CN110226520B - 一种高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法，该方法包括初代培养、增殖培养和生根培养三个培养步骤，直接对再生的黄山苦茶组培苗进行不定根诱导，通过一系列培养基与培养工艺的组合，省去了壮苗环节，简化了快繁体系，明显缩短了组织培养的周期。本发明方法将未经壮苗的不定芽组培苗直接接种到生根诱导培养基中，不需经过传统方法中的壮苗培养期，节约20‑30天的培养时间，较大程度缩短了不定根诱导的时间。本发明高频诱导黄山苦茶组培苗生根，组培苗接种到不定根诱导培养基后，15天有60％的组培苗可观察到不定根产生，23天后生根率达到72％，30天后生根率达到93％，不定根诱导率明显高于传统方法。

Description

一种高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及黄山苦茶的组织培养，具体涉及一种高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法。
背景技术
黄山苦茶是上个世纪70年代在四川原国营宜宾县黄山茶场所发现的典型乔木大茶树，由于其稀有性和重要性，当前以保护为主，在做好保护的前提下，适当采取样品进行生化成分测定和茶样制作评定，以确定其商品价值。由于茶树是多年生植物、多酚类物质含量高等本身特性引起，造成培养的愈伤组织易褐化、难以分化、基因不能按序表达；其有性繁殖品质不稳定，种子育苗易造成品种混杂、退化，从而影响茶叶产量、质量及效益，因而生产上常用无性的扦插繁殖方式。然而无性的扦插繁殖生根费时费事，效率不高，在常规的扦插繁殖过程中，其繁殖速度慢、受季节限制、占地面积大等原因，使茶树的推广速度受到极大的限制。由于黄山苦茶呈零星分散，没有发布中心，更没有居群，茶树数量稀少，所以可望通过组织培养技术进行茶树的快速、大量地繁殖。专利CN107232056 A公开了一种茶树组培快繁体系的建立方法，通过初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养，建立起了茶树陕茶1号、安吉黄茶的组织离体培养体系。专利CN102726296 A公开了一种茶树组培再生体系建立的方法，包括以下步骤：1.愈伤组织的诱导，2.愈伤组织的继代和增殖，3.不定芽的诱导，4.不定芽的增殖，5.壮苗，6生根和移栽；该方法具有增殖方式简单、遗传稳定的特点。尽管茶树组培在近年来得到了一定的发展，但是不同茶树品种存在较大的差异，而且茶树组培过程中不定根诱导率低、生根周期长，严重制约了黄山苦茶的快速繁育。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法，该方法用于黄山苦茶的组织培养，不定根诱导率高，同时省去了生根过程中的壮苗培养，有效缩短了生根时间，适合大面积推广。除特殊说明外，本发明所述百分比为重量百分比，所述份数均为重量份。
本发明的目的是这样实现的：
一种高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法，包括初代培养、增殖培养、生根培养，其特征在于：所述初代培养的培养基包括KT和NAA，其中KT的浓度为0.5mg/L～1.0mg/L，NAA的浓度为1.0mg/L～2.0mg/L；所述增殖培养的培养基包括6-BA和NAA，其中6-BA的浓度为0.5mg/L～2.0mg/L，NAA的浓度为0.1mg/L～0.2mg/L；所述生根培养的培养基包括IBA和IAA，其中IBA的浓度为1.0mg/L～2.0mg/L，IAA的浓度为1.0mg/L～2.0mg/L。
优选的，上述初代培养的培养基中KT的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为2.0mg/L。上述增殖培养的培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为0.1mg/L。上述生根培养中IBA的浓度为1.0mg/L，IAA的浓度为2.0mg/L。
更优选的，上述初代培养为春季、秋季取黄山苦茶当年生幼嫩新梢，先用洗衣粉水洗去表面灰尘污渍，再流水冲洗1小时；在无菌操作条件下，先用75％酒精消毒约30s，无菌水漂洗3次，再用0.1％HgCl2+0.1％吐温-20消毒4min，无菌水漂洗5次，最后用无菌吸水纸将材料表面的水，外植体接种在MS+0.5mg/LKT+2.0mg/LNAA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L的培养基上，培养30天。上述增殖培养为待腋芽萌发并伸长至2cm左右时，将其剪下，进行增殖培养，增殖培养的培养基基为：MS+0.2mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L，培养30天。上述生根培养为待组培苗长至3厘米左右，选取生长健壮的组培苗，在无菌操作条件下，用浓度为500mg/L的吲哚丁酸溶液浸泡组培苗的基部10min，后转入生根培养基中，生根培养基为1/2MS+1.0mg/LIBA+2.0mg/LIAA+1g/L活性炭+卡那胶5.8g/L+蔗糖20g/L，培养30天。
本发明高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法，包括如下步骤：
(1)初代培养：将带有黄山苦茶腋芽幼嫩茎段，先用洗衣粉水洗去表面灰尘污渍，再流水冲洗1小时，在无菌操作条件下，先用75％酒精消毒约30s，无菌水漂洗3次，再用0.1％HgCl2+0.1％吐温-20消毒4min，无菌水漂洗5次，最后用无菌吸水纸将材料表面的水，将外植体接种在MS+0.5mg/LKT+2.0mg/LNAA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L的培养基上，光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，培养30天；
(2)增殖培养：待腋芽萌发并伸长至2cm左右时，将其剪下，进行增殖培养，增殖培养的培养基基为：MS+0.2mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L，光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，培养30天；
(3)生根培养：待组培苗长至3厘米左右，选取生长健壮的组培苗，在无菌操作条件下，用浓度为500mg/L的吲哚丁酸溶液浸泡组培苗的基部10min，后转入诱导生根培养基中，生根培养基为1/2MS+1.0mg/LIBA+2.0mg/LIAA+1g/L活性炭+卡那胶5.8g/L+蔗糖20g/L，光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，培养30天。
上述生根培养的光照优选为红光。
有益效果：
本发明提供一种高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法，该方法包括三个培养步骤(初代培养、增殖培养和生根培养)直接对再生的黄山苦茶组培苗进行不定根诱导，通过一系列培养基与培养工艺的组合，省去了壮苗环节，简化了快繁体系，明显缩短了组织培养的周期。本发明方法将未经壮苗的不定芽组培苗直接接种到生根诱导培养基中，不需经过传统方法中的壮苗培养期，节约20-30天的培养时间，较大程度缩短了不定根诱导的时间。本发明方法，组培苗放进生根诱导培养基后，仅需15天即可诱导出不定根，而传统生根诱导方法需30-45天，进一步节约诱导周期15-20天。本发明高频诱导黄山苦茶组培苗生根，组培苗接种到不定根诱导培养基后，15天有60％的组培苗可观察到不定根产生，23天后生根率达到72％，30天后生根率达到93％，不定根诱导率明显高于传统方法(诱导率30％-40％)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用英文简写的中英文对照为：NAA(萘乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，ZT(玉米素)，6-BA(6-苄氨基嘌呤)，IAA(生长素)。本发明培养基中所用MS为本领域所熟知的用于组织培养的基础培养基，其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长，可以市售购买，也可以自行配置。自行配置每种元素母液按表1称重后定容1L即可。
表1MS培养基所用成分
Figure BDA0002143215870000051
实施例
(1)初代培养基筛选：
将带有黄山苦茶腋芽幼嫩茎段，先用洗衣粉水洗去表面灰尘污渍，再流水冲洗1小时。在无菌操作条件下，先用75％酒精消毒约30s，无菌水漂洗3次，再用0.1％HgCl2+0.1％吐温-20消毒4min，无菌水漂洗5次，最后用无菌吸水纸将材料表面的水，将外植体接种在培养基上，光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，白光下培养30天，统计萌动率(萌发的外植体/接种的外植体)，不同培养基对初代培养的统计结果见下表2。
表2不同培养基对初代培养的影响
培养基 接种数量(15) 萌芽数
MS+0.5mg/L KT+1.0mg/L NAA+卡拉胶5.8g/L+蔗糖30g/L 15 5
MS+0.5mg/L KT+1.50mg/L NAA+卡拉胶5.8g/L+蔗糖30g/L 15 3
MS+0.5mg/L KT+2.0mg/L NAA+卡拉胶5.8g/L+蔗糖30g/L 15 10
通过30天培养后发现，MS+0.5mg/L KT+2.0mg/L NAA+卡拉胶5.8g/L+蔗糖30g/L为最佳初代培养基，萌芽数为66.7％。
(2)增殖培养基筛选：
待腋芽萌发并伸长至2cm左右时，将其剪下，进行增殖培养，每种培养基接种15株，光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，白光下培养30天，统计增殖率。不同培养基对增殖培养的统计结果见下表3。
表3不同培养基对增殖培养的影响
Figure BDA0002143215870000061
经过30天的培养，Z5培养基增殖效率最高，为326％。
(3)生根培养基筛选：
待组培苗长至3厘米左右，选取生长健壮的组培苗。在无菌操作条件下，用浓度为500mg/L的吲哚丁酸溶液浸泡组培苗的基部10min，后转入诱导生根培养基中。光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，白光下培养30天。不同培养基对生根培养的统计结果见下表4。
表4不同培养基对生根培养的影响
Figure BDA0002143215870000071
培养30天后，R2为最佳生根培养基，生根率达到93％。
不定根诱导最佳培养光波筛选：
筛选出最佳培养基(初代培养基：MS+0.5mg/LKT+2.0mg/LNAA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L；增殖培养基：MS+0.2mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L；生根培养基：1/2MS+1.0mg/LIBA+2.0mg/LIAA+1g/L活性炭+卡那胶5.8g/L+蔗糖20g/L)后，在筛选出后，对光波对不定根的筛选进行筛选，选择2-3cm的组培苗，在无菌条件下，用500mg/L的吲哚丁酸浸泡基部10min，放入R2培养基中，白光、红光下各放培养15株，培养30天后，统计生根率、不定根数。不同波长光对茶树组培苗生根的影响结果见下表5。
表5不同波长光对茶树组培苗生根的影响
Figure BDA0002143215870000072
实验结果表明，红光下培养生根率高与白光下培养，且不定根发育状况更好，生根条数为7.25条，因此红光下培养更有利于不定根的发育。

Claims (2)

1.一种高频诱导黄山苦茶组培苗生根的方法，包括初代培养、增殖培养、生根培养，其特征在于：所述初代培养为春季、秋季取黄山苦茶当年生幼嫩新梢，先用洗衣粉水洗去表面灰尘污渍，再流水冲洗1小时；在无菌操作条件下，先用75%酒精消毒30s，无菌水漂洗3次，再用0.1%HgCl2+0.1%吐温-20消毒4min，无菌水漂洗5次，最后用无菌吸水纸将材料表面的水吸干，外植体接种在MS+0.5mg/L KT+2.0mg/L NAA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L的培养基上，培养30天；所述增殖培养为待腋芽萌发并伸长至2cm时，将其剪下，进行增殖培养，增殖培养的培养基为：MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L，培养30天；所述生根培养为待组培苗长至3厘米，选取生长健壮的组培苗，在无菌操作条件下，用浓度为500mg/L的吲哚丁酸溶液浸泡组培苗的基部10min，后转入生根培养基中，生根培养基为1/2MS+1.0mg/L IBA+2.0mg/L IAA+1g/L活性炭+卡那胶5.8g/L+蔗糖20g/L，培养30天；所述生根培养的光照为红光。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）初代培养：将带有黄山苦茶腋芽幼嫩茎段，先用洗衣粉水洗去表面灰尘污渍，再流水冲洗1小时，在无菌操作条件下，先用75%酒精消毒30s，无菌水漂洗3次，再用0.1%HgCl2+0.1%吐温-20消毒4min，无菌水漂洗5次，最后用无菌吸水纸将材料表面的水吸干，将外植体接种在MS+0.5mg/L KT+2.0mg/L NAA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L的培养基上，光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，培养30天；
（2）增殖培养：待腋芽萌发并伸长至2cm时，将其剪下，进行增殖培养，增殖培养的培养基为：MS+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA+卡那胶5.8g/L+蔗糖30g/L，光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，培养30天；
（3）生根培养：待组培苗长至3厘米，选取生长健壮的组培苗，在无菌操作条件下，用浓度为500mg/L的吲哚丁酸溶液浸泡组培苗的基部10min，后转入诱导生根培养基中，生根培养基为1/2MS+1.0mg/L IBA+2.0mg/L IAA+1g/L活性炭+卡那胶5.8g/L+蔗糖20g/L，光照18h/d,黑暗6h/d,23摄氏度，培养30天。
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