JP2018157808A - シャクヤク株、シャクヤク株増殖方法及びシャクヤク栽培方法 - Google Patents
シャクヤク株、シャクヤク株増殖方法及びシャクヤク栽培方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
胚とは、受精後に発生を始めた幼生物のことをいい、種子胚とは、種子中にある幼植物のことをいう。不定胚とは、植物の組織や細胞を組織培養して得られる、受精胚と同様の構造をした組織のことをいう。不定胚は、受精胚と同様に頂端と基端を有し、頂端からは芽や子葉が、基端からは根が分化・成長する。発根とは、植物組織の一部から根が分化・成長することであり、種子の発根とは、種子胚の基端から根が分化・成長することをいう。発芽とは、種子胚又は不定胚の頂端から芽や子葉が分化し成長することをいう。
多量要素(主要無機塩類)
硝酸アンモニウム(NH4NO3) 1,650mg/L
塩化カルシウム(CaCl2・2H2O) 440mg/L
硫酸マグネシウム(MgSO4・7H2O) 370mg/L
リン酸カリウム(KH2PO4) 170mg/L
硝酸カリウム(KNO3) 1,900mg/L
微量要素
ホウ酸(H3BO3) 6.2mg/L
塩化コバルト(CoCl2・6H2O) 0.025mg/L
硫酸銅 (CuSO4・5H2O) 0.025mg/L
硫酸鉄(FeSO4・7H2O) 27.8mg/L
硫酸マンガン(II)(MnSO4・4H2O) 22.3mg/L
ヨウ化カリウム(KI) 0.83mg/L
モリブデン酸ナトリウム(Na2MoO4・2H2O) 0.25mg/L
硫酸亜鉛(ZnSO4・7H2O) 8.6mg/L
Na2EDTA・2H2O 37.2mg/L
ビタミン及びその他有機化合物
myo−イノシトール 100mg/L
ニコチン酸 0.5mg/L
塩酸ピリドキシン 0.5mg/L
塩酸チアミン 0.1mg/L
グリシン 2.0mg/L
国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部標本園で保存栽培中のシャクヤク〔品種名:北宰相(PLK)〕から種子を採取し、75%(v/v)エタノールで1分間殺菌後、滅菌水で漱いだ。次いで、0.1%(v/v)Tween20含有2%(v/v)次亜塩素酸ナトリウム溶液中で攪拌しながら室温(約25℃)で10分間殺菌後、滅菌水で3回漱いだ。殺菌後の種子より、胚(種子胚)を取り出し、(2)/2MS固形培地(主要無機塩類を1/2量としたMS培地、ショ糖2%、0.25%ゲルライト、培地5mL/径1.8cm高さ9cm培養試験管)に無菌的に播種した。23℃において、14時間明期(L)(430ルクス)又は暗所(D)で培養したところ、いずれの条件においても9日後から発根が認められたが、培地が褐変した。そこで、播種16日後に新しい同培地に交換し、培養温度を20℃に変更して培養を継続した。その結果、14時間明期よりも暗所の方が発根率、子葉展開率とも高く、また、不定胚形成も認められた。播種47日後までの結果を下記表1に要約する。後述するPLKD2株は、暗所で培養した一種子に由来するものであり、発根及び発芽が認められた。
PLKD2で得られたマルチプルシュートから、草高1cm未満の2〜3個の小シュート(以下、草高1cm未満のシュートを小シュートと表記)を含む小シュート塊(約5mm角;以下、小シュート塊と表記)を調製した。これを(2)/2MS B3又は(2)/2MS IB1B3に1試験管あたり1個植え付けて、15℃、14時間明期で培養したところ、いずれの培地でも良好な生育とシュートの増殖が認められた(図1上)。シュート長は、シュート基部から最も高いシュートの葉までの長さ(草高)(cm)を示し、シュート数は、成長が認められた培養物について、1試験管あたりに形成したシュートの数を示している。以下同様にシュート長及びシュート数を計測した。
一方、小シュート塊については、(2)/2MS IB0.1B3培地又は(2)/2MS IB1B3培地において15℃にて生育を試みた。いずれにおいてもシュート増殖は良好であったが、シュート長はIB0.1B3の方が高い傾向が認められた(図1下)。
さらにこれらを、20℃、14時間明期に移してHF培地での培養を継続したところ、132日後(20℃移動から51日後)に発根率は36.8%に上昇した(図2)。またHFの前の培地は、B3(IBなし)添加培地の方が、シュート長が有意に高かった(図2)。
図1の、IB0.1B3又はIB1B3添加培地における培養により得られた生育のよい大シュートより調製した大シュート片について、HF又はIB1添加の(2)/2MS培地を用い、15℃又は20℃で発根試験を行った(図3)。培養50日後、15℃、IB1(前培地IB0.1B3) の大シュート片では発根率71.4%が得られた。15℃におけるIB1培養全体の発根率は50.0%であった。一方、20℃におけるIB1培養全体の発根率は12.5%であった。すなわち、発根過程に関しても、約15℃という温度と光条件(14時間明期、約5,000ルクス)により、発根期間が著しく短縮され、発根率が著しく向上し得ることが明らかとなった。
図1のIB0.1B3又はIB1B3添加培地で得られた小シュートについて、小シュート塊を調製し、種々濃度のIB(0、0.1及び1mg/L)とB 3mg/Lを組み合わせた培地を用い、15℃で増殖試験を実施した。培養50日後、15℃、B3添加培地(前培地IB0.1B3)で形成されたシュート数は、大シュート(発根培地に移植可能なシュート)は約2本、大シュートと小シュートの合計数は4本であり、大シュート形成率もシュート増殖率も最も良好であった(図4)。また、直前の培養で高濃度のIB(1mg/L)を使用すると、低濃度のIB(0.1 mg/L)に比べ、B3培地でのシュート伸長、シュート数とも有意に低くなった(図4)。
図1のIB0.1B3又はIB1B3添加培地で得られた大シュート(葉は切り落とさない)を種々濃度のIB添加(0、0.5、1mg/L:それぞれ図7中では、HF、IB0.5、IB1と表記)の(2)/2MS培地に植付け15℃で発根試験を行った。その結果、培養73日後に、IB0.5、IB1ともに60%の発根率が得られた(図7)。発根数は、IB濃度の増加とともに、多くなる傾向が認められた(図7)。なお、発根数は、発根が認められた試験管における、1株あたりの根の本数を表しており、以下の試験でも同様である。
増殖培地としてのB3添加培地、発根培地としてのIB0.5及びIB1添加培地を、HF培地と比較し評価した(いずれも基本培地は(2)/2MS培地)。増殖試験には、小シュート塊を植付片として用いた。発根試験には、大シュート片を植付片として用いた。15℃、14時間明期(約5,000ルクス)、培養期間55〜61日間において、B3添加培地で安定したシュートの増殖が確認され、IB0.5及びIB1添加培地で80%以上の高い発根率が確認された(図9)。
非特許文献14〜17では、MS培地と比べて主要無機塩類を1/2量(1/2MS培地)としCa2+だけを2倍としたもの(CaCl2・2H2O濃度880mg/L)が用いられている。そこで、PLKD2株について、Ca2+をMSの2倍(1/2MSの4倍)にした発根培地(2)/2MS4C IB0.5及び増殖培地(2)/2MS4C B3を作製し、それぞれ(2)/2MS IB0.5及び(2)/2MS B3と比較した。15℃での培養56日後、発根培地では、Ca2+濃度強化により若干の発根率低下[58.3%:通常のCa2+濃度の培地の発根率76.0%に比べて23%の低下]が認められた。しかしながら、通常のCa2+濃度の発根培地よりも、草丈が高く、葉が頑健な植物体が得られた(図10)。増殖培地では、Ca2+強化により、通常のCa2+濃度の培地よりも、葉が頑健になり、草丈が高く、シュート数が増える傾向が認められた(図10)。図10の写真は培養開始63日後に撮影されたものである。
上記植物組織培養で得られたシャクヤクPLKD2培養苗(培養植物体)について、一例として、圃場栽培可能な苗を取得するため、土壌への定植、馴化と育成を行った。培養試験管内のPLKD培養苗を、培養試験管から取り出し、根に付着したゲルを、根を傷つけないように注意しながら弱い水流下でよく洗い流した。上径9.0cm下径6.4cm高さ7.6cmのポリポットに鉢底ネットを敷き、培養土を鉢底から2cm程度まで充填した。培養土の組成は、パミス(登録商標)特小粒:赤玉土(小粒):堆肥(サラブレッドお馬のふかふか堆肥):タキイの育苗培土(草花・野菜育苗用):川砂=10:6:2:1:1とした。ポリポットは株式会社東海化成製、パミスは大江化学工業株式会社製、赤玉土は有限会社粂谷商店製、堆肥は株式会社兵庫アグリメイト製、育苗培土はタキイ種苗株式会社製である。シャクヤクPLDK2の地下部(根)の部分が鉢内に入るように地上部を手で支え、鉢のまわりから培養土を加えながら定植した。過度の乾燥を防ぐため、地上部をラップで覆い、1日1回底面より潅水しながら、閉鎖温室内、20℃、14時間明期、相対湿度55%で栽培した。明期は太陽光を利用し、朝夕2時間は補光照明を点灯(岩崎電気株式会社製セラミックメタルハライドランプ:セラルクス EYE HID LAMP M400FCE−W/BUD)させた。土壌定植1週間後、ラップを取り外して同条件で栽培した。土壌に定植し馴化したPLKD2培養苗は、図14に示すように、正常に生育し、根の発達と肥大が認められた。馴化後の植物体は、鉢上げ[素焼きの5号鉢、培養土(赤玉土:堆肥:タキイの育苗培土(草花・野菜育苗用):川砂=6:2:1:1)]して栽培を継続した。以上の結果より、植物組織培養で増殖し発根したシャクヤクPLKD2培養苗は、圃場栽培用の苗の育苗にも有用であることが判明した。
上記で得られた発根苗を水耕栽培試験に供試した。一例として、実施例8と同様に培養試験管から取り出し洗浄した培養苗を、パミス特小粒又はバーミキュライトを充填したツリーポットに定植(植物体地下部は支持体中に保持)し、ツリーポット底面から養液を供給する水耕栽培(底面潅水方式水耕栽培)を行った。バーミキュライトは、バーミキュライト3号(覆土・目土用、福島バーミ株式会社)を用い、ツリーポットは株式会社山利製作所製のものを用いた。定植直後から14日間は、植物体地上部全体をラップで覆い、定植後14日以降は、ラップを取り外して栽培した(シャクヤク水耕栽培方法における「馴化工程」)。養液は、定植直後から3週間は純水とし、その後(水耕栽培工程)は標準濃度の4分の1(25%)の大塚A処方(1/4大塚A処方)を純水で調製して用いた。水耕栽培は、15℃、14時間明期(植物育成用蛍光灯型LEDプラントフレック、約4,000ルクス)、相対湿度90%、CO2濃度1,000ppmに設定した人工気象器(株式会社日本医化器械製作所製LPH−411SPC)内で行った。
PLKD2培養苗を、前述と同様に、パミス特小粒又はバーミキュライトを充填したポリポット(上径9cm高さ7.5cm、上径15cm高さ13cm、及び上径15cm高さ30cm)に定植した。鉢の底面から、養液として1/8大塚A処方を供給しながら、グロースチャンバー室内、20℃、14時間明期、相対湿度60%で水耕栽培した。明期においては岩崎電気株式会社製セラミックメタルハライドランプ:セラルクス EYE HID LAMP M400FCE−W/BUD、約6,000ルクスを利用した。定植後2〜4週間は、過度の乾燥を防ぐため、植物体の地上部に透明な400mL容プラカップを被せて栽培した。定植後51日の地上部の生存率は、パミス:44.4%、バーミキュライト:11.1%であり、パミスの方が良好であった。しかし、その後の成長は停止した。以上より、温度20℃での水耕栽培は、シャクヤクの水耕栽培には適さないことが示唆された。
発明者らは、シャクヤクの様々な品種、系統、及び株、特にPLKD2株を、遺伝子レベルで識別するためのマーカーを探索した。その結果、ジヒドロフラボノール−4−リダクターゼ(Dihydroflavonol−4−reductase:PlDFR)遺伝子のエキソン2〜エキソン4の777bp領域に、遺伝子識別に利用可能な複数の変異点が存在することを発見した。PlDFRは、シャクヤク植物体におけるアントシアニン等の色素の生合成に関わると推定されるフラボノイド生合成経路の酵素の遺伝子である。
この実施例は、約1年間という長期間に渡ってツリーポットにおいてシャクヤク苗を水耕栽培した実例をさらに提供する。PLKD2株の培養苗10個体を出発点とした。これらの培養苗は、2%ショ糖を含み主要無機塩類を1/2量としたMS培地に3−インドール酪酸(IBA)を0.5mg/L(IB0.5)又は1mg/L(IB1)添加したものを用いて15℃で81〜84日間組織培養を行って得られたものである。これらの培養苗について、上述した培養段階での植物ホルモン添加条件のほか、植付け時(水耕栽培開始前)の生育状況、及び水耕栽培に用いた植付け支持体の種類を下記表5に示す。表中、Vはバーミキュライトを、Pはパミスを表す。
装置:株式会社日本医化器械社製人工気象器(LPH−411SPC)、ツリーポット(山利製作所)を用いた底面潅水方式水耕栽培
光:14時間明期、約4000lux(植物育成用LEDランプ プラントフレック)
温度:15℃
相対湿度:90%
CO2濃度:1000ppm
支持体:バーミキュライト(覆土・目土用、福島バーミ)又はパミス(特小粒、大江化学工業)
養液:大塚A処方1/4濃度(8リットル当たりOATハウス1号3.0g+2号2.0g、OATアグリオ)
ただし、栽培開始後3週間はツリーポットをラップで覆って加湿しながら純水で馴化させ、それ以降は上記の養液に変更して栽培を行った。
実施例11の水耕栽培後に得られたPLKD2株の乾燥根を、異なる部位に切り分けた。具体的には、バーミキュライト試験区の2個体とパミス試験区の1個体は、乾燥状態で径が2mm以上の根と2mm未満の根 (いずれも皮付き) の2部位に分離した。バーミキュライト試験区の残りの3個体については、上記と同様の2部位に加え、径2mm以上の根の一部の周皮を削り取り、全部で4部位とした(すなわち、径2mm以上の皮付き根、径2mm未満の皮付き根、径2mm以上の皮去り根、及び周皮)。これらの試料を乳鉢・乳棒で破砕した。
装置:ウォーターズ社 Acquity UPLCシステム
カラム: Acquity UPLC BEH C18、2.1×50mm、1.7μm(ウォーターズ社)
カラム温度:30℃
流速:0.35mL/分
溶媒:(A) 0.1vol%ギ酸、(B)0.1vol%ギ酸−アセトニトリルの下記勾配液
「0→2.0 min: 98% (A)、2.0→3.0 min: 98→85% (A)、3.0→10.0 min:85→80% (A)、10.0→12.0 min:80→10%(A)、12.0→13.0 min: 10% (A)、13.0→14.0 min:10→98% (A)」
PDA:定性:190〜500nm、定量:230nm(標品3種:アルビフロリン、ペオニフロリン、ペンタガロイルグルコース)
MS:Mass(m/z):150〜1250
イオン源温度:120℃
脱溶媒温度:250℃
ガス流量:<脱溶媒>500L/hr、<コーン>50L/hr、
キャピラリー電圧:3kV
コーン電圧:20V
Claims (10)
- ジヒドロフラボノール−4−リダクターゼ(PlDFR)遺伝子において、配列番号1で表される配列をホモ接合で有する、シャクヤク株。
- 薬用品種北宰相に由来するものである、請求項1に記載のシャクヤク株。
- PLKD2株である、シャクヤク株。
- シュート増殖工程とシュート発根工程を含む植物組織培養工程を含む、シャクヤク増殖方法。
- 前記シュート増殖工程とシュート発根工程は、温度13〜17℃、明期12〜18時間、照度3,000〜7,000ルクスで行うことを特徴とする、請求項4に記載のシャクヤク増殖方法。
- 前記シュート増殖工程とシュート発根工程は、1〜7mMのCa2+イオンを含有する培地でシャクヤク組織を培養することを特徴とする、請求項4又は5に記載のシャクヤク増殖方法。
- 馴化工程と水耕栽培工程を含む、シャクヤク栽培方法。
- 前記馴化工程と水耕栽培工程は、温度13〜17℃、明期12〜18時間、照度3,000〜30,000ルクス、CO2濃度300〜1,500ppmで栽培を行うことを特徴とする、請求項7に記載のシャクヤク栽培方法。
- 前記馴化工程と水耕栽培工程は、1〜6mMのCa2+イオンを含有する養液を用いて栽培を行うことを特徴とする、請求項7又は8に記載のシャクヤク栽培方法。
- 前記馴化工程は、0〜6mMのCa2+イオンを含有する養液を用いて栽培を行うことを特徴とする、請求項7又は8に記載のシャクヤク栽培方法。
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