 중량부 중 BAP가 0.1 내지 1 중량부, IBA가 0.5 내지 2 중량부, NAA가 0.1 내지 1 중량부, 아스코르빈산이 0.5 내지 1.5 중량부, 항균제가 0.5 내지 2 중량부 및 활성탄이 0.5 내지 2 중량부를 포함할 수 있다.
상기 항균제는 메틸클로로이소티아졸론(Methylchloroisothiazolone), 메틸이소티아졸리논(Methylisothiazolinone), 크롤로메틸이소티아졸론(Chloromethylisothiazolone), 벤츠이소티아졸론(Benzisothiazolone), 옥틸이소티아졸론(Octylisothiazolone), 디클로로옥틸이소티아졸론(Dichlorooctylisothiazolone) 및 부틸벤츠이소티아졸론(Butylbenzisothiazolone)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 단계 f)의 기외순화는 상기 유식물체를 상토와 펄라이트가 혼합된 화분에서 기온 20 내지 26℃, 습도 55 내지 65% 및 광량 30 내지 60 μmol m-2의 조건에서 배양한 후에, 기온 18 내지 25℃로 유지되는 온실환경에서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 배지는 MS(Murashige and Skoog) 배지를 기본으로 사용할 수 있다.
상기 MS 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형 있게 배합한 배지로써 식물 조직배양시 기본 배지로 널리 사용되는 배지이다. 상기 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 농도 및 일부 성분의 함량을 변화시켜 최적의 배지조성을 선택할 수 있다. 이때 첨가 및 함량이 변화되는 구성물은 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 생장조절제가 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 MS 배지에 첨가되는 여러 형태의 당류는 탄수화물 합성 능력이 없는 배양 조직의 에너지원으로 작용하며, 조직배양 시 사용되는 당의 종류에는 수크로오스(Sucrose), 글루코오스(Glucose), 프럭토오스 (Fructose), 말토오스(Maltose) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이 중 수크로오스(Sucrose)는 물에 용해되고 고압 멸균되는 과정에서 단당류인 글루코오스와 프럭토오스로 분해되며, 배양체의 세포막에서 방출되는 인버테이즈(Invertase, 역전효소; 이당류인 수크로오스를 단당류인 프럭토오스와 글루코오스로 가수분해하는 효소)나 세포외효소(Eextracellular enzyme)에 의해 가수분해 되면서 배양체가 흡수하기 용이한 형태로 바뀌기 때문에 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 배양단계 및 배지 조성에 따라 기본배지에 첨가되는 수크로오스의 농도가 달라야 하며, 또한 배지 내 삼투압 조절과도 관련이 있으므로 정확한 첨가 농도의 확인이 필요하다.
식물생장조절제(植物生長調節, Plant growth regulators)는 식물 생장에 관여하는 식물호르몬을 총칭하는 것으로 식물 조직배양 시에도 적정한 종류와 농도의 생장조절제가 배지에 첨가되어야만 배양의 목적에 맞게 배양체가 생육 및 분화할 수 있다. 상기 식물생장조절제의 종류로는 옥신(Auxin)류, 사이토키닌(Cytokinin)류, 지베렐린(Gibberellin)류, 앱시스산(Abscisic acid)이 있으나, 식물생장에 관여하는 식물호르몬이라면 본 발명에 포함될 수 있다.
상기 옥신(Auxin)류는 고등식물의 줄기와 뿌리에서 세포분열에 주로 관여하는 필수적인 호르몬으로 직접적인 세포분열 제어능력은 사이토키닌류보다 약하므로 배양체의 활발한 생육 및 증식을 유도하기 위해서는 사이토키닌류와 혼용하여 사용하는 것이 일반적이며, 조직배양시 주로 뿌리 형성을 유도하기 위하여 일차적으로 사용될 수 있다. 옥신의 종류에는 나프탈렌아세트산(Naphthaleneacetic acid; NAA), 인돌아세트산(indolacetic acid, IAA), 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 및 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 특히 본 발명에서 사용된 2,4-D는 뿌리 형성 촉진뿐만 아니라 세포를 생장시킨다.
사이토키닌(Cytokinin)류는 핵산(Nucleic acid)을 구성하는 퓨린 염기(Purin base) 중 하나인 아데닌(Adenine)의 유도체로 주로 세포분열을 자극하고 촉진하는데, 식물의 종류 및 세포의 분화상태에 따라 다르게 작용한다. 사용할 수 있는 사이토키닌은 키네틴(kinetin), 제아틴(zeatin), 벤질아데닌(benzyladenine, BA), 6-벤질아미노퓨린(6-benzylamino purine; 6-BAP 또는 BAP) 및 디페닐우레아(diphenyl urea)등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 특히 본 발명에서 사용된 사이토키닌 종류 중 하나인 키네틴은 세포분열시 DNA 합성을 증진시키며, BAP 또한 세포분열을 촉진한다.
아미노산은 아미노기와 카르복시기를 갖는 분자로 단백질의 기본 구성원이 되는 식물 조직배양에서 필요한 가장 효과적인 질소원이며, 생육을 촉진시킬 분 아니라 세포의 형태형성(Morphogenesis)을 유도하고 특히 체세포 배 형성(Somatic embryogenesis)을 유도한다. 특히 L-아스파라진(L-Asparagine)이나 L-글루타민(L-Glutamine)은 부가적인 질소원으로 작용하여 적정 농도 첨가 시 배양체의 생육을 촉진하며, 특히 옥신이나 사이토키닌 계통의 생장조절제가 포함된 배지에 L-아스파라진(L-Asparagine)이나 L-글루타민(L-Glutamine)과 같은 아미노산을 부가적으로 첨가하는 경우 질소대사(Nitrogen metabolism) 작용을 활성화시켜 기내 배양체의 생육 촉진 및 관련 대사물질의 합성능력을 증가시킬 수 있다.
상기 사이토키닌과 옥신 외에도 식물체의 조직배양에 필요한 비타민으로는 티아민 HCl(Thiamine HCI), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 리보플라빈 (Riboflabin), 이노시톨(Inositol) 등 비타민 B 복합체가 있으며, 이는 기내 배양체의 생장을 촉진시킨다. 특히 티아민은 당류 대사작용(Carbohydrate metabolism)과 아미노산 생합성(Amino acid biosynthesis) 작용에 관여하고, 아스코르빈산은 비타민 C로써 식물 조직배양 기본 배지에 첨가하여 사용하는 경우 배양체에서 생기는 페놀 화합물(Phenolic compound)의 작용을 억제하여 배양 식물체의 갈변(Browning) 또는 흑변(Blackening)현상을 감소시키고 건전한 배양묘의 생산 효율을 높인다.
질산은(AgNO3)은 식물 조직배양에서 에틸렌의 작용을 억제하여 식물의 생장과 발달을 조절함으로써 캘러스(Callus, 분화된 않은 부정형의 세포덩어리) 형성, 배(胚, Embryo) 발달, 신초 및 뿌리 생육 등 기관 분화를 촉진한다. 뽕나무와 같은 식물의 조직배양 시 배양체로부터 과다하게 누출되어 배지에 집적되는 페놀 화합물 때문에 급격히 산화(Oxidation) 현상이 발생하여 배지 및 배양체의 갈변(Browining) 또는 흑변(Blackening)이 급격히 일어나는 경우에는 배양 배지 내에 질산은(AgNO3)을 첨가하면 갈변 및 흑변 현상의 발생을 억제할 수 있다.
배양과정중 식물체의 보호를 위해 항균제를 첨가할 수 있다. 상기 항균제는 메틸클로로이소티아졸론(Methylchloroisothiazolone), 메틸이소티아졸리논(Methylisothiazolinone), 크롤로메틸이소티아졸론(Chloromethylisothiazolone), 벤츠이소티아졸론(Benzisothiazolone), 옥틸이소티아졸론(Octylisothiazolone), 디클로로옥틸이소티아졸론(Dichlorooctylisothiazolone), 부틸벤츠이소티아졸론(Butylbenzisothiazolone)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항균제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 다양한 병원균의 효소 활성을 저해하는 것으로 알려진 이소티아졸론(Isothiazolone)계 항균제 혼합물인 PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology Inc.)을 이용하였다. 상기 PPM은 특히 열에 안정적이므로 고압멸균이 가능하여 현재 식물의 산업적 배양에 적합하며, 표 1에 나타난 바와 같이 1.0 ㎖/L의 PPM을 배지에 첨가하여 사용함으로써 배양 중인 식물체에는 약해(Phytotoxicity)가 나타나지 않으면서 공중 부유균이나 낙하균 등의 미생물에 의한 오염 발생빈도는 현저히 감소시킬 수 있는 것이 확인되었다.
상기 활성탄(Activated charcoal)은 숯을 정제하여 분말화시킨 것으로 식물 조직배양 배지에 첨가하는 경우 기내 식물체에서 배출되거나 배지 내에 집적되어 있는 페놀 화합물을 흡수하며, 신초의 신장 및 발근을 촉진하고 식물체 고유의 특성을 회복하는 데 도움을 주며, 기내 배양 식물체의 유리질화(Vitrification, 조직배양 식물체의 해부학적, 형태적, 생리적 이상체) 현상을 감소시킨다. 그러나 배지 내 페놀 화합물뿐만 아니라 생장조절제도 함께 흡수하여 신초의 증식율을 감소시킬 수 있으므로 배지에 적정 농도로 첨가해 주어야 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 오디 생산용 뽕나무 '청수'의 액아를 채취하여 액아의 생장점을 신초 유도용 배지에서 배양하여 생장점 유래 신초 형성을 확인하였으며(도 1 및 표 2 참조), 상기 신초를 신초 생육용 배지에서 배양해 신초의 생육을 확인하고(도 2 및 표 4 참조), 상기 신초를 유식물체 분화용 배지에서 배양해 유식물체 형성이 유도됨을 확인하였으며(도 3 및 표 6 참조), 상기 유식물체를 발근 유도용 배지에서 배양해 유식물체의 뿌리를 형성하는 것을 확인하고(도 4 및 표 8 참조), 상기 유식물체를 기외순화시키는 단계(도 5 및 표 9 참조)를 거쳐 묘목이 형성되는 것 을 확인하였다(도 6 참조)
따라서, '청수'의 액아를 채취하는 단계; 액아의 생장점을 신초 유도용 배지에서 배양하는 단계; 신초를 신초 생육용 배지에서 배양하는 단계; 배양된 신초를 유식물체 분화용 배지에서 배양하는 단계; 유식물체를 발근 유도용 배지에서 배양하는 단계; 및 유식물체를 기외순화시키는 단계로 구성되는 본 발명의 방법은 오디 생산용 뽕나무 '청수' 품종의 기내 대량증식을 위한 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 새 가지의 액아 내 생장점 채취 후 초기배양
충청북도 농산사업소 양잠보급과에서 분양받은 오디 생산용 뽕나무 품종인 '청수'에 대해 3~4월에 새 가지에서 나는 액아(腋芽, Axiliary bud, 당년에 잎으로 분화하는 곁눈)를 채취하였다. 이때 액아 기부(基部, 가지 줄기에 붙어있는 액아 아래 밑둥치 부분)에 5㎜ 정도의 목질부가 붙어있도록 조심스럽게 떼어낸 후 실험실에서 흐르는 물에 2분간 표면 세척하였다. 클린벤치(무균작업대)에서 70% 에탄올 150 ㎖이 담긴 멸균 유리병(외경 81㎜, 높이 132㎜)에 30초간 침지하여 액아 표면을 소독하고 3% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액 150㎖이 담긴 멸균 유리병에서 15 분 동안 침지하여 1회 소독한 후 꺼내어서 멸균된 증류수 150 ㎖이 담긴 유리병에서 5 분씩 3회 세척하였다. 그 후, 세척 및 소독이 완료된 액아의 생장점을 무균 채취하기 위하여 클린벤치에서 실체 현미경(Stemi 2000, Carl Zeiss)을 이용하여 작업하였으며, 액아 내 생장점(직경 2 ㎜ 내외, 높이 2 ~ 3 ㎜)을 엽원기(葉原基, Leaf primordium, 잎의 근원이 되거나 원 잎을 생성하는 세포의 일군)가 1매 정도 붙어있는 상태로 채취하여 신초 유도용 배지에 치상하여 배양하였다. 신초 유도용 배지는 하기 표 1과 같이 MS 배지(Murashige & Skoog Medium)(M0245, Duchefa)에 수크로오스(Sucrose) 20 g/L, 아스코르빈산(Ascorbic acid) 1㎎/L, 티아민 HCl(Thiamine HCI) 1 ㎎/L, 니코틴산(Nicotonoc acid) 0.5㎎/L, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl) 0.5 ㎎/L, 아가(agar; 한천) 7g/L, 6-Benzylaminopurine(BAP) 1 ㎎/L, 키네틴(kinetin) 0.5 ㎎/L, 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 0.25 ㎎/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology Inc.) 1.0 ㎖/L 및 질산은(AgNO3) 2.00 ㎎/L을 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.8로 조정해 만들었다. 만들어진 배지는 배양용 유리 시험관(지름 25㎜, 높이 150㎜)에 10~15㎖씩 분주한 후 고압멸균(121, 1.2 kgf·cm-2 pressure, 15분) 하여 사용하였다.
산초유도용 배지의 조성
성 분 명 함 량 비 고
NH4NO3 1650.00 ㎎/L
MgSO4 180.54 ㎎/L
KNO3 1900.00 ㎎/L
KH2PO4 170.00 ㎎/L
CaCl2 332.02 ㎎/L
CoCl26H2O 0.025 ㎎/L
ZnSO47H2O 8.60 ㎎/L
Na2MoO42H2O 0.25 ㎎/L
MnSO4H2O 16.90 ㎎/L
H3BO3 6.20 ㎎/L
KI 0.83 ㎎/L
FeNaEDTA 36.70 ㎎/L
CuSO45H2O 0.025 ㎎/L
Glycine 2.00 ㎎/L
Myo-Inositol 100.00 ㎎/L
Thiamine HCl 2.00 ㎎/L (MS 배지내 1.00 + 추가 1.00)㎎/L
Nicotinic acid 1.00 ㎎/L (MS 배지내 0.50 + 추가 0.50)㎎/L
Pyridoxine HCl 1.00 ㎎/L (MS 배지내 0.50 + 추가 0.50)㎎/L
Ascorbic acid 1.00 ㎎/L
BAP 1.00 ㎎/L
Kinetin 0.50 ㎎/L
2,4-D 0.25 ㎎/L
AgNO3 2.00 ㎎/L
PPM 1.00 ㎖/L
Sucrose 20.00 g/L
Agar 7.00 g/L
배지의 pH 5.8
상기 신초 유도용 배지가 들어있는 배양용 유리 시험관(지름 25㎜, 높이 150㎜)에 생장점을 하나씩 치상하였으며, 23±2℃, 16/8h 명암주기, 40 μmol m-2 조건에서 2~3주간 배양하였다. 2~3주 배양기간 동안 배지 또는 생장점 배양체가 갈색 또는 흑색으로 변하는 갈변(Browining) 또는 흑변(Blackening) 현상이 발생하는 경우 즉시 새로운 배지로 생장점을 다시 옮겨주어 배양하였다.
상기 신초 유도용 배지에서 2~3주간 배양한 후 생장점 유래 신초 형성율을 조사하였고, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, Sucorse, Agar 만을 첨가한 배지에 배양한 대조구와 비교하였다.
그 결과, 도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 옥신(Auxin) 계통의 2,4-D와 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP, Kinetin 뿐만 아니라 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl 및 질산은을 추가로 첨가한 배지를 사용하여 배양하는 경우 오디 생산용 뽕나무 신품종 '청수'의 액아 내 생장점으로부터 신초를 형성시키는 것을 확인하였다.
신초 형성율(%)
대조구 신초 유도용 배지
오디 뽕나무 '청수' 11.7±1.1z 70.8±4.6
zEach value represents the mean±SE.
< 실시예 2> 생장점으로부터 형성된 신초의 생육을 유도하는 배양
초기 배양 2~3주 후 생장점으로터 형성된 신초의 생육을 본격적으로 유도하기 위하여 하기 표 3의 배지에 신초를 새롭게 다시 치상하여 계대 배양하였다. 신초 생육 배지는 MS 배지에 수크로오스 20g/L, 아스코르빈산 1㎎/L, 티아민 HCl 1㎎/L, 니코틴산 0.5㎎/L, 피리독신 HCl 0.5㎎/L, 아가(한천) 7g/L, BAP 1㎎/L, 키네틴 0.5㎎/L, 2,4-D 0.25㎎/L, PPM 1.0㎖/L, 질산은 2.0㎎/L, L-아스파라진(L-Asparagine) 25㎎/L 및 L-글루타민(L-Glutamine) 1㎎/L 를 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.8로 조정하였다. 그런 다음 배양용 유리 시험관(지름 25㎜, 높이 150㎜)에 15~20㎖씩 분주한 후 고압멸균(121, 1.2 kgf·cm-2 pressure, 15분) 하여 사용하였다.
신초 생육용 배지
성 분 명 함 량 비 고
NH4NO3 1650.00 ㎎/L
MgSO4 180.54 ㎎/L
KNO3 1900.00 ㎎/L
KH2PO4 170.00 ㎎/L
CaCl2 332.02 ㎎/L
CoCl26H2O 0.025 ㎎/L
ZnSO47H2O 8.60 ㎎/L
Na2MoO42H2O 0.25 ㎎/L
MnSO4H2O 16.90 ㎎/L
H3BO3 6.20 ㎎/L
KI 0.83 ㎎/L
FeNaEDTA 36.70 ㎎/L
CuSO45H2O 0.025 ㎎/L
Glycine 2.00 ㎎/L
Myo-Inositol 100.00 ㎎/L
Thiamine HCl 2.00 ㎎/L (MS 배지내 1.00 + 추가 1.00)㎎/L
Nicotinic acid 1.00 ㎎/L (MS 배지내 0.50 + 추가 0.50)㎎/L
Pyridoxine HCl 1.00 ㎎/L (MS 배지내 0.50 + 추가 0.50)㎎/L
Ascorbic acid 1.00 ㎎/L
BAP 1.00 ㎎/L
Kinetin 0.50 ㎎/L
2,4-D 0.25 ㎎/L
AgNO3 2.00 ㎎/L
L-Asparagine 25.00㎎/L
L-Glutamine 1.00㎎/L
PPM 1.00 ㎖/L
Sucrose 20.00 g/L
Agar 7.00 g/L
배지의 pH 5.8
표 3의 신초 생육용 배지가 들어있는 배양용 유리 시험관(지름 25㎜, 높이 150㎜)에 신초를 하나씩 치상하였으며, 명상태(23±2℃, 16/8h 명암주기, 40 μmol m-2)에서 2~3주간 배양하였다. 2~3주 배양기간 동안 배지 또는 배양체가 갈색 또는 흑색으로 변하는 갈변(Browining) 또는 흑변(Blackening) 현상이 발생하는 경우 생리적 스트레스에 의해 페놀 화합물(Phenolic compound)이 배지에 축적된 것으로 판단하여 즉시 새로운 배지로 신초를 옮겨주어 배양하였다. 페놀 화합물에 의해 발생되는 배양상의 문제점을 해결하기 위하여 계대 배양(배양체를 새로운 배지로 바꾸어 다시 배양하는 것)을 자주해 주거나 활성탄(Activated charcoal), 아스코르빈산 등의 첨가물을 배지에 추가하는 방법 등이 있다.
상기 신초 생육용 배지에서 2~3주간 배양한 신초의 생육특성을 조사하였으며, 실시예 1과 같은 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, Sucorse, Agar 만을 첨가한 배지에서 배양한 대조구와 비교하였다.
그 결과, 도 2 및 표 4에 나타낸 바와 같이 MS 배지에 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 옥신(Auxin) 계통의 2,4-D 와 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP, Kinetin 뿐만 아니라 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 질산은, L-아스파라진 및 L-글루타민을 추가로 첨가한 배지를 사용하여 배양하는 경우 오디 생산용 뽕나무 신품종 '청수'의 생장점 유래 신초의 생육을 증진시키는 것을 확인하였다.
신초 형성율
(%)		 신초수
(개/주)		 신초장
(㎜/주)		 엽수
(개/주)		 생존율
(%)
대조구 30.4±3.0z 1.0±0.0 14.8±1.3 2.3±0.1 27.1±1.8
신초 생육용 배지 82.2±4.1 1.0±0.0 32.3±2.0 3.8±0.2 76.5±2.9
zEach value represents the mean±SE.
< 실시예 3> 유식물체 배양
생장점으로터 형성된 신초의 생육을 유도하는 배양과정을 거친 다음에는 신초를 신장시키고 생장속도를 빠르게 하여 어린 식물체(유식물체)로 분화시키는 배양단계가 필요하다.
유식물체로 분화시키기 위해 하기 표 5의 배지로 신초를 옮겨 치상하여 3주간 배양하였으며, 3주 후 새로운 배지로 옮겨 주어 완전한 유식물체의 형성을 유도하였다. 유식물체 분화용 배지는 MS 배지에 수크로오스 30g/L, 아스코르빈산 1㎎/L, 티아민 HCl 1㎎/L, 니코틴산 0.5㎎/L, 피리독신 HCl 0.5㎎/L, 아가(한천) 7g/L, BAP 2㎎/L, 키네틴 1㎎/L, 2,4-D 0.5㎎/L, PPM 1.0㎖/L, 질산은 2.0㎎/L, L-아스파라진 25㎎/L 및 L-글루타민 1㎎/L을 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.8로 조정하였다. 그런 다음 식물 배양용 유리병(Plant culture vessle, 외경 10㎜, 높이 130㎜)에 100㎖씩 분주한 후 고압멸균(121, 1.2 kgf·cm-2 pressure, 15분)하여 사용하였다.
유식물체 분화용 배지
성 분 명 함 량 비 고
NH4NO3 1650.00 ㎎/L
MgSO4 180.54 ㎎/L
KNO3 1900.00 ㎎/L
KH2PO4 170.00 ㎎/L
CaCl2 332.02 ㎎/L
CoCl26H2O 0.025 ㎎/L
ZnSO47H2O 8.60 ㎎/L
Na2MoO42H2O 0.25 ㎎/L
MnSO4H2O 16.90 ㎎/L
H3BO3 6.20 ㎎/L
KI 0.83 ㎎/L
FeNaEDTA 36.70 ㎎/L
CuSO45H2O 0.025 ㎎/L
Glycine 2.00 ㎎/L
Myo-Inositol 100.00 ㎎/L
Thiamine HCl 2.00 ㎎/L (MS 배지내 1.00 + 추가 1.00)㎎/L
Nicotinic acid 1.00 ㎎/L (MS 배지내 0.50 + 추가 0.50)㎎/L
Pyridoxine HCl 1.00 ㎎/L (MS 배지내 0.50 + 추가 0.50)㎎/L
Ascorbic acid 1.00 ㎎/L
BAP 2.00 ㎎/L
Kinetin 1.00 ㎎/L
2,4-D 0.50 ㎎/L
AgNO3 2.00 ㎎/L
L-Asparagine 25.00㎎/L
L-Glutamine 1.00㎎/L
PPM 1.00 ㎖/L
Sucrose 30.00 g/L
Agar 7.00 g/L
배지의 pH 5.8
표 5의 유식물체 분화용 배지가 들어있는 배양용 유리병(Plant culture vessle, 외경 10㎜, 높이 130㎜)에 신초를 2~3개씩 치상하였으며, 명상태(23±2℃, 16/8h 명암주기, 40 μmol m- 2)에서 3주간 배양하였다. 3주 후 다시 새로운 유식물체 분화용 배지가 들어있는 배양용 유리병에 옮겨 주어 3주동안 배양함으로써 완전한 유식물체의 형성을 유도하였다.
상기 6주간의 2회 계대 배양 후 유식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, 수크로오스, 아가(agar) 만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.
그 결과 도 3 및 표 6에 나타난 바와 같이 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 옥신(Auxin) 계통의 2,4-D 와 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP, 키네틴의 농도를 이전 배양단계보다 2배로 증가시켜 첨가하여 신초로부터 유식물체로의 분화 과정을 빠르게 촉진시켰을 뿐만 아니라 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 질산은 및 L-아스파라진과 L-글루타민을 추가로 첨가하여 유식물체의 건강하고 왕성한 생육을 유도함으로써 오디 생산용 뽕나무 신품종 '청수'의 생장점 유래 신초로부터 어린 식물체의 분화 및 생육을 증진시킴을 확인하였다.
유식물체
형성율 (%)		 유식물체
길이 (㎜/주)		 엽수
(개/주)		 엽장
(㎜)		 엽폭
(㎜)		 유식물체
생존율(%)
대조구 15.5±1.4z 21.8±1.4 2.6±0.1 15.9±0.1 8.5±0.1 19.4±1.1
유식물체 분화용 배지 75.4±3.2 56.8±2.9 5.6±0.3 25.8±0.2 11.7±0.1 78.3±2.8
z Each value represents the mean±SE.
< 실시예 4> 유식물체 발근 (뿌리 형성) 배양
상기 <실시예 3>에서 유식물체 배지에서 6주간 배양한 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 하기 표 7의 조성으로 제조된 배지를 사용하여 배양하였다. 표 7의 발근 유도용 배지는 MS 배지에 수크로오스 30g/L, 아스코르빈산 1㎎/L, 아가(agar) 7g/L, BAP 0.5㎎/L, IBA 1㎎/L, NAA 0.5㎎/L, PPM 1㎖/L 및 활성탄(Activated charcoal) 1g/L 을 첨가하여 혼합 제조한 후, 배지의 pH를 5.8로 조정하였다. 그런 다음 식물 배양용 유리병(Plant culture vessle, 외경 10;㎜, 높이 130㎜)에 100㎖씩 분주한 후 고압멸균(121, 1.2 kgf·cm-2 pressure, 15분)하여 사용하였다.
발근 유도용 배지 조성
성 분 명 함 량 비 고
NH4NO3 1650.00 ㎎/L
MgSO4 180.54 ㎎/L
KNO3 1900.00 ㎎/L
KH2PO4 170.00 ㎎/L
CaCl2 332.02 ㎎/L
CoCl26H2O 0.025 ㎎/L
ZnSO47H2O 8.60 ㎎/L
Na2MoO42H2O 0.25 ㎎/L
MnSO4H2O 16.90 ㎎/L
H3BO3 6.20 ㎎/L
KI 0.83 ㎎/L
FeNaEDTA 36.70 ㎎/L
CuSO45H2O 0.025 ㎎/L
Glycine 2.00 ㎎/L
Myo-Inositol 100.00 ㎎/L
Thiamine HCl 1.00 ㎎/L
Nicotinic acid 0.50 ㎎/L
Pyridoxine HCl 0.50 ㎎/L
Ascorbic acid 1.00 ㎎/L
BAP 0.50 ㎎/L
IBA 1.00 ㎎/L
NAA 0.50 ㎎/L
활성탄 1.00 g/L
PPM 1.00 ㎖/L
Sucrose 30.00 g/L
Agar 7.00 g/L
배지의 pH 5.8
상기 유식물체 발근 유도용 배지가 들어있는 배양용 유리병(Plant culture vessle, 외경 10㎜, 높이 130㎜)에 유식물체를 하나씩 치상하였으며, 명상태(23±2, 16/8h 명암주기, 40 μmol m- 2)에서 4주간 배양하였다. 4주 후 유식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, Sucorse, Agar 만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.
그 결과, 도 4 및 표 8에 나타낸 바와 같이 MS 배지에 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP와 식물의 뿌리 형성을 유도하는 옥신(Auxin) 계통의 IBA 및 NAA를 적정 농도로 첨가할 뿐만 아니라, 배지 내 집적된 페놀 화합물을 흡수하고 식물체 고유의 특성을 회복시켜 기외 순화(배양 식물체를 외부 환경에 적응시키는 것) 시 배양 식물체의 적응력을 높여주는 역할을 하는 활성탄을 부가적으로 첨가함으로써 오디 생산용 뽕나무 신품종 '청수'의 어린 식물체의 뿌리 형성을 촉진하는 것을 확인하였다.
발근율
(%)		 뿌리수
(개/주)		 근장
(㎜)		 근경
(㎜)		 유식물체
생존율 (%)
대조구 8.2±0.5z 1.2±0.1 10.3±0.1 0.7±0.1 30.6±2.2
발근 유도용 배지 84.3±4.7 6.7±0.5 44.9±3.1 0.8±0.1 79.2±3.9
z Each value represents the mean±SE.
< 실시예 5> 기외 순화
뿌리가 완전히 형성되어 배양용 유리병에서 배양 중인 어린 식물체는 배양 용기에서 꺼내어 외부환경으로 적응하는 기외 순화 과정을 거쳐야만 완전한 식물체의 형태를 갖출 수 있다.
이를 위해 기외 순화를 위하여 배양용 유리병에서 뿌리가 형성된 '청수'의 유식물체를 꺼낸 다음 유식물체의 뿌리에 배양 배지가 남아있지 않도록 부드럽게 깨끗이 물로 씻어낸 후, 원예용 상토:펄라이트가 2:1(v:v)로 혼합된 상토가 담긴 화분(내부 직경 110 mm, 높이 113 mm)에 옮겨 심었다. 화분에 심은 어린 식물체는 배양실과 유사한 환경(23±2, 16/8h 명암주기, 40~50 μmol m-2, 공증습도 60±5%)의 순화실에서 1~2주 키운 다음, 최고 25, 최저 18로 유지되는 유리 온실 또는 비닐하우스에서 공중습도를 서서히 낮춰주면서 1~2주 정도 경화시켜 가면서 키웠다. 기외 순화 4주 후부터는 유식물체의 상태를 확인하면서 공중습도를 천천히 낮춰주면서 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다. 기외 순화 3개월 및 6개월 정도 지난 후 순화 온실에서 자란 청수 유식물체의 생육특성을 조사하였다.
그 결과, 도 5 및 표 9에서 나타난 바와 같이, 유묘목이 기외 순화되는 것을 확인했으며, 생장점으로부터 배양한 상기 유묘목은 도 6에서와 같이 정상적인 어린 묘목으로 자라는 것을 확인하였다.
기외
순화
기간		 나무
높이
(㎝)		 나무
굵기
(㎜)		 측지 생존율
(%)
수
(개/주)		 길이
(㎝)		 굵기
(㎜)
3개월 43.0±1.9z 8.3±0.3 11.1±0.5 10.3±0.8 3.1±0.1 92.5±4.3
6개월 62.4±2.8 11.6±0.4 14.5±0.7 12.9±1.1 3.3±0.1 93.0±4.1
zEach value represents the mean±SE.

Claims (8)

  1. a) 뽕나무(Morus alba L.) 품종인 '청수'의 액아를 채취하여 생장점을 분리하는 단계;
    b) 상기 단계 a)의 생장점을 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), BAP(6-benzylamino purine), 키네틴(kinetin), 아스코르빈산(Ascorbic acid), 티아민 HCl(Thiamine HCl), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 질산은 및 항균제를 포함하는 신초 유도용 배지에서 배양하여 신초를 유도하는 단계;
    c) 상기 단계 b)의 신초를 2,4-D, BAP, 키네틴, 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 질산은, L-아스파라진(L-Asparagine), L-글루타민(L-Glutamine) 및 항균제를 포함하는 신초 생육용 배지에서 배양하여 신초를 생육하는 단계;
    d) 상기 단계 c)의 생육된 신초를 2,4-D, BAP, 키네틴, 아스코르빈산, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 질산은, L-아스파라진, L-글루타민 및 항균제를 포함하는 유식물체 분화용 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
    e) 상기 단계 d)의 유식물체를 BAP, IBA(Indole butyric acid), NAA(Naphthaleneacetic acid), 아스코르빈산. 항균제 및 활성탄을 포함하는 발근 유도용 배지에서 배양하여 뿌리 형성을 유도하는 단계; 및
    f) 상기 단계 e)의 뿌리 형성된 유식물체를 기외순화시키는 단계;
    를 포함하는 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 b) 내지 e)의 배양은 기온 18 내지 27℃ 또는 광량 30 내지 60 μmol m-2의 조건에서 배양되는 것인, 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 b)의 신초유도용 배지는 총 배지 1000 중량부 중 2,4-D가 0.1 내지 0.5 중량부, BAP가 0.5 내지 1.5 중량부, 키네틴이 0.1 내지 1 중량부, 아스코르빈산이 0.5 내지 1.5 중량부, 티아민 HCl이 1 내지 3 중량부, 니코틴산이 0.5 내지 1.5 중량부, 피리독신 HCl이 0.5 내지 1.5 중량부, 질산은이 1 내지 3 중량부, 항균제가 0.5 내지 2 중량부를 포함하는, 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단계 c)의 신초 생육용 배지는 총 배지 1000 중량부 중 2,4-D가 0.1 내지 0.5 중량부, BAP가 0.5 내지 1.5 중량부, 키네틴이 0.1 내지 1 중량부, 아스코르빈산이 0.5 내지 1.5 중량부, 티아민 HCl이 1 내지 3 중량부, 니코틴산이 0.5 내지 1.5 중량부, 피리독신 HCl이 0.5 내지 1.5 중량부, 질산은이 1 내지 3 중량부, L-아스파라진이 10 내지 40 중량부 및 L-글루타민이 0.5 내지 2 중량부, 항균제가 0.5 내지 2 중량부를 포함하는, 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 단계 d)의 유식물체 분화용 배지는 총 배지 1000 중량부 중 2,4-D가 0.1 내지 1 중량부, BAP가 1 내지 3 중량부, 키네틴이 0.5 내지 2 중량부, 아스코르빈산이 0.5 내지 1.5 중량부, 티아민 HCl이 1 내지 3 중량부, 니코틴산이 0.5 내지 1.5 중량부, 피리독신 HCl이 0.5 내지 1.5 중량부, 질산은이 1 내지 3 중량부, L-아스파라진이 10 내지 40 중량부 및 L-글루타민이 0.5 내지 2 중량부, 항균제가 0.5 내지 2 중량부를 포함하는, 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 단계 e)의 발근 유도용 배지는 총 배지 1000 중량부 중 BAP가 0.1 내지 1 중량부, IBA가 0.5 내지 2 중량부, NAA가 0.1 내지 1 중량부, 아스코르빈산이 0.5 내지 1.5 중량부, 항균제가 0.5 내지 2 중량부 및 활성탄이 0.5 내지 2 중량부를 포함하는, 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법.
  7. 제 1항에 있어서 상기 항균제는 메틸클로로이소티아졸론(Methylchloroisothiazolone), 메틸이소티아졸리논(Methylisothiazolinone), 크롤로메틸이소티아졸론(Chloromethylisothiazolone), 벤츠이소티아졸론(Benzisothiazolone), 옥틸이소티아졸론(Octylisothiazolone), 디클로로옥틸이소티아졸론(Dichlorooctylisothiazolone) 및 부틸벤츠이소티아졸론(Butylbenzisothiazolone)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 단계 f)의 기외순화는 상기 유식물체를 상토와 펄라이트가 혼합된 화분에서 기온 20 내지 26℃, 습도 55 내지 65% 및 광량 30 내지 60 μmol m-2의 조건에서 배양한 후에, 기온 18 내지 25℃로 유지되는 온실환경에서 배양하는, 오디 생산용 뽕나무 청수의 식물체 형성 방법.
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