CN114303954B

CN114303954B - 墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法

Info

Publication number: CN114303954B
Application number: CN202210007392.9A
Authority: CN
Inventors: 钱丽华; 傅巧娟; 李春楠; 张晓莹; 赵福康; 阮若昕
Original assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Current assignee: Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2042-01-06
Also published as: CN114303954A

Abstract

本发明公开了一种墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法，包括以下步骤：1)、选择经墨兰×春兰杂交后代种子无菌萌发形成的根状茎并增殖培养获得的根状茎；2)、将步骤1)所得的根状茎切割成1～1.5cm长，平放在分化培养基上，置于培养室黑暗培养；获得带有圆锥形芽点的根状茎段；3)、将步骤2)所得的带有圆锥形芽点的根状茎段转入光照培养条件下培养。本发明以墨兰和春兰杂交种子经无菌萌发形成的根状茎为试验材料，通过其适宜的培养条件，获得较高的成苗率，且根状茎只分化成苗而不增殖，既解决了根状茎成苗率低，又解决了在分化成苗同时进行大量增殖的烦恼。

Description

墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种墨兰×春兰杂交后代根状茎分化成苗的方法。

背景技术

中国兰花高雅幽香，具有很高的观赏和经济价值，同时也具有悠久的栽培历史，逐渐形成了独特的兰花文化。但中国兰花品种改良进程缓慢，主要的育种手段仍为传统的系统选育，为加快兰花育种进程，高校、科研院所甚至一些公司都开始开展中国兰杂交育种，由于国兰种子无胚乳，自然条件掉落土壤萌发率极低且所需时间长，借助组织培养等生物技术手段则可以加快杂交后代的选育，而组织培养中国兰或其杂交后代必经的发育阶段根状茎能否高频成苗则是兰花杂交育种和组织培养产业化的“卡脖子”问题，且不同的国兰品种以及杂交后代根状茎的分化能力也存在较大的差异。

CN110338059A公开了一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法，该发明公开了在常规公开的国兰增殖培养基中添加适当浓度的硫酸铜能显著提高根状茎增殖率和分化率，添加6mg·L^-1硫酸铜，“玉香兰”根状茎芽分化率为85.63％，平均每条根状茎(1cm左右)分化芽数1.01±0.02个，添加2mg·L^-1硫酸铜，“达摩”墨兰平均每g芽分化数22.4个，成苗率25.42％。总体根状茎分化成苗率偏低，不利于国兰组培产业化发展。

CN110313401A公开了一种促进企剑白墨墨兰组织培养过程中芽分化的方法，该发明公开了在芽分化培养基中同时添加6-BA和Yucasin，促进了激素相关基因的表达并引起内源激素微环境的改变，从而促进企剑白墨墨兰根状茎的芽分化，但未描述其根状茎芽分化率达到多少。

CN105875410A公开了一种墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的快速繁殖方法，以墨兰与虎头兰的杂交兰无菌苗基部组织为材料，在含有多种植物生长调节剂和附加物的诱导培养基中进行诱导培养获得原球茎，将获得的原球茎进行增殖与分化培养，再进行壮苗、生根，移栽。增殖与分化培养基包括：MS基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤2.0～3.0mg/L，激动素0.2～0.5mg/L，萘乙酸0.5～1.0mg/L，水解酪蛋白0.5～1.5g/L，活性炭0.1～0.5g/L，蔗糖30～40g/L和琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.8。

需要说明的是：CN105875410A涉及的是原球茎，准确地讲是类原球茎。在兰花领域，原球茎是指由兰科植物种子萌发形成的球形或椭圆形的结构(詹忠根等，兰科植物原球茎(类原球茎)的形态建成，2002)。由兰科植物茎尖、叶片、根尖、茎节切断及花序枝通过组织培养后形成的类似原球茎的结构，称为类原球茎(詹忠根等，兰科植物原球茎(类原球茎)的形态建成，2002)。兰花种子在无菌培养萌发过程中的形态发生也存在差异。附生兰的种子萌发初始形成白色的圆球形的原球茎，随着原球茎体积的增大其上出现毛状假根继而原球茎体转为绿色，但原球茎不伸长，在原球茎顶端出现芽，长大分化出茎和叶，因此原球茎是附生兰组织培养中主要的发育阶段且是用于大量增殖的材料；地生兰的种子萌发时种子中的胚突破种皮后，开始呈白色圆球形，但很快就伸长形成长柱形成为地下茎或根状茎，在根状茎表面有间隔地长出一丛丛毛状假根根状茎的顶芽分化出芽(王卜琼等，2006)，因此根状茎是地生兰组织培养中主要的发育阶段且是用于大量增殖的材料。且墨兰属于兰属建兰亚属建兰组，是地生兰，虎头兰属于兰属大花亚属大花组，是附生兰。按该专利的说明两者的杂交后代更倾向于附生兰，因此是通过原球茎进行增殖和分化的。

而，墨兰和春兰都属于国兰，都是地生兰，国兰杂交后代基本经过根状茎阶段，因此不适用于上述方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法，包括步骤1)、选择经墨兰×春兰杂交后代种子无菌萌发形成的根状茎并增殖培养获得的根状茎(粗壮根状茎)；还包括如下步骤：

2)、将步骤1)所得的根状茎(粗壮根状茎)切割成1～1.5cm长，平放在分化培养基上，置于培养室培养；

分化培养基为MS或1/2MS+1～3mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5.5g·L^-1琼脂粉；培养温度为25±2℃，黑暗培养30～31天，获得带有圆锥形芽点的根状茎段；

3)、将步骤2)所得的带有圆锥形芽点的根状茎段转入光照培养条件下培养120±5d；

光照培养光周期为12h·d^-1，培养温度为25±2℃，光照强度1500～2000Lx。

上述培养温度优选25±1℃。

作为本发明的墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法的改进：分化培养基中，6-BA为2～3mg·L^-1。

作为本发明的墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法的进一步改进，步骤2)中：将步骤1)所得的根状茎(粗壮根状茎)刮去表面粘附的增殖培养基所含的琼脂，再进行切割。

本发明的步骤1)为按照常规技术，在超净工作台上选择经墨兰×春兰杂交后代种子无菌萌发形成的根状茎并增殖培养获得的粗壮根状茎；无菌萌发培养基参照《春兰杂交种子无菌萌发及植株再生培养技术》(马辉等，2017)，根状茎增殖培养参照《春兰组培快繁及其试管开花影响因素研究》(漆子钰，2017)。

步骤2)中：每瓶接种根状茎6～12根。

需要强调的是：墨兰和春兰都属于国兰，都是地生兰，国兰杂交后代基本经过根状茎阶段，本发明属于根状茎阶段的分化成苗，根状茎与原球茎的区别在于是兰科植物组织培养中不同的发育形态，这与兰花本身的特性有关，即地生兰种子无菌萌发一般经过根状茎阶段，而附生兰种子无菌萌发一般经过原球茎阶段，根状茎分化成苗能力一直是兰花组织培养中的难点，因此本行业公认原球茎与根状茎的分化培养基以及培养方法不具备通用性。

本发明的墨兰×春兰杂交后代根状茎分化成苗的方法，不增加兰花组培步骤，通过调整墨兰×春兰杂交后代根状茎培养的培养基(分化培养基)配方及光照等培养条件来提高墨兰×春兰杂交后代根状茎分化成苗率，扩大杂交后代群体，促进杂交选育新品种，本发明的方法培养后根状茎只分化不增殖，从而解决国兰杂交后代根状茎分化培养中增殖多分化少的烦恼。

本发明采用合适的根状茎分化培养基及培养条件，提高了墨兰×春兰杂交后代根状茎的分化成苗率，这为今后加快国兰杂交育种和种苗产业化发展起到奠定了良好的基础。

本发明具有如下技术优势：

1、克服了技术偏见，取消了活性炭的使用；因为活性炭会导致墨兰×春兰杂交后代“根状茎不分化”。

2、分化培养时，采用先黑暗后光照的培养方式。避免了始终采用10h/d～12h/d的常规光照培养方式；因为上述始终常规光照的培养方式易导致根状茎分泌大量酚类物质，氧化成醌类物质导致培养基褐化，从而影响根状茎生长和分化。

3、筛选出了墨兰×春兰杂交后代根状茎分化成苗的激素浓度配比，在该配比培养基上，有利于根状茎朝着分化苗的方向发展。

综上，本发明以墨兰(Cymbidium sinense)和春兰(Cymbidium goeringii)杂交种子经无菌萌发形成的根状茎为试验材料，通过其适宜的培养条件，获得较高的成苗率，且根状茎只分化成苗而不增殖，既解决了根状茎成苗率低，又解决了在分化成苗同时进行大量增殖的烦恼。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为在分化培养基培养上诱导出的圆锥形芽；

图2为圆锥性芽点开始伸长，分化出叶片；

图3为添加不同浓度活性炭对墨兰企黑×春兰大唐杂交后代根状茎分化成苗的影响；

图4为在分化培养基中分化的小苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下实施例中：

无菌萌发培养基，参照《春兰杂交种子无菌萌发及植株再生培养技术》(马辉等，2017)，具体为：1/2MS+0.5mg·L^-1NAA+0.5g·L^-1蛋白胨+20g·L^-1蔗糖+0.5g·L^-1活性炭+7.0g·L^-1琼脂，p H值5.1～5.4。

根状茎增殖培养基，参照《春兰组培快繁及其试管开花影响因素研究》(漆子钰，2017)。具体为：3.0g·L^-1花宝2号+0.5mg·L^-1 6-BA+3.0mg·L^-1NAA+1.0g·L^-1蛋白胨+1.0g·L^-1活性炭+30.0g·L^-1白砂糖+7.0g·L^-1琼脂。

本发明的分化培养基的设计和配制：

基本分化培养基为MS+蔗糖30.0g·L^-1+琼脂粉5.5g·L^-1(pH＝5.8～6.0)，在此培养基中分别添加1～3mg·L^-16-BA，0.1～0.2mg·L^-1NAA进行分化试验；同时在添加1mg·L^- ¹6-BA，0.2mg·L^-1NAA的培养基中添加活性炭浓度为0g·L^-1、0.1g·L^-1、0.2g·L^-1、0.3g·L^-1、0.6g·L^-1进行根状茎分化试验；此外还设计了不同基础培养基1/2MS及MS对根状茎分化的影响。

实施例1、一种墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法，依次进行以下步骤：

1)、根状茎的获得：将墨兰企黑×春兰大唐杂交种子经无菌萌发形成的根状茎，经增殖培养基培养获得大量的根状茎，作为用于分化培养的材料。

此步骤1)种子无菌萌发可参照《春兰杂交种子无菌萌发及植株再生培养技术》(马辉等，2017)》，根状茎增殖可参照《春兰组培快繁及其试管开花影响因素研究》(漆子钰，2017)。

具体为：

无菌萌发为：将墨兰企黑×春兰大唐杂交种子用75％乙醇表面消毒2min后转入0.1％升汞溶液中浸泡10～15min，用无菌水清洗4～5遍，在超净台上用解剖刀一切为二，将种子抖落在萌发培养基上，于黑暗、培养温度25～28℃的工艺条件下无菌萌发，萌发后见光培养12h/d，直至获得新鲜且生长良好的根状茎，培养时间约为180～240天；

增殖培养为：将上述无菌萌发所得的根状茎，于超净台上切成1cm左右的茎段且切掉茎尖，平放在增殖培养基上，于光培养12h/d、培养温度25～28℃的工艺条件下增殖培养，直至获得新鲜、较粗壮且一级分枝长度达到2.0cm以上的根状茎(粗壮根状茎)，培养时间约为120～150天；

2)、根状茎的分化培养：在超净工作台上选择粗壮根状茎，刮去表面的琼脂，切成1.5cm长，平放在分化培养基上，每瓶接种6～8根，置于培养室培养。

所用分化培养基为以下任一：

分化培养基Ⅰ、MS+1mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5.5g·L^-1琼脂粉；

分化培养基Ⅱ、1/2MS+1mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5.5g·L^-1琼脂粉；

本步骤中，培养温度为25±1℃，为黑暗培养；培养时间为30天，此时根状茎段上长出圆锥形芽点，因此黑暗培养后，获得了带有圆锥形芽点的根状茎段。

3)、而后，将步骤2)所得的带有圆锥形芽点的根状茎段转入培养光照条件下培养120d；本步骤中光照培养光周期为12h·d^-1，培养温度为25±1℃，光照强度2000Lx。

4)、在分化培养基中总共培养150d后，统计每段根状茎分化的芽数和成苗数，计算每段根状茎平均分化芽数和成苗数。

根状茎平均分化芽数＝分化的芽点数/接种的根状茎数

根状茎平均分化成苗数＝分化的苗数/接种的根状茎数。

所得结果如下表1所述。

表1、不同基础培养基对墨兰企黑×春兰大唐后代根状茎芽分化和成苗的影响

	基础培养基	平均分化芽点数(个)	平均分化成苗数(个)
				分化培养基Ⅰ	MS	4.58±0.23	2.19±0.14
分化培养基Ⅱ	1/2MS	4.2±0.18	2.11±0.20

实施例2、将实施例1的“分化培养基Ⅰ”的6-BA的浓度由1mg·L^-1改成2mg·L^-1、3mg·L^-1，其余等同于实施例1，所得结果如下表2。

对比例1、改变实施例1的“分化培养基Ⅰ”中的6-BA、NAA的浓度，具体如下表2所述，其余等同于实施例1，所得结果如下表2。

表2、不同激素浓度对墨兰企黑×春兰大唐后代根状茎芽分化和成苗的影响

因此，根据表2可得知：当NAA0.2mg·L^-1，6-BA 1～3mg·L^-1范围内，平均分化芽点数和平均分数成苗数均高于NAA0.1mg·L^-1，但以6-BA2～3mg·L^-1时平均分化成苗数最高，达到3.02±0.30～3.37±0.31。因此，同时添加2～3mg·L^-16-BA和0.2mg·L^-1NAA有利于墨兰企黑×春兰大唐后代根状茎分化成苗。

对比例2、以实施例1的“分化培养基Ⅰ、MS+1mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5.5g·L^-1琼脂粉”为基础，增加活性炭的使用，活性炭设定的浓度如下表3所述，所得结果如下表3。

表3、不同活性炭浓度对墨兰企黑×春兰大唐后代根状茎芽分化和成苗的影响

活性炭浓度(g·L<sup>-1</sup>)	平均分化芽点数(个)	平均分化成苗数(个)
			0	4.58±0.23	2.19±0.14
0.1	0	0
			0.2	0	0
0.3	0	0
			0.6	0	0

因此，根据表3可得知：活性炭会导致墨兰×春兰杂交后代根状茎不朝着分化苗的方向发展。

对比例3、将实施例1步骤2)中的30～31天的黑暗培养改成“光照培养光周期为12h·d^-1，光照强度1500～2 000Lx”，其余等同于实施例1。

无论是“分化培养基Ⅰ”、还是“分化培养基Ⅱ”，直接采用组织培养中常规光周期培养方式即12h·d^-1光照，较早(约15～20d)就出现根状茎分泌酚类物质导致培养基明显褐化的情况，无法进行后续操作。而本发明实施例1、实施例2中采用先黑暗培养来尽量避免培养基褐化，待芽点诱导出来后再光照培养促进芽的生长；30～31天的培养期结束后，无明显褐化现象。

本发明以墨兰企黑×春兰大唐杂交种子经无菌萌发并经增殖培养的根状茎为材料，通过培养基配方和培养条件的筛选，发现添加活性炭对根状茎形态发育影响明显，添加活性炭0.1～0.6g·L^-1均促进根状茎向增殖的方向发展，而不添加活性炭则促进根状茎向分化成苗的方向发展；基础培养基MS和1/2MS对根状茎分化成苗率则相差不大；本发明中以MS或1/2MS为基础培养基，设定2～3mg·L^-16-BA，0.2mg·L^-1NAA时，能明显促进墨兰企黑×春兰大唐杂交后代根状茎分化成苗。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法，包括步骤1)、选择经墨兰×春兰杂交后代种子无菌萌发形成的根状茎并增殖培养获得的根状茎；其特征在于还包括如下步骤：

2)、将步骤1)所得的根状茎切割成1～1.5cm长，平放在分化培养基上，置于培养室培养；

分化培养基为以下任一：

MS+1～3mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5.5g·L^-1琼脂粉；

1/2MS+1～3mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+5.5g·L^-1琼脂粉；

培养温度为25±2℃，黑暗培养30～31天，获得带有圆锥形芽点的根状茎段；

2.根据权利要求1所述的墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法，其特征在于：分化培养基中，6-BA为2～3mg·L^-1。

3.根据权利要求1或2所述的墨兰×春兰杂交兰后代根状茎分化成苗的方法，其特征在于所述步骤2)中：将步骤1)所得的根状茎刮去表面粘附的增殖培养基所含的琼脂，再进行切割。