CN110317773B - 一种铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法 - Google Patents

Abstract

一种铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，该方法包括以下步骤：分离和培养铁皮石斛根部组织细胞，静止中心高端粒酶活性细胞的悬浮培养，以及大规模悬浮培养。本发明克服了铁皮石斛离体材料容易褐化，无法规模化连续培养的问题，筛选出其根部静止中心高端粒酶活性的细胞，在一定条件下增殖量大，且细胞活性强，保持常年稳定的大规模铁皮石斛细胞悬浮培养连续扩增体系。

Description

一种铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种适用于铁皮石斛分生组织悬浮细胞系的分离和培养的方法。

背景技术

铁皮石斛，是兰科石斛属多年生附生草本植物，既是一味名贵的中草药，也是著名的盆栽观花植物。历代药学经典《神农本草经》、《道藏》、《本草纲目拾遗》、《中华人民共和国药典》(2000年至2010版)等均有铁皮石斛的药效的记载，盛赞其为“滋阴补益珍品”。铁皮石斛自秦汉时期就被列为药中上品，是滋阴补益的珍品，其化学成分多种多样，现已分离鉴定100多种化学成分，主要有效成分有多糖、联苄类和菲类、木脂素类、酚酸类、苯丙素类、氨基酸、微量元素等，对铁皮石斛及其化学成分的药理作用研究发现，铁皮石斛具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗疲劳、对消化系统及呼吸系统具有调节作用等。

铁皮石斛的假鳞茎基部具有分孽能力，一般每年分孽一茎：一年生的新茎四季常绿，春夏生长旺盛；二年生茎主要积累营养及孕花，叶逐渐脱落且不再生长；三年生茎开花结果，且不再萌生新叶；四年生茎丧失分孽能力，之后相继枯萎死亡。铁皮石斛花期在4到6月之间，自然结实率低，仅为0.31％，且种子胚乳败育，需与真菌共生获取营养才能萌发，自然条件下萌发率极低。铁皮石斛作为一种传统名贵药材，国家二级保护植物，野生资源严禁采挖。目前国内外对野生铁皮石斛资源的保护性开发及可持续利用的研究主要集中在人工栽培及组织培养方面。培养特定组织产次生代谢物虽易获得较高产率，但特定组织在常规生物反应器中难以生长且培养规模难以放大，需开发特殊生物反应器，未能满足现阶段工业化生产的需要。脱分化细胞相对而言具有明显优势，较适用于工业化生产，是缓解资源短缺的较有希望的途径。人工栽培虽然取得了一定进展，但供需缺口仍然相当悬殊，究其原因主要是铁皮石斛优质种苗供应不足、缺乏质量标准体系、后续产品开发技术含量低且多处于粗加工水平等因素对铁皮石斛的产业化发展形成了限制及发展动力的掣肘。

端粒酶，在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力。植物分生组织细胞，是植物生长发育的源泉和信号调控的中心。由于植物分生组织细胞是未分化的细胞，其端粒酶活性较高，因此具有很强的自我更新和持续分裂能力，是拥有永久生存能力的“不朽细胞”；此外，植物分生组织细胞还可以通过自我凋亡防止遗传性损伤，避免将有缺陷的DNA遗传下去，从而保护植物不受恶劣环境的影响。

本发明根据高等植物细胞的全能性，以及植物分生组织细胞永久生存能力，针对铁皮石斛这种植株，发明了一套从铁皮石斛根尖组织诱导出长势良好的愈伤组织，以愈伤组织进行定向筛选和驯化。获得供悬浮培养的高端粒酶活性铁皮石斛细胞系，实现铁皮石斛的大规模细胞培养。

发明内容

本发明提供一种铁皮石斛优良细胞系的建立及培养方法，目的是解决现有技术问题。本发明提供一种铁皮石斛分生组织悬浮细胞系分离和培养的方法，能够实现铁皮石斛的大规模细胞培养，能够使细胞培养规模化工厂生产，更适合后期其有效成分提取等工业生产步骤，对解决铁皮石斛资源短缺问题具有重大意义。

本发明解决问题采用的技术方案是：

1)①将铁皮石斛新生的根尖用自来水冲洗30分钟，将洗涤的组织置于超净工作太重的灭菌烧瓶中并用75％的乙醇表面消毒1分钟，然后将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。②然后将组织使用0.5％～10％次氯酸钠消毒5～10分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。③再次使用0.5％～10％次氯酸钠消毒3～5分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。

2)防褐变：将灭菌的铁皮石斛根置于含有抗氧化剂的褐变抑制培养基(表1)，然后摇瓶培养大约30分钟～1小时。然后，使用灭菌滤纸从组织中除去湿气。

表1 褐变抑制培养基

3)外植体的分离：将铁皮石斛根尖放入含抗氧化活性的切削液(表2)的灭菌盘中，去掉根冠，从切口开始切取1mm左右作为外植体，接种到WPM预培养基中培养30min。

表2 切削液

4)细胞端粒酶活性的提高：将组织放入1M蔗糖低温处理4～24小时，之后放入0.05M蔗糖溶液中处理5min，最后放入0.1M蔗糖溶液中处理5min，去除蔗糖，提高分生组织静止中心细胞高端粒酶活性；或者将组织进行超声处理10min，超声频率为25kHz-35kHz，提高分生组织静止中心细胞端粒酶活性。将获得的组织接种到MS为基本培养基(琼脂1％，蔗糖3％，pH5.8)，用2,4-D、NAA、KT、6-BA等激素进行组合处理进行愈伤组织的诱导(详见表3)。诱导过程中进行暗培养，培养温度25℃±1℃，空气湿度75％±5％。

表3 不同激素的组合

筛选得到最佳的培养基组合为0.5mg/L 2,4-D+0.25mg/L KT或者5mg/LNAA+0.5mg/L KT。

5)悬浮细胞系的建立：经过35天培养，铁皮石斛愈伤组织中静止中心高端粒酶活性细胞与其他根部组织细胞自然分离。从中挑选出生长状态较好的静止中心细胞，用镊子夹碎处理，促使细胞颗粒化，将其接种到液体培养基中悬浮培养(MS+NAA5mg/L+6-BA0.5mg/L+3％蔗糖)。初始悬浮培养时控制摇床转速在30-70r/min，温度25℃±1℃,光照强度2000lx(12h-18h/d)，视生长情况进行继代。

6)悬浮细胞系的筛选：通过4到5次继代以后，筛选出生长较快，分散较好的铁皮石斛悬浮细胞进一步扩增，使每个培养瓶的培养体系分散性较好，形态单一。

7)悬浮细胞的大规模培养：待悬浮细胞培养稳定后，按照15％到25％接种至大规模的通气悬浮培养生物反应器中，连续培养。光照强度2000-5000lx。大规模悬浮培养的培养基为MS培养基+生长素、细胞分裂素等混合比例组合，包括NAA3mg/L+KT1mg/L，NAA3mg/L+6-BA1mg/L或者IBA1.5mg/L+KT0.5mg/L。培养过程中，培养基每隔10-15天换一次。按照30％-80％收获率保存种源作连续培养

具体实施方式

实施例1

(1)消毒：①将铁皮石斛新生的根尖用自来水冲洗30分钟，将洗涤的组织置于超净工作太重的灭菌烧瓶中并用75％的乙醇表面消毒1分钟，然后将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。②然后将组织使用0.5％～10％次氯酸钠消毒5～10分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。③再次使用0.5％～10％次氯酸钠消毒3～5分钟，弃去消毒液，将组织用灭菌蒸馏水漂洗3～5次。

(2)防褐变：将灭菌的铁皮石斛根置于含有抗氧化剂的褐变抑制培养基(表1)，然后摇瓶培养大约30分钟～1小时。然后，使用灭菌滤纸从组织中除去湿气。

(3)外植体细胞的分离以及细胞端粒酶活性的提高：将铁皮石斛根尖放入含抗氧化活性的切削液(表2)的灭菌盘中，去掉根冠，从切口开始切取1mm左右作为外植体，接种到WPM预培养基中培养30min。然后将组织放入1M蔗糖低温处理4～24小时，之后放入0.05M蔗糖溶液中处理5min，最后放入0.1M蔗糖溶液中处理5min，去除蔗糖，提高分生组织静止中心细胞端粒酶活性。将获得的组织接种到MS为基本培养基(琼脂1％，蔗糖3％，0.5mg/L 2,4-D0.25mg/L KT，pH5.8)进行愈伤组织的诱导。诱导过程中进行暗培养，培养温度25℃±1℃，空气湿度75％±5％。

(4)悬浮细胞系的建立：经过35天培养，铁皮石斛愈伤组织中静止中心高端粒酶活性细胞与其他根部组织细胞自然分离。从中挑选出生长状态较好的静止中心细胞，用镊子夹碎处理，促使细胞颗粒化，将其接种到液体培养基中悬浮培养(MS+NAA5mg/L+6-BA0.5mg/L+3％蔗糖)。初始悬浮培养时控制摇床转速在30-70r/min，温度25℃±1℃,光照强度2000lx(12h-18h/d)，视生长情况进行继代。在培养的过程中，经过检测其生长速率可达到8-10mg/g·d。生长速率计算公式如下：生长速率＝(收获量-接种量)/(培养重量×培养天数)

(5)悬浮细胞系的筛选：通过4到5次继代以后，筛选出生长较快，分散较好的铁皮石斛悬浮细胞进一步扩增，使每个培养瓶的培养体系分散性较好，形态单一。

(6)悬浮细胞的大规模：待悬浮细胞培养稳定后，按照15％到25％接种至大规模的通气悬浮培养生物反应器中，连续培养，调节含氧量在30％-50％，pH在6-7之间，光照强度2000-5000lx。培养基中激素为NAA3mg/L+KT1mg/L，每隔15天更换培养基一次。

实施例2

(1)消毒：与实施例1步骤相同

(2)防褐变：与实施例1步骤相同

(3)外植体细胞的分离以及细胞端粒酶活性的提高：将铁皮石斛根尖放入含抗氧化活性的切削液(表2)的灭菌盘中，去掉根冠，从切口开始切取1mm左右作为外植体，接种到WPM预培养基中培养30min。然后将组织进行超声处理10min，超声频率为35kHz，以此提高组织细胞端粒酶活性。将获得的组织接种到MS为基本培养基(琼脂1％，蔗糖3％，，5mg/LNAA、0.5mg/L KT，pH5.8)进行愈伤组织的诱导。诱导过程中进行暗培养，培养温度25℃±1℃，空气湿度75％±5％。

(4)悬浮细胞系的建立：经过35天培养，铁皮石斛愈伤组织中静止中心高端粒酶活性细胞与其他根部组织细胞自热分离。从中挑选出生长状态较好的静止中心细胞，进行剪碎后酶解消化，促使单细胞悬浮，将其接种到液体培养基中悬浮培养(MS+NAA5mg/L+KT0.5mg/L+3％蔗糖)。初始悬浮培养时控制摇床转速在30-70r/min，温度25℃±1℃,光照强度2000lx(12h-18h/d)，视生长情况进行继代。在培养的过程中，经过检测其生长速率可达到10-12mg/g·d。生长速率计算公式如下：

(5)悬浮细胞系的筛选：同实施例1步骤相同

(6)悬浮细胞的大规模：待悬浮细胞培养稳定后，按照15％到25％接种至大规模的通气悬浮培养生物反应器中，连续培养，调节含氧量在30％-50％，pH在6-7之间，光照强度2000-5000lx。培养基中激素为IBA1.5mg/L+KT0.5mg/L，每隔15天更换培养基一次。

Claims (8)

1.一种铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)铁皮石斛外植体细胞分离，接种到WPM预培养基中培养；

2)将外植体进行高渗处理或者超声处理，以提高细胞端粒酶活性，处理后接种至诱导培养基中；

3)经诱导培养，取静止中心高端粒酶活性的细胞，使细胞颗粒化，接种至悬浮培养基上悬浮培养；

4)筛选出生长较快，形态单一的悬浮细胞于悬浮培养生物反应器中进行扩增；所述高渗处理是采用将组织放入1M蔗糖低温处理4～24小时，之后放入0.05M蔗糖溶液中处理5min，最后放入0.1M蔗糖溶液中处理5min，去除蔗糖，提高分生组织静止中心细胞端粒酶活性；所述超声处理是将组织进行超声处理10min，超声频率为25kHz-35kHz，诱导分生组织静止中心端粒酶活性增强。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，其特征在于，具体步骤为：

1)取铁皮石斛的根尖进行消毒和防褐变处理后，切除根冠，从切口开始截取1mm左右的根部组织作为外植体，接种到WPM预培养基中培养；

2)将外植体进行高渗处理或者超声处理，提高根部静止中心细胞的端粒酶活性，处理后接种至诱导培养基中；

3)经过35天诱导培养，铁皮石斛根部静止中心高端粒酶活性的细胞与根尖其他部分细胞分离，取根部静止中心高端粒酶活性的细胞，经过剪碎研磨、酶解在内的物理生物方法使细胞颗粒化，接种至悬浮培养基上悬浮培养；

4)筛选出生长较快，形态单一的悬浮细胞按照15％到25％接种至大规模的通气悬浮培养生物反应器中，连续培养进行扩增。

3.根据权利要求2所述的铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，其特征在于，所述消毒为自来水冲洗后75％的乙醇及0.5％～10％次氯酸钠消毒之后灭菌蒸馏水漂洗，所述诱导培养基为MS+NAA5mg/L+6-BA0.5mg/L+3％蔗糖或者MS+NAA5mg/L+KT0.5 mg/L+3％蔗糖。

4.根据权利要求2所述的铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，其特征在于，所述防褐变处理为将灭菌的铁皮石斛根置于含有抗氧化剂的褐变抑制培养基，然后摇瓶培养30分钟～1小时，然后，使用灭菌滤纸从组织中除去湿气。

5.根据权利要求4所述的铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，其特征在于，褐变抑制培养基的具体组分和含量为：1/4盐量WPM培养基+质量体积浓度1％的蔗糖+质量体积浓度0.5％的聚乙烯吡咯烷酮+100mg/L抗坏血酸+150mg/L柠檬酸，pH为5.8。

6.根据权利要求1或2所述的铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，其特征在于，所述步骤3)悬浮培养基为MS+NAA5mg/L+6-BA0.5mg/L+3％蔗糖或者MS+NAA5mg/L+KT0.5 mg/L+3％蔗糖,初始悬浮培养时控制摇床转速在30-70r/min，温度25℃±1℃,光照强度2000lx,光照周期12h-18h/d，视生长情况进行继代。

7.根据权利要求2所述的铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，其特征在于，所述步骤4)悬浮培养生物反应器中，连续培养，调节含氧量在30％-50％，pH在6-7之间，光照强度2000-5000lx，培养基为基本培养基+生长素和细胞分裂素，每隔15天更换培养基一次。

8.根据权利要求7所述的铁皮石斛悬浮细胞的分离和培养方法，其特征在于，所述生长素和细胞分裂素包括NAA3mg/L+KT1 mg/L，NAA3mg/L+6-BA1mg/L或者IBA1.5 mg/L+KT0.5mg/L。