CN107354124A

CN107354124A - 一种铁皮石斛细胞规模培养方法

Info

Publication number: CN107354124A
Application number: CN201610305801.8A
Authority: CN
Inventors: 张�杰
Original assignee: Suzhou Tiancheng New Agricultural Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Tiancheng New Agricultural Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2016-05-10
Publication date: 2017-11-17

Abstract

本发明公开了一种体外规模化悬浮培养扩增铁皮石斛细胞的工艺，其培养过程是：铁皮石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，待愈伤组织长出后或胚状体诱导出后，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后将愈伤组织/胚状体进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于摇床上震荡悬浮培养，经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增，待达到生长密度后，通过调节生物反应器中的指标，达到每25‑60天收获一次，或者连续、半连续收获，多糖含量达到20％以上，并保持常年稳定扩增的从20L‑吨级单元的大规模铁皮石斛细胞悬浮培养连续扩增体系。

Description

一种铁皮石斛细胞规模培养方法

技术领域

本发明属于植物组织工程技术领域。本发明涉及一种植物生物技术克隆工程，特别是针对像铁皮石斛这种药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，以及对土地破坏比较严重，例如甘草等植物。

背景技术

随着城市化进程的迅速发展和人口的不断增长，生态环境的不断退化，使许多名贵中药材资源枯竭和濒灭。特别是针对像铁皮石斛这种药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，其社会效益很大。另一方面，由污染导致的食品安全问题已非常严重，农药残留和重金属超标是中草药植物的一大问题，也亟需解决。

铁皮石斛，顾名思义，是专指生于岩石上的石斛。至于附生于树木上的石斛属植物，古代本草亦有记载，称之为木斛。《本草经集注》曰：“生栎树上者名木斛，其茎形长大而色浅。……今始安亦出木斛，至虚长，不入丸散”。《本草图经》曰：“惟生石上者胜。亦有生栎木上者，名木斛，不堪用。”目前广泛培养于木屑之上的木斛，药性甚微，而且大面积占用土地。虽然从上个世纪80年代开始，人们试图用种子繁殖，人工栽培等手段或通过组织培养，诱导种子原茎球来扩增植株，再进行人工引种栽培等方法，扩大铁皮石斛的生产。该方法目前已经比较成熟，但由于种植者对医书中描述的铁皮石斛种植方式的了解不够，绝大部分种植者都种植木斛，其药用价值大打折扣，而且利用有性繁殖产生种子，经发芽扩增的方法很容易造成变种，对石斛物种的纯度造成很大的威胁。

本发明根据高等植物细胞的两个全能性：植物细胞具有分化成完整植株的全能性和植物细胞能合成原生植株药用有效成份的全能性。针对铁皮石斛这一具体物种，发明了一整套从铁皮石斛原生植株成株茎段休眠芽上直接诱导出愈伤组织，直接用愈伤组织或用诱导出的铁皮石斛胚状体进行单细胞悬液制备，再利用组织工程技术对该细胞进行悬浮式的工业化大规模扩增，进而将该方法与人工光源相结合，利用控制温度、酸碱度、氧含量、以及生长调节剂比例等将生产规模扩大到吨级以上的规模。

利用本发明的铁皮石斛悬浮细胞规模培养工艺，其生长速率达到9-12毫克/克·天；相当于自然生长速度的1000倍以上。利用规模化培养基础罐(50升)每20-30天产量可达2公斤干品，扩增产能每罐得率均在2.5％以上，得干率lO％以上。通过实施本发明的技术工艺，使铁皮石斛的生物培养规模从土地种植的低水平向工厂化生产规模转化。同时，由于生产流程得到了良好的控制，使农残重金属几乎检测不到，大大提高了产品长期服用的安全性。

发明内容

本发明为一种体外规模化悬浮培养扩增石斛胚状体方法，其培养过程是：石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待愈伤组织长出后，将愈伤组织剥离，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后将愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于摇床上以90-120转/分进行震荡悬浮培养，每瓶按适当接种率接种，根据生长情况继代；

经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增，通过调节生物反应器中的指标、更换培养基成分、改变生长调节剂比例、以及分批在线收集等手段，最终达到每25-50天收获一次或连续、半连续培养，多糖含量达到15％以上，比生物生长速率达8-9.5毫克/克·天，并保持20L至吨级单元生产规模、常年稳定的扩增体系。

具体的操作为：

石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待起始胚状体长出后，将胚状体剥离，或待愈伤组织形成后直接剥离愈伤组织，经匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，置于摇床上90-120转/分振荡悬浮培养，获得细胞种子；将细胞种子按一定接种比例接种到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，pH为5-7，固定光源光照12-20h，光照强度2000-8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-15天，不同阶段的光质交替变换，所述的光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3-4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换新鲜液体培养基一次。每15-25天收获石斛胚状体培养物的30-50％，并补充相应比例的新鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，总浓度为在0.05-5mg/L调整。

所述基本培养基为MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White或SH培养基。

所述的液体培养基与更换的新鲜液体培养基中的植物生长调节剂相同，均为IAA/NAA/IBA0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT 0.05-3mg/L，总浓度为0.05-5mg/L。

优选的，更换的新鲜液体培养基中植物生长调节剂为IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:KT0.05-3mg/L:ABA 0.05-50ug/L，总浓度为0.05-5mg/L。本发明为一种体外规模化悬浮培养扩增铁皮石斛细胞的工艺，其培养过程是：石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待愈伤组织长出后，将愈伤组织剥离，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后将愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于摇床上以90-120转/分进行震荡悬浮培养，每瓶按适当接种率接种，根据生长情况继代；经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增10-25天，待达到生长密度后，通过调节生物反应器中的指标、更换培养基成分、以及分批在线收集等手段，最终达到每20-50天收获一次，或者连续、半连续收获，多糖含量达到20％以上，比生物生长速率达9-12毫克/克·天，并保持常年稳定扩增的从20L-吨级单元的大规模铁皮石斛细胞悬浮培养连续扩增体系。

附图说明

图1，附图简要以流程形式归纳了发明内容所涵盖的技术要点，悬浮培养铁皮石斛细胞生产方法流程图。

具体实施方式

采集铁皮石斛茎段，灭菌后以幼嫩茎接种到固体培养基上段诱导外植体，在愈伤阶段或者待胚状体诱导形成后，转移到以MS培养基为基础培养基，每升加入5-10克椰汁，调节pH值至5.8的液体培养基中进行悬浮培养，培养条件：温度(25±5)℃，光强为2000-8000lx，光照时间12-20h/天。待胚状体适应悬浮培养后，将胚状体或愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，继续悬浮培养至稳定增值体系，按10-30％接种至大规模生物反应器中，培养周期为25-60天，或者连续培养。红蓝光比例前一段周期是2-3:4-5，后一段红蓝光比例为3-4:4-6，每阶段交替变换，每一阶段培养时间为10-15天，光强范围为2000-8000lx。大规模生物反应器中的培养基为基本培养基中加入了一定比例混合的生长素、细胞分裂素或者生长素、细胞分裂素以及脱落酸，生长素可以是IAA，IBA，NAA，细胞分裂素可以是6-BA，KT，ZT，脱落酸为ABA。生长素浓度为0.05-5mg/L，细胞分裂素浓度为0.05-5mg/L，ABA浓度为0.01-2mg/L。培养基在10-25天时换液一次，换液前后生长素与细胞分裂素组合均为：IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT 0.05-3mg/L。更优选的方案是，换液前生长素与细胞分裂素组合均为：IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT 0.05-3mg/L，换液后生长素与细胞分裂素、脱落酸组合为：IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:KT 0.05-3mg/L:ABA0.05-50ug/L。培养周期结束后，培养物可一次性收获，或按20％-80％收获率保存种源作连续培养。

结合实施案例，对本发明作以阐述，但不是限制本发明的局限性。

实施例1.铁皮石斛胚状体的规模化培养方法(见附图1)

1.铁皮石斛外植体采集、灭菌：以幼嫩茎接种到固体培养基上段诱导外植体，在愈伤阶段或者待胚状体诱导形成后，转移到以MS培养基为基础培养基，每升加入5-10克椰汁，调节pH值至5.8的液体培养基中进行悬浮培养，培养条件：温度(25±5)℃，光强为2000-8000lx，光照时间12-20h/天。

2.愈伤组织的增殖培养基：上述固体培养基接种好外植体三角瓶放在25℃±5，光照强度为2000-4000lx，光照时间10-18h/天，经数天连续培养后，愈伤组织在茎段休眠芽上长出。等到适量大小时，将愈伤组织剥离，转入到固体培养基上，每个三角瓶中放置几个愈伤组织块，进一步促进愈伤组织的增殖。

3.铁皮石斛细胞悬浮培养基及筛选程序：

A.悬浮培养基：上述固体培养基改变成液体培养基，同上述一样条件灭菌；

B.铁皮石斛细胞悬浮培养：在上述固体培养基中长成足够量的愈伤组织后，将愈伤组织进行匀浆酶解消化，使其成为单细胞悬液，按一定接种率接种到三角瓶，90～120转/分震荡，25℃±5，光强为2000lx，光照时间10-18h/天，视生长情况进行继代。

C.符合悬浮培养铁皮石斛细胞的筛选：经过3-4次继代后，仔细挑选增殖快、分散性好的铁皮石斛细胞进行进一步扩增，使每个三角瓶中的培养物形态一致，色泽相似，分散性好的培养体系。

D.生长速率测试

计算公式：(收获量-接种量)÷培养重量÷收获时培养天数＝生长速率

本发明在实施过程经检测，其生长速率达到9-9.5毫克/克·天。

E.大规模培养方法

培养基中激素总浓度为0.05-5mg/L。

培养周期：持续培养。

将胚状体种子按10-30％接种比例接种到50L不锈钢生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，酸碱度在5-7之间，固定光源光照10-20h，光照强度2000-8000Lx，红蓝光比例每15天更替一次，由2:5更替为3:5，再更替为2:5，以此模式循环；生长素与细胞分裂素比例控制在3:1即可，每15天更换培养基一次。

实施例2.铁皮石斛细胞系的规模化培养方法

除步骤E外，其余步骤与实施例1相同。

E.大规模培养方法

培养基中激素总浓度为0.05-5mg/L。

培养周期：50天。

将胚状体种子按10-30％接种比例接种到50L不锈钢生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，酸碱度在5-7之间，固定光源光照10-20h，光照强度2000-8000Lx，红蓝光比例每15天更替一次，由2:5更替为3:5，再更替为2:5，以此模式循环；生长素与细胞分裂素比例比例控制在3:1即可，每15天更换培养基一次。每培养25天收获30％，并补充30％新鲜培养液，培养周期结束后全部收获。

不同激素组合如表所示,从获得的胚状体内物质含量结果看出，只要生长素与细胞分裂素比例控制在3：1，培养获得的胚状体内多糖含量基本一致，即胚状体内物质含量与激素种类无关，而与培养方式以及生长素与细胞分裂素的比例有关。

实施例3.铁皮石斛细胞的多糖测定

一、实验方法

l、试剂配制

(l)乙醇溶液，20ml水中加入无水乙醇80ml。

(2)苯酚溶液：称取精制苯酚5.0克，加入水中溶解并稀释至lOOml，混匀，备用(溶液置4℃冰箱可保存一个月)。

(3)浓硫酸备用。

(4)葡萄糖标准储备液：精密称取在105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1.00809，加水溶解并定容至lOOml，混匀，置4℃冰箱保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖。

(5)葡萄糖标准使用溶液：吸取葡萄糖标准储备液2.OOml，置于lOOml容量瓶中，加水至刻度，混匀，置于4℃冰箱中保存。

2、实验方法

(l)葡萄糖标准曲线制备

精密吸取葡萄糖标准使用液O，0.2，0.4，0.6，0.8，l.O，(相当于葡萄糖0，0.04032，0.08064，0.12096，0.16128，0.2016mg)分别置于25ml比色管中准确补充水至2.Oml，加入苯酚溶液2.Oml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸lOml，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，lcm比色皿测定吸光度值。

以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线。由标准曲线回归曲线方程图得相关系数。

样品测定

a.样品提取

铁皮石斛胚状体在60℃烘箱中烘干，粉碎，称取约O.lg备用。石斛粉经95％乙醇提取后，按20倍体积水加温90℃，1小时。趁热过滤，收取滤液，减压浓缩，加4倍体积无水乙醇混匀，4000rpm，15min离心，沉淀用80％乙醇洗2遍，最终沉淀物溶于50ml水即为石斛粗多糖溶液。

b.多糖测定

精密取多糖溶液2.Oml置于25ml比色管中，加入苯酚溶液2.Oml，在旋转混匀器上混匀后，小心加入浓硫酸lO.Oml后混匀，置于水浴中煮沸lOmin,冷却至室温用分光度计在490nm波长处，以试剂空白为参比，lcm比色皿测定葡萄糖标准溶液和样品(按倍比稀释至合适浓度)吸光度值，做葡萄糖标准曲线图，计算样品中粗多糖含量。

c.计算方法

根据样品的OD值从标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，乘以稀释倍数，换算成总多糖含量，再除以烘干样品的干重，即为每克干重样品中含粗多糖的含量，单位为mg/g。

多糖含量＝OD值×稀释倍数×样品总体积/样品干重

二、铁皮石斛细胞多糖测定结果

实验对不同培养天数的铁皮石斛细胞团及其培养上清中的多糖含量进行了定量测定.结果表明：所测材料中的多糖含量稳定，其中20至25天的细胞中多糖含量为205-273mg/g干重：占总量的2.3-3.0％。

实施例4.与恒定培养方法相比细胞内物质含量比较

将上述培养得到的铁皮石斛细胞与恒定培养基培养条件下的胚状体进行检测，数据见下表。

指标	恒定培养	阶段培养
			收获率	260克/L	310克/L
多糖含量	250-265mg/g	255-273mg/g

Claims

1.一种体外规模化悬浮培养扩增石斛细胞的方法，其培养过程是：将石斛愈伤组织使用常规方法进行扩增培养，得到扩增后的愈伤组织或胚状体，将愈伤组织或胚状体组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，将细胞种子按一定接种比例接种到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，pH为5-7，固定光源光照10-20h，光照强度2000-8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-25天，不同阶段的光质交替变换，所述的光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3-4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换新鲜液体培养基一次。每15-25天收获石斛细胞系培养物的30-50％，并补充相应比例的新鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，生长素与细胞分裂素比例控制在3:1，总浓度在0.05-5mg/L调整。

2.根据权利要求1所述的方法，所述基本培养基为MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White或SH培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的液体培养基与更换的新鲜液体培养基中的植物生长调节剂相同，均为IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT0.05-3mg/L，总浓度为0.05-5mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，优选的，更换的新鲜液体培养基中植物生长调节剂为IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:KT 0.05-3mg/L:ABA 0.05-50ug/L，总浓度为0.05-5mg/L。

5.一种提高石斛细胞系产量的体外规模化悬浮培养扩增石斛细胞系方法，其特征在于：培养过程是将细胞系种子按一定接种比例接种到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，酸碱度在5-7之间，固定光源光照10-20h，光照强度2000-8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-25天，不同阶段的光质交替变换，所述的光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3-4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换培养基一次。每15-25天收获石斛细胞系培养物的30-50％，并补充相应比例的新鲜培养液，培养周期结束后将培养物全部收获；所述培养基中添加适当的植物生长调节剂，植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，生长素与细胞分裂素比例控制在3:1，总浓度在0.05-5mg/L调整。

6.根据权利要求5所述的方法，所述基本培养基为MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White或SH培养基。

7.根据权利要求5所述的方法，所述的液体培养基与更换的新鲜液体培养基中的植物生长调节剂相同，均为IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT 0.05-3mg/L，总浓度为0.05-5mg/L。

8.根据权利要求5所述的方法，优选的，更换的新鲜液体培养基中植物生长调节剂为IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:KT 0.05-3mg/L:ABA 0.05-50ug/L，总浓度为0.05-5mg/L。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征是细胞系放置在液氮保种。