CN105349592B - 代谢互补的植物细胞系混种培养生产次级代谢产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种代谢互补的植物细胞系混种培养生产次级代谢产物的方法，它是在单独采用一株细胞系生产目标产物基础上，使用两株或多株细胞系混合培养，在目标产物生产过程中进行代谢偶联，提高目标产物的产量。实验结果显示：采用两株细胞或多株系混合培养后，目标产物的产量比原来单株的产量提高了13%~90%。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞培养生产技术领域，具体涉及一种两个或多个代谢互补的植物细胞系混种培养方法。
背景技术
利用植物细胞培养生产次级代谢产物的工艺体系中，主要采用外植体诱导筛选生产次级代谢产物的细胞株，然后以纯种细胞株通过悬浮培养进行次级代谢产物的生产，在此工艺体系下，目标代谢产物的产量提高较困难，高产细胞株的筛选、关键中间产物的限制难以提高目标代谢物的产量，且底物和中间产物的添加成本较高。采用具有代谢能力互补的细胞系混种培养技术，从而有利于提高植物次级代谢产物的生产。
提高植物细胞培养生产目标产物的方法主要包括：添加诱导剂，诱导剂是能诱导植物防御反应的因素，能快速地、高度专一地和选择性地诱导特异基因的表达；添加合成目标产物的前体，可将前体看成是一种生化反应的底物，通过分析目标产物的合成途径，有选择的添加，可以加速目标产物的生化反应；添加抑制剂，使用抑制旁路代谢和其它相关次级代谢途径的抑制剂，可使代谢流更多地流向所需次级代谢产物。培养条件的控制，主要包括pH、温度、空气、光照、剪切力和离子溶度等物理参数的控制，为植物细胞的培养提供合适的培养条件；高产目标产物植物细胞株的筛选，采用诱导、诱变和转基因等手段进行筛选，利用植物细胞系之间的代谢偶联培养尚未见报道和应用。
通过对目标代谢产物的代谢路径分析，最终目标代谢产物具有复杂的结构，合成过程往往需要几十步的生物化学反应，底物、关键中间体和酶活力等的限制，造成目标产物的生成产量较低，植物细胞的培养主要采用大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、植物激素和糖等营养物质，各种植物细胞的培养均采用这些营养物质，在培养体系上具有很强的相似性，由于植物细胞间具有很强的信号传导性和代谢物质的快速运输性，通过利用植物细胞的特性进行混种培养，利用细胞间的信号传递和中间代谢物的运输和利用，从而促进目标代谢产物的合成。
发明内容
本专利通过采用两个或多个植物细胞系进行混合培养提高目标代谢物的产量，基于植物细胞系生物合成代谢途径的互补性，可以将一种可产目标产物的细胞系与一种或多种细胞系产生其合成目标产物的中间体的细胞系进行混合培养，提高目标产物的产量。
为实现上述目的，本发明公开了一种代谢互补的植物细胞系混种培养生产次级代谢产物的方法，其特征按如下的步骤进行：
（1）植物细胞系1，高产目标产物的中间体，培养条件为：B5培养基包括：生长素为2,4-D，含量1~10mg/L，分裂素为6-BA，含量为0.5~5mg/L，蔗糖浓度为10~50g/L，接种的细胞鲜重为50~200g/L，接种的为100%膜过滤新鲜B5培养基，继代生长周期为7~14天，培养温度为22~27℃，摇床转速为80~130rpm；
（2）植物细胞系2，高产目标产物，培养条件与植物细胞系1相似；
（3）将植物细胞系1和植物细胞系2，按照体积比为10:1~1:10混合后进行培养，培养条件与红豆杉细胞系1相似；
（4）培养结束后，将步骤（3）的混合细胞接种到目标产物生产培养基MS中，所述的MS培养基包括：分裂素为6-BA，含量为0.5~5mg/L，生长素为NAA，含量为1~20mg/L，蔗糖浓度为10~50g/L，接种的细胞鲜重为100~200g/L，接种的为膜过滤100%新鲜MS培养基，培养条件为：培养温度为22~27℃，摇床转速为80~130rpm，培养周期为21-45天；
（5）在培养的第4~8天添加甲基茉莉酸50~200μM，第6~12天添加硫代硫酸银5~20mM，在培养的第14天开始每隔两天进行一次取样，测定细胞量、细胞活性、pH、电导率、残糖、溶氧、目标产物中间体和目标产物的产量；
（6）培养过程中目标产物生产培养基MS的糖浓度控制在10~25g/L之间，电导率控制在1.5~3mS/cm之间；取样检测后，根据测定的值进行补加糖和无机盐；所述的补加糖是指蔗糖，所指的无机盐是MS基础培养基中的大量元素组合（MS是标准的常规组合）。
本发明所述生产次级代谢产物的方法，其中的植物细胞系1，指的是生产目标产物中间体的细胞系。植物细胞系2，指的是生产目标产物的细胞系。混种培养工艺指的是-植物细胞系1与植物细胞系2，按照体积比为10:1到1:10的比例混合。该混合培养比单独使用生产目标产物的细胞系提高产量达至少13%~90%。
本发明的重点在于：
植物细胞系生物合成代谢途径的互补性；可以将一种可产目标产物的细胞系与一种或多种细胞系产生其合成目标产物的中间体的细胞系进行混种培养；细胞可以是同一种属，也可是不同种属；混合培养体系的构建方法和结构，主要包括：
（1）混种方式：将生产目标产物中间体的植物细胞系1和生产目标产物的植物细胞系2进行混合培养，得到混合细胞系，然后进行调控生产目标产物。
（2）混种方式：将多种生产目标产物中间体的植物细胞系和生产目标产物的植物细胞系进行混合培养，得到混合细胞系，然后进行调控生产目标产物。
（3）混种方式：将将多种生产目标产物中间体的植物细胞系和生产目标产物的植物细胞系进行单独培养，然后将每种细胞接入到目标产物生产培养基中，进行调控生产目标产物。
本发明公开的代谢互补的植物细胞系混种培养生产目标产物的方法的实施例是采取方式（1），与现有方案所不同的关键点在于：
在单独采用一株细胞系生产目标产物基础上，使用两株或多株细胞系混合培养，在目标产物生产过程中进行代谢偶联，提高目标产物的产量。实验结果显示：采用两株细胞或多株系混合培养后，目标产物的紫杉醇产量由原来的50mg/L提高到了87~95mg/L，提高了74%~90%，而白藜芦醇的产量由1.7g/L提高到1.9g/L，提高了13%。
对比试验：
一株细胞系生产紫杉醇的产量达到50mg/L。另一株细胞系生产白藜芦醇的产量达到了1.7g/L。
附图说明：
图1为红豆杉细胞中紫杉醇生物合成路线图；
图2为两株植物细胞系混种培养方式的工艺流程图；
图3为多株植物细胞系混种培养方式的工艺流程图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用到的试剂及原料均有市售。
特别说明的是：MS培养基是1962年穆拉希吉克(Murashige，T.)和斯科克（Skoog，F.）为培养菸草材料而设计的，它对在固体培养条件下诱导愈伤组织，在液体培养条件下作细胞悬浮培养及用于胚、茎尖、茎段及花药等的培养和形态发生研究方面，均获得了明显的成功。MS培养基中无机养份的数量和比例均较合适，足以满足很多植物细胞在营养和生理上的需要。
B5培养基是甘博格(Gamborg)等1968年设计的，它的主要特点是含有较低的铵，而铵这一营养成分可能对有些培养基有抑制生长的作用。当在愈伤组织和悬浮培养中对B5培养基与MS培养基进行对比培养试验时，发现有些植物的愈伤组织和细胞培养物在MS培养基上生长得好，而有些在B5培养基上生长得更适宜。
MS和B5都是植物细胞培养常见的培养基配方，本发明中所用的基本培养基，都是包括MS和B5标准配方中的大量元素组合、微量元素、有机物以及pH控制，但对植物激素、蔗糖含量和其他添加物有不同的规定，具体见各实施例。
实施例1
（1）红豆杉细胞系1（Taxus wallichiana var. mairei CGMCC no10001）能够合成10DAB，10DAB是合成紫杉醇的中间产物，且在代谢路径上是合成紫杉醇的关键代谢物，培养条件为：培养基为B5培养基，其中生长素为2,4-D，含量10mg/L，分裂素为6-BA，含量为1mg/L，蔗糖浓度为15g/L，接种的细胞鲜重为100g/L，接种的为100%新鲜膜过滤B5培养基，继代生长周期为14天，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm;
（2）红豆杉细胞系2（Taxus wallichiana var. mairei CGMCC no10002）能够合成紫杉醇，培养条件与红豆杉细胞系1相同；
（3）将红豆杉细胞系1和红豆杉细胞系2，按照体积比为1:1混合后进行培养，培养条件为：培养温度为25℃，摇床转速为100rpm，培养周期为14天；
（4）培养结束后，将混合细胞接种到MS紫杉醇生产培养基中，培养条件为：培养温度为25℃，摇床转速为100rpm，培养周期为28天；
（5）在培养的第4天添加甲基茉莉酸100μM，第7天添加硫代硫酸银10mM，在培养的第14天开始每隔两天进行一次取样，测定细胞量、细胞活性、pH、电导率、残糖、10DAB和紫杉醇的产量；
（6）培养过程中紫杉醇生产培养基MS的糖浓度控制在10~25g/L之间，电导率控制在1.5~3mS/cm；取样检测后，根据测定的值进行补加糖和无机盐。
（7）两株细胞在紫杉醇生产过程中进行代谢偶联，生产紫杉醇的细胞系利用另一个细胞系生产的中间体合成紫杉醇，同时调节终产物对细胞系的代谢抑制，最终提高紫杉醇的产量。单独采用红豆杉细胞系2合成紫杉醇的产量为50mg/L，采用红豆杉细胞系1和2混合培养合成紫杉醇的产量达到87mg/L，紫杉醇的产量提高了74%。
实施例2
（1）红豆杉细胞系1（Taxus wallichiana var. mairei CGMCC no.10001）能够合成10DAB，10DAB是合成紫杉醇的中间产物，且在代谢路径上是合成紫杉醇的关键代谢物，培养条件为：培养基为B5培养基，其中生长素为2,4-D，含量10mg/L，分裂素为6-BA，含量为1mg/L，蔗糖浓度为15g/L，接种的细胞鲜重为100g/L，接种的为100%新鲜膜过滤B5培养基，继代生长周期为14天，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm；
（2）红豆杉细胞系2（Taxus wallichiana var. mairei CGMCC no.10002）能够合成紫杉醇，培养条件与红豆杉细胞系1相同；
（3）红豆杉细胞系3（Taxus wallichiana var. mairei P-13-1 ）能够合成BATIII，BAT III是合成紫杉醇的中间产物，且在代谢路径上是合成紫杉醇的关键代谢物，培养条件与红豆杉细胞系1相同；
（4）将红豆杉细胞系1、2和3在第14天培养结束后，在生物安全柜中，进行无菌操作，使用筛网将细胞和培养液分离。将红豆杉细胞系1分离的细胞、红豆杉细胞系2分离的细胞和红豆杉细胞系3分离的细胞按照1:2:1的比例混合后，进行培养，培养条件与红豆杉细胞系1相同，得到混种细胞系；
（5）调控生产：将混种细胞系接入到MS紫杉醇生产培养基中，培养条件为：培养温度为25℃，摇床转速为100rpm，培养周期为28天。在培养的第4天添加甲基茉莉酸100μM，第7天添加硫代硫酸银10mM，在培养的第14天开始每隔两天进行一次取样，测定细胞量、细胞活性、pH、电导率、残糖、10DAB、BAT III和紫杉醇的产量。培养过程中紫杉醇生产培养基MS的糖浓度控制在10~25g/L之间，电导率控制在1.5~3mS/cm；取样检测后，根据测定的值进行补加糖和无机盐；所所述的补加糖是指蔗糖，所指的无机盐是MS基础培养基中的大量元素组合（常规组合）。
（6）三株细胞在紫杉醇生产过程中进行代谢偶联，生产紫杉醇的细胞系利用另两个细胞系生产的中间体合成紫杉醇，同时调节终产物对细胞系的代谢抑制，最终提高紫杉醇的产量，其中10DAB是BAT III合成的中间体，同时二者又都是紫杉醇合成的中间体，单独采用红豆杉细胞系2合成紫杉醇的产量为50mg/L，采用红豆杉细胞系1、2和3混合培养合成紫杉醇的产量达到95mg/L，紫杉醇的产量提高了90% 。
实施例3
（1）葡萄细胞系1（Vitis vinifera L VV1000），能够合成白藜芦醇，培养条件为：培养基为B5培养基，其中生长素为KT，含量2mg/L，分裂素为NAA，含量为1mg/L，蔗糖浓度为30g/L，接种的细胞鲜重为100g/L，接种的为100%新鲜膜过滤B5培养基，继代生长周期为7天，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm；
（2）红豆杉细胞系2（Taxus wallichiana var. mairei CGMCC no10002）能够合成紫杉醇，培养条件为：培养基为B5培养基，其中生长素为2,4-D，含量10mg/L，分裂素为6-BA，含量为1mg/L，蔗糖浓度为15g/L，接种的细胞鲜重为100g/L，接种的为100%新鲜膜过滤B5培养基，继代生长周期为14天，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm；
（3）在培养结束后，在生物安全柜中，进行无菌操作，使用筛网将细胞和培养液分离，得到葡萄细胞系1和红豆杉细胞系2；
（4）将葡萄细胞系1和红豆杉细胞系2按照5:1的比例，接种到白藜芦醇生产培养基中， 培养条件为：培养温度为25℃，摇床转速为100rpm，培养周期为28天，
（5）在培养的第6天添加甲基茉莉酸200μM，在培养的第14天开始每隔两天进行一次取样，测定细胞量、细胞活性、pH、电导率、残糖、白藜芦醇和紫杉醇的产量。
（6）培养过程中白藜芦醇生产培养基的糖浓度控制在20~30g/L之间，电导率控制在1.5~3mS/cm范围内；取样检测后，根据测定的值进行补加糖和无机盐。
（7）两株细胞在白藜芦醇生产过程中进行代谢偶联，生产白藜芦醇的细胞系利用另一个细胞系生产的紫杉醇进行代谢调控，同时利用其代谢信号分子进行调控，最终提高白藜芦醇醇的产量。单独采用葡萄细胞系1合成白藜芦醇的产量为1.5g/L，采用葡萄细胞系1和红豆杉细胞系2混合培养合成白藜芦醇的产量达到1.7g/L，白藜芦醇的产量提高了13%，紫杉醇的产量也有所提高。
参考文献
[1] Parayil Kumaran Ajikumar 等Isoprenoid Pathway Optimization forTaxol Precursor Overproduction in Escherichia coli，Science 330 (2010)：70-74;
[2] BRINGI,Venkataraman（美国）等，提高红豆杉细胞培养中紫杉醇和紫杉烷产量的方法，国际专利，WO 97/44476.
[3] Homare Tabata（日本）, Paclitaxel Production by Plant-Cell-CultureTechnology, Adv Biochem Engin/Biotechnol (2004) 7: 1–23.
[4] 王丽等，具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株及其应用，中国专利201410726274.9。
[5] 张卫等，具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株及其应用，中国专利201410726199.6
[6] Koji Saito等，process for production taxol by cell culture oftaxus species，国际专利，WO 97/44476.
[7] 崔亨均(韩国)等，通过半连续培养大量生产紫杉醇的方法，中国专利96190419.4及CN1153533。
Claims (2)
1.一种代谢互补的植物细胞系混种培养生产次级代谢产物的方法，其特征按如下的步骤进行：
（1）植物细胞系1，高产目标产物的中间体，培养条件为：B5培养基包括：生长素为2,4-D，含量1~10mg/L，分裂素为6-BA，含量为0.5~5mg/L，蔗糖浓度为10~50g/L，接种的细胞鲜重为50~200g/L，接种的为100%膜过滤新鲜B5培养基，继代生长周期为7~14天，培养温度为22~27℃，摇床转速为80~130rpm；所述的植物细胞系1为Taxus wallichiana var. mairei，其保藏编号CGMCC no10001；
（2）植物细胞系2，高产目标产物，培养条件与植物细胞系1相同；所述的植物细胞系2为： Taxus wallichiana var. mairei，其保藏编号CGMCC no10002；
（3）将植物细胞系1和植物细胞系2，按照体积比为10:1~1:10混合后进行培养，培养基为B5培养基，其中生长素为2,4-D，含量10mg/L，分裂素为6-BA，含量为1mg/L，蔗糖浓度为15g/L，接种的细胞鲜重为100g/L，接种的为100%新鲜膜过滤B5培养基，继代生长周期为14天，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm；
（4）培养结束后，将步骤（3）的混合细胞接种到目标产物生产培养基MS中，所述的MS培养基包括：分裂素为6-BA，含量为0.5~5mg/L，生长素为NAA，含量为1~20mg/L，蔗糖浓度为10~50g/L，接种的细胞鲜重为100~200g/L，接种的为膜过滤100%新鲜MS培养基，培养条件为：培养温度为22~27℃，摇床转速为80~130rpm，培养周期为21-45天；
（5）在培养的第4~8天添加甲基茉莉酸50~200μM，第6~12天添加硫代硫酸银5~20mM，在培养的第14天开始每隔两天进行一次取样，测定细胞量、细胞活性、pH、电导率、残糖、溶氧、目标产物中间体和目标产物的产量；
（6）培养过程中目标产物生产培养基MS的糖浓度控制在10~25g/L之间，电导率控制在1.5~3mS/cm之间；取样检测后，根据测定的值进行补加糖和无机盐。
2.权利要求1所述代谢互补的植物细胞系混种培养生产次级代谢产物的方法在提高紫杉醇产量方面的应用。
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