CN106035090B - 一种春兰根状茎组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

一种春兰根状茎组织培养快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物生物技术领域。通过培养基的设计，实现春兰根状茎的快速繁殖和分化。其过程包括将无菌春兰根状茎接种至增殖培养基中，增殖9倍，转至分化培养基中，15天后有幼芽的分化，获得春兰试管苗。本发明方法使用的两种培养基，所用成分均为常规培养基成分，但却可以大大减少根状茎和培养基的褐化率。本发明方法培养周期短，可以节约培养基成本、人工成本，水电成本。适合于春兰的工厂化育苗，解决其传统繁殖效率低、周期长等问题。

Description

一种春兰根状茎组织培养快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体为春兰的根状茎组织培养快速繁殖方法。
背景技术
春兰又名草兰、扑地兰、朵香等，属于兰属中的地生种。春兰植株小，叶片较细狭，花色通常以绿色和黄色为主。花被上有紫红色条纹或斑点，多数春兰花香浓郁、色彩淡雅、花姿优美、叶态飘逸，是庞大兰科家族中独特的种属，也是我国兰属植物的主要类群之一,分布广、资源丰富、栽培历史悠久。具有极高的观赏价值、药用价值和收藏价值。其市场需求十分旺盛，野生春兰遭到过度采挖，野生自然资源急剧减少，是国家重点保护的野生植物之一。
为保护春兰野生资源、满足市场需求，解决春兰的快速繁殖势在必行。春兰种子没有胚乳，自然条件下极难萌发。春兰传统上主要靠分株繁殖，但繁殖周期长而且繁殖率低，不能形成规模种植，繁殖的兰花品质也不高，无法满足当今社会的需求。所以，具有繁殖速度快、周期短、可以规模化生产等优点的植物组织培养技术是春兰快速繁殖的一条有效且重要的途径。兰科植物组织培养的过程中，由种子诱导出的原球茎进一步生长伸长即成为根状茎，根状茎是国兰快速增殖的良好材料，是快速繁殖提高增殖系数的关键。但春兰在离体培养特别是批量培养时，根状茎增殖速度慢，分化形成的苗少，且培养过程中容易发生褐化导致一部分外植体死亡。因此探究春兰根状茎增殖培养基和分化培养基的优化可以极大的促进春兰繁殖，利于扩大春兰市场。本发明旨在找到一种春兰根状茎快速增殖和分化、并能有效减少褐化率的培养基，缩短培养周期、降低生产成本，使春兰实现规模化生产，满足市场需求。
发明内容
本发明针对现有技术中春兰组织培养周期长、褐化率高、生产成本高的不足，提供一种春兰根状茎组织培养快速繁殖方法。本发明通过培养基的设计，实现春兰的快速繁殖，其过程包括准备春兰无菌根状茎、春兰根状茎的增殖和春兰根状茎的分化。
本发明一种春兰根状茎组织培养快速繁殖方法，按以下步骤进行：
(1)准备无菌根状茎：准备无菌，生长状态良好的有分枝的根状茎，直径约为2mm，切成1cm长度备用；
(2)根状茎增殖：将无菌春兰根状茎接种至增殖培养基中，所述增殖培养基配方：1/2MS+NAA 9mg/L+香蕉汁50g/L+梨汁100g/L+猕猴桃汁100g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+活性炭1g/L，pH5.8；60天后增殖9倍左右；
(3)根状茎分化：将增殖了60天的1cm长的根状茎转至分化培养基中，15天后有幼芽的分化，60天后可长成较大小芽，每个根状茎小芽数量平均3-4个左右；所述分化培养基配方：1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L+维生素C 0.45mg/L+维生素E 0.05mg/L+柠檬酸钠1g/L+山梨酸钾0.15g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.8。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
(1)本发明方法使用的外植体为春兰根状茎，接种容易且不易污染，增殖分化速度快，增殖率高，外植体和培养基的褐化率低，不需要频繁的继代接种，就可长成较大小苗。
(2)本发明方法使用的增殖培养基添加的天然复合物猕猴桃和梨汁可以促进根状茎细胞的分裂，从而达到快速增殖的目的。
(3)本发明方法使用的分化培养基添加了维生素C、维生素E、柠檬酸钠和山梨酸钾，其复合使用能促进根状茎快速分化成芽，并防止根状茎和培养基褐化。
附图说明
图1为春兰根状茎在不同的增殖培养基上增殖；
A为在无猕猴桃和梨汁培养基(A)上根状茎的增殖；
B为在有猕猴桃和梨汁培养基(B)上根状茎的增殖；
图2为春兰根状茎在不同的分化培养基上分化；
A为在无维生素C、维生素E、柠檬酸钠和山梨酸钾培养基(C)上根状茎的分化；
B为在有维生素C、维生素E、柠檬酸钠和山梨酸钾培养基(D)上根状茎的分化；
图3为生长壮大的春兰试管苗；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明所用春兰根状茎来自武汉生物工程学院科研楼细胞工程实验室。
所用试剂采购厂家分别为：1/2MS粉末：上海宇涵生物科技有限公司；NAA：北京康倍斯科技有限公司；蔗糖：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；琼脂：北京康倍斯科技有限公司；活性炭：北京康倍斯科技有限公司。
【实施例1】准备两种培养基：
增殖培养基(A)：1/2MS+NAA 9mg/L+香蕉汁50g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+活性炭1g/L，pH5.8；(B)：1/2MS+NAA 9mg/L+香蕉汁50g/L+梨汁100g/L+猕猴桃汁100g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+活性炭1g/L，pH5.8。
分化培养基(C)：1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，(D)：1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+维生素C 0.45mg/L+维生素E 0.05mg/L+柠檬酸钠1g/L+山梨酸钾0.15g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.8。
增殖培养基制备(以一升为例)：(A)培养基：取300ml左右蒸馏水加热，当有小气泡出现时，加入7g琼脂，搅拌均匀，溶解完全后，再加入蔗糖30g和1/2MS 2.37g，搅拌至溶解完全，加入植物生长调节剂NAA 9mg；(B)培养基：在(A)培养基的基础上，再添加香蕉50g、梨100g、猕猴桃100g一起榨汁后加入上述制备液，再加入柠檬酸钠1g，定容到1L，调节pH为5.8。各自分装到兰花瓶中，装量为100ml/瓶，各为10瓶。
分化培养基制备(以一升为例)：(C)培养基：取300ml左右蒸馏水加热，当有小气泡出现时，加入7g琼脂，搅拌均匀，溶解完全后，再加入蔗糖30g和1/2MS 2.37g，搅拌至溶解完全，加入植物生长调节剂NAA 0.5mg，6-BA 0.1mg；(D)培养基：在(C)培养基的基础上，再添加维生素C 0.45g，维生素E 0.05g，柠檬酸钠1g，山梨酸钾0.15g，定容到1L，调节pH为5.8。各自分装到兰花瓶中，装量为100ml/瓶。
【实施例2】春兰根状茎组织培养快速繁殖
1、准备无菌根状茎：准备无菌，生长状态良好的有分枝的根状茎，直径约为2mm，切成1cm长度备用。
2、春兰根状茎增殖：
根状茎增殖：将1cm长度春兰根状茎分别转入增殖培养基(A)和(B)，每瓶1g，将根状茎材料用无菌纸巾擦拭掉水和培养基，称量后均匀接种于培养基表面，25℃，光照2000Lx，12小时/天。60天之后取出瓶内根状茎擦拭水分和残留培养基后进行称量，记录(A)和(B)培养基上各自根状茎的重量。(B)培养基上根状茎重量比60天前接种时增加9.23倍，而(A)培养基上根状茎重量只比60天前接种时增加2.48倍，如图1所示。
3、春兰根状茎分化：
根状茎分化：1cm长度春兰根状茎分别转入分化培养基(C)和(D)，每瓶18个，培养室培养。25℃，光照2000Lx，12小时/天。约15天，根状茎开始分化，约60天，小芽长至2-3cm。记录(C)和(D)培养基上根状茎的数目，(C)培养基上每个根状茎小芽的数目为2.2，根状茎发白，培养基出现褐化现象，这时候(C)培养基上根状茎急需继代，让小芽继续生长。而(D)每个根状茎小芽的数目为3.5，根状茎还为绿色，培养基为白色，没有出现褐化现象，如图2所示。这时候(D)培养基上根状茎不需继代，小芽还可以继续在原来培养基上生长，大大减少了组织培养继代接种的工作量，如图3所示。

Claims (1)

1.一种春兰根状茎组织培养快速繁殖方法，是以春兰的根状茎为外植体，包括准备春兰无菌根状茎、春兰根状茎的增殖和春兰根状茎的分化，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)准备无菌根状茎：准备无菌，生长状态良好的有分枝的根状茎，直径为2mm，切成1cm长度备用；
(2)根状茎增殖：将无菌春兰根状茎接种至增殖培养基中，所述增殖培养基配方：1/2MS+NAA 9mg/L+香蕉汁50g/L+梨汁100g/L+猕猴桃汁100g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+活性炭1g/L，pH5.8；60天后增殖9倍；
(3)根状茎分化：将增殖了60天的1cm长的根状茎转至分化培养基中，15天后有幼芽的分化，60天后可长成较大小芽，每个根状茎小芽数量平均3-4个；所述分化培养基配方：1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L+维生素C 0.45mg/L+维生素E 0.05mg/L+柠檬酸钠1g/L+山梨酸钾0.15g/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.8。
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