WO2014121428A1 - 一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法 - Google Patents

一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法 Download PDF

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WO2014121428A1
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yeast extract
screening medium
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王强
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    • C12R2001/72—Candida
    • C12R2001/74—Candida tropicalis

Definitions

  • the present invention relates to a method for mutagenesis of Candida tropicalis producing a long-chain dibasic acid for improving the acid production of a long-chain dibasic acid and the conversion of a normal paraffin.
  • Long-chain dibasic acids are important fine chemical intermediates, which can synthesize a series of high value-added special chemicals such as perfumes, special nylons, polyamide hot melt adhesives, etc., while long-chain dibasic acids cannot be directly from nature. Obtaining, chemical synthesis has many insurmountable drawbacks. Therefore, the use of microbial technology to prepare long-chain dibasic acids has attracted great attention at home and abroad.
  • An object of the present invention is to provide a method for mutagenesis of Candida tropicalis producing a long-chain dibasic acid, which comprises first preparing a culture medium and inoculating Candida tropicalis on a medium, using The radioactive cobalt 60 ⁇ -ray was mutagenized, and the mutant strain of Candida tropicalis with high yield of long-chain dibasic acid was screened by mutagenesis screening medium system to improve the acid production of long-chain dibasic acid and normal paraffin. Conversion rates.
  • a method for mutagenesis of Candida tropicalis producing a long-chain dibasic acid according to the present invention is as follows: Steps:
  • a, wort medium 12Brix wort, 2% agar
  • each component is potassium dihydrogen phosphate 5.0-6.0g, sodium chloride 1.0-1.5g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5-1.0g, sucrose 15.0-25.
  • Og corn syrup 1.0- 2.
  • Og yeast extract L 0-2.
  • each component is sodium dihydrogen phosphate 2.0-3.0 g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0-6.0 g, ammonium sulfate 2.0-3.0 g, sodium chloride 1.0-1.5 g, yeast extract 0.5- 1.0 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5-1.0 g, agar 15.0-20.0 g, n-decane hydrocarbon nC8-nC1820-50 ml, pure water 1000 ml, pH 7.0;
  • each component is sodium dihydrogen phosphate 2.0-3.0 g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0-6.0 g, sodium chloride 1.0-1.5 g, yeast extract 0.5-1.0 g, ammonium sulfate 2.0- 3.0g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5-1.0g, agar 15.0-20.0g, sucrose 15.0-20.0g, pure water 1000ml, pH7.0;
  • each component is sucrose 15.0-20.0g, sodium dihydrogen phosphate 2.0-3.0g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0-6.0g, sodium chloride 1.0-1.5g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5- 1.0g, yeast extract 0.5-1.0g, urea 1.5-2.0g, agar 15.0-20.0g, n-alkane nC8-nC1820-50ral, pure water 1000ml, pH 7.5, phenol red indicator 1%;
  • each component is potassium dihydrogen phosphate 5.0-6.0g, sodium chloride 1.0-1.5g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5-1.0g, sucrose 15.0-25.0g, corn syrup 1.0-2.0 g, yeast extract 1.0-2.0g, anhydrous sodium acetate 3.0-4.0g, urea 2.0-3.0g, vitamin B10.1-0.3g, ammonium sulfate 2.0-3.0g, acrylic acid 0.001-0.002g, n-alkane nC8 -nC18300-400ml, pure water 1000ml;
  • the Candida tropicalis strain is inserted into the slope of the wort medium, cultured in an incubator at a temperature of 28-34 ° C for 24-48 hours, 15 ml of sterile water is added to the inclined surface, and inoculated with the sterile The cells were scraped into a sterile 250 ml flask containing glass beads, shaken for 30 minutes to fully disintegrate the cells, and 10 ml of the bacterial suspension was pipetted into a 50 ml sterile flask and irradiated with cobalt 60 ⁇ -ray.
  • Irradiation dose is 0.5-0.7KGy
  • the irradiated bacterial suspension is diluted by gradient, and coated with wort plate, and cultured in the incubator at temperature of 28-34 °C for 36-72 hours with the control plate.
  • the single colony with a survival rate of 10-40% in the plate escaping from step e is inoculated in a one-to-one correspondence to the plate containing the screening medium I and the plate containing the screening medium, at a temperature of 28 Incubating in an incubator at -34 ° C for 36-72 hours, selecting a single colony of Candida tropicalis that does not grow on the screening medium I and grows vigorously on the screening medium;
  • the single colony screened in step f is inoculated on a plate containing the screening medium m, at a temperature
  • the mutagenized strain of Candida tropicalis obtained in step g is inoculated to the seed culture medium of step b for seed culture according to a conventional method, and then the cultured seed is inoculated into the fermentation medium of step d for acid production. to cultivate.
  • the initial strain used in the present invention is Candida tropicalis, and the Latin name is: Candida tropicalis, which is a tropical silk which is entrusted by the China Industrial Microbial Culture Collection and Management Center and purchased by the American Type of Microbial Culture Collection No. 20962. Yeast.
  • assimilation carbon source glucose +, galactose +, L-sorbose -, sucrose +, maltose +, cellobiose +, trehalose +, lactose -, melibiose -, raffinose -, pine Trisaccharide+, inulin-, soluble starch+, D-xylose+, L-arabinose+, D-arabinose-, D-ribose-, L-rhamnose-, ethanol+, glycerol+, red oak Alcohol-, ribitol+, sweet alcohol-, D-mannitol+, D-sorbitol+, inositol-, succinic acid+.
  • Morphological characteristics cream white, wrinkled, plum-like. When liquid is cultured, most of them are single ovoid cells.
  • yeast extract is a sale product (from Shanghai West King) Starch Sugar Co., Ltd.)
  • a yellow brown or yellowish brown soluble paste product having a dry matter content of >65. 0%, total nitrogen content (on a dry basis) > 9. 0%, amino nitrogen content (on a dry basis) > 3. 0%.
  • the mutagenized strain of Candida tropicalis obtained by the method is inserted into a seed culture medium In the triangular flask, the liquid volume is 5%-10%, and the culture is carried out for 20-48 hours on a rotary shaker at a temperature of 28-34 ° C and 140-230 rpm. After the seed culture is completed, the fermentation medium is inoculated to the fermentation medium. It is 53 ⁇ 4-10%, the culture temperature is 28-34 ⁇ , the culture time is 120-144 hours, and the long-chain dibasic acid product is obtained after the end of fermentation, and the acid yield is 178-190g/L. detailed description
  • a, wort medium 12 Brix wort, 1% agar
  • each component is sodium dihydrogen phosphate 2.0g, dipotassium hydrogen phosphate 5. 0g, ammonium sulfate 2.0g, sodium chloride l. Og, yeast extract 0.5 g , magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g, agar 20. 0g, normal eleven alkane nC1130ral, pure water 1000ml, pH7.00;
  • each component is sodium dihydrogen phosphate 2. 0g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0g, sodium chloride 1.0g, yeast extract 0.5g, ammonium sulfate 2. 0g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g, agar 20.0 g , sucrose 15.0 g, pure water 1000 ml, pH 7. 0;
  • sucrose is 1. 0g, sodium dihydrogen phosphate 2. g, urea 1.5g, agar 20. 0g, normal eleven alkane nC1130ml, pure water 1000ml, pH 7.5, phenol red indicator 1%;
  • the Candida tropicalis strain is inserted into step a wort slope at a temperature of 29. Incubate for 48 hours in the incubator of C, add 15tnl of sterile water to the inclined surface, scrape the bacteria into a sterile 250ml flask containing glass beads with a sterile inoculating loop, shake the cells for 30 minutes, and fully disintegrate the cells. Pipette 10ml of the bacterial suspension into a 50ml sterile flask and irradiate with cobalt 60 ⁇ -ray. The irradiation dose is 0.5KGy, and the irradiated bacterial suspension is diluted by 103, 104, 105, 106 times, respectively. Take 0.2ml of wort plate, apply 3 plates per dilution, and incubate for 60 hours in an incubator at 29 °C to select a single Candida tropicalis with a survival rate of 25% after irradiation. Colony
  • the single colony with a survival rate of 25% in the plate selected by the step e is inoculated into the plate containing the screening medium I and the plate of the screening medium II in a one-to-one correspondence, respectively. Incubate in a 29"C incubator for 72 hours, and select a single colony of Candida tropicalis that does not grow on the screening medium I plate and grow vigorously on the screening medium II;
  • the single colonies screened in step f were inoculated on a plate containing the screening medium III, and cultured in an incubator at a temperature of 29 ° C for 60 hours to select a tropical R. cerevisiae with a large R value.
  • Variable strain wherein R is the area of acid production/colony area of the colony;
  • the mutagenized strain of Candida tropicalis obtained in step g is inoculated into the seed culture medium of step b according to a conventional method for seed culture, and then the cultured seed is inoculated into the fermentation medium of the fermentation d to produce acid culture, and finally 20m; in reactor alkane is n-Ju undec substrate, incubated at 29'C, air ventilation 0.6-1.6VVM / m 5 broth ⁇ ⁇ ) 144 hours fermentation The test, after the end of the fermentation, was treated with eleven dibasic acid products, and the acid yield was 178 g/L.
  • a, wort medium 12Brix wort, 1% agar
  • Screening medium I The preparation component is sodium dihydrogen phosphate 2.0g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0g, ammonium sulfate 2. Og, sodium chloride l. Og, yeast extract 0.5g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g, agar 20.0g, n-dodecane alkane nC1230ml, pure water 1000ml, pH7.0;
  • each component is sodium dihydrogen phosphate 2.0g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0g, sodium chloride 1.0g, yeast extract 0.5g, ammonium sulfate 2.0g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5g, 20.0 g of agar, 15.0 g of sucrose, 1000 ml of pure water, pH 7.0;
  • each component is sucrose 15.0g, sodium dihydrogen phosphate 2.0g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0g, sodium chloride 1.0g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5g, yeast extract 0.5g, urea 1.5g, agar 20.0g, n-dodecyl hydrocarbon nC1230ml, pure water 1000ml, pH 7.5, phenol red indicator 1%;
  • each component is potassium dihydrogen phosphate 5.0g, sodium chloride 1.0g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5g, sucrose 15.0g, corn syrup 1.0g, yeast extract 1.0g, anhydrous Sodium acetate 3.0g, urea 2.0g, vitamin B10. lg, ammonium sulfate 2.0g, acrylic acid 0.001g, n-dodecane alkane nC123Q0inl, pure water 1000ml;
  • the Candida tropicalis strain was inserted into step a wort slope, cultured in an incubator at a temperature of 2 ⁇ TC for 48 hours, 15 ml of sterile water was added to the inclined surface, and the cells were aseptically inoculated with a loop. Scrape into a sterile 250ml flask containing glass beads, shake the cells for 30 minutes, and aspirate 10ml of the bacterial suspension in a 50ml sterile flask. Irradiate with cobalt 60 ⁇ -ray.
  • the irradiation dose is 0.6KGy
  • the irradiated bacterial suspension was diluted 103, 104, 105, 106 times, respectively, 0.2 ml of the wort plate was applied, and each plate was coated with 3 plates in an incubator at a temperature of 29 ° C. After incubation for 60 hours, select a single colony of Candida tropicalis with a survival rate of 25% in the irradiated plate;
  • the single colony with a survival rate of 25% in the plate selected by the step e is inoculated with a sterile bamboo stick in a one-to-one correspondence to the plate containing the screening medium I and the plate containing the screening medium, Incubate for 72 hours in an incubator at a temperature of 29 ° C, and select a single colony of Candida tropicalis that does not grow on the screening medium I plate and grow vigorously on the screening medium II plate;
  • the single colony screened in step f was inoculated on a plate containing the screening medium III, and cultured in a culture at a temperature of 29 ° C for 60 hours to select a tropical R. cerevisiae with a large R value.
  • Variable strain wherein R is the area of acid production/colony area of the colony;
  • the mutagenized strain of Candida tropicalis obtained in step g is inoculated to the seed culture medium of step b for seed culture according to a conventional method, and then the cultured seed is inoculated into the fermentation medium of step d for acid production.
  • Culture, the newly obtained mutagenized strain was treated with n-dodecane in a 20 m reactor at a temperature of 29 ° C, and the aeration was 0.6-1.6 VVM ( ⁇ ' air/m : 'fermentation. min
  • the culture is carried out for 144 hours, and the fermentation test is carried out. After the fermentation is finished, the dodecane dibasic acid product is obtained, and the acid yield is 190 g/L.
  • a, wort medium 12Brix wort, 2% agar;
  • sucrose 1 Og, corn syrup l. Og, yeast extract l. Og, yeast extract l. Og, corn syrup l. Og, yeast extract l. Og, urea 2.5g, vitamin B10. lg, normal tridecane alkane nCl 340ml, pure water 1000ml;
  • each component is sodium dihydrogen phosphate 2. 0g, dipotassium hydrogen phosphate 5. 0g, ammonium sulfate 2.0g, sodium chloride l. Og, yeast extract 0.5g, magnesium sulfate heptahydrate 0; 0g, agarose 0. 0g, normal tridecane alkane nC1330ml, pure water lOQOml, pH7.00;
  • each component is potassium dihydrogen phosphate 5. 0g, sodium chloride l. Og, magnesium sulfate heptahydrate 0.5g, sucrose 15.0g, corn syrup l. Og, yeast extract l. Og, anhydrous sodium acetate 3. 0g, urea 2.0g, vitamin B10. lg, ammonium sulfate 2.0g, acrylic acid 0. 001g, normal tridecane alkane nCl 3300ml, pure water 1000ml;
  • the Candida tropicalis strain is inserted into the step a wort slope, in an incubator at a temperature of 29 ° C After culturing for 48 hours, add 15 ml of sterile water to the slant surface, scrape the bacteria into a sterile 250 ml flask containing glass beads with a sterile inoculating loop, shake the cells for 30 minutes, and separately absorb 10 ml of the bacterial suspension.
  • the single colonies with a survival rate of 25»/» in the plate selected by the step e are inoculated in a one-to-one correspondence with the sterile bamboo sticks to the plate containing the screening medium I and the plate containing the screening medium. , cultured in an incubator at a temperature of 29 ° C for 72 hours, and selected a single colony of Candida tropicalis that does not grow on the screening medium I plate and grows vigorously on the screening medium II plate;
  • the single colony screened in step f is inoculated on a plate containing the screening medium m, and cultured in an incubator at a temperature of 29 ° C for 60 hours to select a tropical R. cerevisiae with a large R value.
  • Variable strain wherein R is the area of acid production/colony area of the colony;
  • the mutagenized strain of Candida tropicalis obtained in step g is inoculated to the seed culture medium of step b for seed culture according to a conventional method, and then the cultured seed is inoculated into the fermentation medium of step d for acid production.
  • Culture the newly obtained mutagenized strain was treated with normal tridecane in a 20 m 3 reactor at a temperature of 29 ° C, and the aeration was 0.6-1.6 VVM (m 3 air/or' fermentation broth min The culture was carried out for 144 hours, and the fermentation test was carried out. After the fermentation, the thirteen-dimensional dibasic acid product was obtained, and the acid yield was 185 g/L.
  • wort medium 12Brix wort, 2% agar
  • each component is potassium dihydrogen phosphate 5.0g, sodium chloride 1.0g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5g, sucrose 15.0g, corn syrup 1.0g, yeast extract l. Og, urea 2.5g, vitamin B10. lg, n-alkane nCll_nC1440ml, pure water 1000ml;
  • each component is sodium dihydrogen phosphate 2.0g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0g, ammonium sulfate 2.0g, sodium chloride l.
  • Qg yeast extract 0.5g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g , agar 20.0g, normal paraffin nCll-nC1430ml, pure water 1000ml, pH7.0;
  • each component is sucrose 15.0g, sodium dihydrogen phosphate 2.0g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0g, sodium chloride 1.0g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5g, yeast extract 0.5g, urea 1.5g, agar 20.0g, n-alkane nCll-nC1430ml, pure water 1000ml, pH 7.5, phenol red indicator 1%;
  • each component is potassium dihydrogen phosphate 5.0g, sodium chloride l. Og, magnesium sulfate heptahydrate 0.5g, sucrose 15.0g, corn syrup 1.0g, yeast extract 1.0g, no Sodium acetate sodium 3.0g, urea 2.0g, vitamin B10. lg, ammonium sulfate 2.0g, acrylic acid 0.001g, n-alkane nCllnC14300ml, pure water 1000ml;
  • the Candida tropicalis strain was inserted into step a wort slope, cultured in an incubator at a temperature of 29 ° C for 48 hours, 15 ml of sterile water was added to the inclined surface, and the cells were aseptically inoculated with a loop Scrape into a sterile 250 ral flask containing glass beads, shake the cells for 30 minutes, and pipette 10 ml of the suspension into a 50 ml sterile flask. Irradiate with cobalt 60 ⁇ -ray. The irradiation dose is 0.6KGy, the irradiated bacterial suspension was diluted 103, 104, 105.
  • the single colony with a survival rate of 20% in the plate screened in step e is inoculated in a one-to-one correspondence with a sterile bamboo stick to a plate containing the screening medium I and a plate containing the screening medium, Incubate for 72 hours in an incubator at a temperature of 29 ° C, and select a single colony of Candida tropicalis that grows on the screening medium I plate without growing on the screening medium I plate;
  • the strain selected in step f was inoculated on a plate containing the screening medium III, and cultured in an incubator at a temperature of 29 ° C for 60 hours to select the mutagenesis of Candida tropicalis with large R value a strain, wherein R is a bacterial acid producing area/colon area;
  • the mutagenized strain of Candida tropicalis obtained by the step g is inoculated into the seed culture medium of step b according to a conventional method for seed culture, and then the cultured seed is inoculated into the fermentation medium of the step d
  • Acid production Raising newly obtained mutagenized strains in a 20m reactor with normal eleven or n-dodecane or n-tridecane or normal tetradecane as substrate, at temperature 29
  • the aeration rate was 0.6-1.6 VVM (m 3 air/m ; fermentation broth min) for 144 hours, and the fermentation test was carried out. After the fermentation was finished, the tetradecane dibasic acid product was obtained, and the acid yield was 182 g/L.

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Abstract

本发明涉及一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，该方法是先制备培养基，将热带假丝酵母菌接种于培养基上，采用放射源钴60γ-射线进行辐照诱变，并用诱变筛选培养基系统筛选获得高产长链二元酸的热带假丝酵母菌的突变菌株，从而提高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。

Description

一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法 技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法， 该方法以提 高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。
背景技术
[0002] 长链二元酸是重要的精细化工中间体， 可以合成香料、 特种尼龙、 聚酰胺 热熔胶等一系列高附加值的特殊化学品， 而长链二元酸不能从自然界中直接获得， 化学合成又有许多难以克服的弊端， 因此利用微生物技术制取长链二元酸引起了国 内外的高度重视。
[0003] 早在 20世纪 60年代国外就开始了利用微生物氧化正构烷烃制取长链二元 酸的研究， 但产酸量很低， 难以实现工业化生产。 曰本矿业公司将选出的产酸能力 最强的热带假丝酵母菌 （No. 1098 菌株） 经化学诱变和紫外线诱变， 得到变异株 M2030, 该菌株发酵 120小时， 产酸 1 30g/L 1977年日本矿业公司利用微生物氧化 技术， 以正构烷烃为原料成功的开发出制造长链二元酸技术， 1982年建成年产 100 吨十三烷二元酸的工业化装置。
[0004] 我国微生物发酵制取长链二元酸的研究工作开始于 20世纪 70年代， 1999 年在山东淄博建成利用微生物技术年产 1000 吨长链二元酸的生产装置。 2005 年后 山东济宁、 青岛、 烟台等地陆续建成利用微生物技术年产 3000-8000吨的长链二元 酸生产装置。
[0005] 生产长链二元酸的菌种的诱变筛选方法报道较多的有亚硝基胍诱变、 紫外 线照射诱变和离子束注入诱变，而采用放射源钴 60 γ -射线进行诱变的未见有报道。 发明内容
[0006] 本发明的目的在于，提供一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法， 该方法是先制备培养基,将热带假丝酵母菌接种于培养基上，采用放射源钴 60 γ -射 线进行诱变， 并用诱变筛选培养基系统筛选获得高产长链二元酸的热带假丝酵母菌 突变菌株， 从而提高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。
[ 0007] 本发明所述的一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法， 按下列歩 骤进行：
[0008] 制备培养基：
[0009] a、 麦芽汁培养基： 12Brix 麦芽汁， 2% 琼脂；
[0010] b、 种子培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0-6.0g， 氯化钠 1.0-1.5g, 七水 合硫酸镁 0.5-1.0g， 蔗糖 15.0-25. Og, 玉米浆 1.0-2. Og, 酵母浸膏 L 0-2. Og, 尿 ^ 2.5-3. Og, 维生素 B10, 1-0.3g， 正构烷烃 nC8_nC1840- 50ml , 纯水 1000ml ；
[0011] c、 筛选培养基：
[0012] 筛选培养基 I ： 各组份为磷酸二氢钠 2.0-3.0g, 磷酸氢二钾 5.0-6.0g, 硫酸铵 2.0-3.0g, 氯化钠 1.0-1.5g， 酵母浸膏 0.5-1.0g, 七水合硫酸镁 0.5-1.0g, 琼脂 15.0-20.0g, 正构垸烃 nC8-nC1820-50ml, 纯水 1000ml, pH7.0 ；
[0013] 筛选培养基 II ： 各组份为磷酸二氢钠 2.0-3.0g， 磷酸氢二钾 5.0-6.0g, 氯化钠 1.0-1.5g， 酵母浸膏 0.5-1.0g, 硫酸铵 2.0-3.0g, 七水合硫酸镁 0.5-1.0g, 琼脂 15.0-20.0g, 蔗糖 15.0-20.0g, 纯水 1000ml, pH7.0 ；
[0014] 筛选培养基 III ： 各组份为蔗糖 15.0-20.0g， 磷酸二氢钠 2.0-3.0g， 磷酸 氢二钾 5.0-6.0g, 氯化钠 1.0-1.5g, 七水合硫酸镁 0.5-1.0g, 酵母浸膏 0.5-1.0g, 尿素 1.5-2.0g,琼脂 15.0-20.0g,正构烷烃 nC8-nC1820-50ral ,纯水 1000ml, pH7.5, 酚红指示剂 1% ；
[0015] d、 发酵培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0-6.0g， 氯化钠 1.0-1.5g， 七水 合硫酸镁 0.5- 1.0g, 蔗糖 15.0-25.0g， 玉米浆 1.0- 2.0g, 酵母浸膏 1.0- 2.0g， 无 水醋酸钠 3.0-4.0g, 尿素 2.0- 3.0g, 维生素 B10.1-0.3g, 硫酸铵 2.0-3.0g， 丙烯 酸 0.001-0.002g, 正构烷烃 nC8-nC18300-400ml, 纯水 1000ml ；
[0016] 热带假丝酵母菌的诱变：
[0017] e、 将热带假丝酵母菌菌株接入麦芽汁培养基斜面， 在温度 28- 34°C的培养 箱中培养 24-48 小时， 向斜面内加入 15ml 无菌水， 用无菌接种环将菌体刮入无菌 的含有玻璃珠的 250ml 三角瓶中， 振荡 30 分钟充分打散菌体， 分别吸取 10ml 菌 悬液于 50ml 无菌三角瓶中， 用钴 60γ- 射线进行辐照， 辐照剂量为 0.5-0.7KGy, 将辐照后的菌悬液进行梯度稀释， 并涂麦芽汁平板， 在温度 28- 34°C的培养箱中与 对照平板一起培养 36-72 小时， 选择经辐照后平板中成活率在 10- 40% 的热带假丝 酵母菌的单菌落；
[0018] f、 将步骤 e筛逸出的平板中成活率在 10-40%的单菌落分别一一对应接种 到含筛选培养基 I的平板和含筛选培养基 Π的平板上， 在温度 28-34°C的培养箱中 培养 36-72小时， 选择在筛选培养基 I上不生长而在筛选培养基 Π上生长旺盛的热 带假丝酵母菌的单菌落；
[0019] g、 再将步骤 f 筛选出的单菌落接种于含筛选培养基 m的平板上， 在温度
28-34°C的培养箱中培养 36-72 小时， 选择 R 值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株， 其中 R 为菌落产酸面积 / 菌落面积；
[0020] 热带假丝酵母菌诱变菌株的验证
[0021] h、将步骤 g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤 b种 子培养基进行种子培养， 再将培养好的种子接种到步骤 d发酵培养基中进行产酸培 养。
[0022] 本发明所用的初始菌种为热带假丝酵母菌， 拉丁名称为： Candida tropicalis, 是委托中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的美国典型微生物菌种 保藏中心编号为 20962的热带假丝酵母菌。
[0023] 热带假丝酵母菌的生理特性如下：
[0024] 一、 发酵： 葡萄糖 +, 半乳糖 +, 蔗糖 +， 麦芽糖 +, 海藻糖 +, 乳糖-， 蜜二 糖-, 棉籽糖-， 松三糖 +, 菊糖-。
[0025] 二、 同化碳源： 葡萄糖 +， 半乳糖 +, L- 山梨糖-， 蔗糖 +, 麦芽糖 +, 纤维 二糖 +， 海藻糖 +, 乳糖-， 蜜二糖-, 棉籽糖-， 松三糖 +, 菊糖-， 可溶性淀粉 +， D-木 糖 +， L-阿拉伯糖 +, D-阿拉伯糖-, D-核糖-， L- 鼠李糖-， 乙醇 +, 甘油 + , 赤藓 醇-， 核糖醇 +, 甜醇-， D- 甘露醇 +, D- 山梨醇 +， 肌醇-， 琥珀酸 +。
[0026] 三、 同化硝酸盐： 阴性。
[0027] 四、 在无维生素的培养基中生长： 弱。
[0028] 形态特征： 奶油白色， 有褶皱， 呈梅花状。 液体培养时， 大部分是单个卵 圆形细胞。
[0029] 本发明所述的一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法， 该方法中 所述的酵母浸膏 （yeast extract ) 为巿售产品 （来源于上海西王淀粉糖有限公司）， 黄棕色或黄褐色可溶性膏状制品， 其干物质含量 > 65. 0%, 总氮含量 （以干基计） > 9. 0%, 氨基氮含量 （以干基计） > 3. 0%。
[0030] 本发明所述的一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法， 通过该方 法获得的热带假丝酵母菌的诱变菌株， 接入装有种子培养基的三角瓶中， 装液量为 5%- 10%, 在温度 28-34°C, 140-230 转 / 分钟的旋转摇床上培养 20-48 小时， 种子 培养完毕后接种至发酵培养基， 接种量为 5¾-10%， 培养温度为 28-34Ό, 培养时间 120-144 小时， 发酵结束经后处理得长链二元酸产品， 产酸量为 178-190g/L。 具体实施方式
[0031] 实施例 1 ：
[0032] 制备培养基：
[0033] a、 麦芽汁培养基： 12Brix 麦芽汁， 1% 琼脂；
[0034] b、 种子培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5. Og, 氯化钠 l. Og, 七水合硫酸镁 0.5g， 蔗糖 15. 0g， 玉米浆 l. Og, 酵母浸膏 l. Og, 尿素 2.5g, 维生素 B10. lg, 正 构十一碳烷烃 nC1140ml， 纯水 1000ml ；
[0035] c、 筛选培养基：
[0036] 筛选培养基 I ：各组份为磷酸二氢钠 2.0g,磷酸氢二钾 5. 0g,硫酸铵 2.0g, 氯化钠 l. Og, 酵母浸膏 0.5g， 七水合硫酸镁 0.5g， 琼脂 20. 0g, 正构十一碳烷烃 nC1130ral, 纯水 1000ml, pH7. 0 ；
[0037] 筛选培养基 II ：各组份为磷酸二氢钠 2. 0g,磷酸氢二钾 5.0g,氯化钠 1.0g, 酵母浸膏 0.5g， 硫酸铵 2. 0g, 七水合硫酸镁 0.5g, 琼脂 20. 0g， 蔗糖 15.0g, 纯水 1000ml, pH7. 0 ；
[0038] 筛选培养基 III ： 各组份为蔗糖 15. 0g, 磷酸二氢钠 2. 0g， 磷酸氢二钾 5.0g, 氯化钠 1. 0g, 七水合硫酸镁 0.5g, 酵母浸膏 0.5g, 尿素 1.5g, 琼脂 20. 0g, 正构 十一碳烷烃 nC1130ml， 纯水 1000ml, pH7.5, 酚红指示剂 1% ；
[0039] d、 发酵培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5. 0g, 氯化钠 l. Og, 七水合硫酸镁 0.5g, 蔗糖 15. 0g, 玉米浆 l. Og, 酵母浸膏 l. Og, 无水醋酸钠 3. 0g， 尿素 2.0g， 维生素 B10. lg, 硫酸铵 2.0g， 丙烯酸 0. 001g, 正构十一碳烷烃 nC11300ml, 纯水 1000ml ； [0040] 热带假丝酵母菌的诱变：
[0041] e、 将热带假丝酵母菌菌株接入步骤 a麦芽汁斜面， 在温度 29。C的培养箱中 培养 48小时， 向斜面内加入 15tnl无菌水， 用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻 璃珠的 250ml 三角瓶中， 振荡 30分钟充分打散菌体， 分别吸取 10ml菌悬液于 50ml 无菌三角瓶中， 用钴 60γ-射线进行辐照， 辐照剂量为 0.5KGy, 将輻照后的菌悬液 进行梯度 103、 104、 105、 106 倍稀释， 分别取 0.2ml 涂麦芽汁平板， 每个稀释度 涂 3个平板， 在温度 29°C的培养箱中培养 60 小时， 选择经辐照后平板中成活率在 25% 的热带假丝酵母菌的单菌落；
[0042] f、 将歩骤 e筛选出的平板中成活率在 25%的单菌落用无菌竹签分别一一对 应接种到含筛选培养基 I的平板和合筛选培养基 II的平板上， 在温度 29"C的培养箱 中培养 72 小时， 选择在筛选培养基 I平板上不生长而在筛选培养基 II平扳上生长 旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
[0043] g、 再将步骤 f 筛选出的单菌落接种于含筛选培养基 III的平板上， 在温度 29 °C的培养箱中培养 60 小时， 选择 R 值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株， 其中 R 为 菌落产酸面积 /菌落面积；
[0044] 热带假丝酵母菌诱变菌株的验证：
[0045] h、 将步骤 g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤 b种 子培养基进行种子培养， 再将培养好的种子接种到歩骤 d发酵培养基中进行产酸培 养， 最后在 20m;的反应器内以正抅十一碳烷烃为底物， 在温度 29'C , 通气量 0.6-1.6VVM 空气 /m5 发酵液 · ηΰη) 下培养 144 小时， 进行发酵试验， 发酵结 束经后处理得十一垸二元酸产品， 产酸量为 178g/L。
[0046] 实施例 2 ：
[0047] 制备培养基：
[0048] a、 麦芽汁培养基： 12Brix 麦芽汁， 1% 琼脂；
[0049] b、 种子培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0g, 氯化钠 l. Og, 七水合硫酸镁 0.5g, 蔗糖 15. Og, 玉米浆 l. Og, 酵母浸膏 l. Og, 尿素 2.5g, 维生素 B10. lg, 正 构十二碳烷烃 nC1240ml, 纯水 1000ml ；
[0050] c 筛选培养基： [0051] 筛选培养基 I ： 备组份为磷酸二氢钠 2.0g,磷酸氢二钾 5.0g,硫酸铵 2. Og, 氯化钠 l. Og, 酵母浸膏 0.5g, 七水合硫酸镁 0.5g, 琼脂 20.0g, 正构十二碳烷烃 nC1230ml, 纯水 1000ml, pH7.0 ；
[0052] 筛选培养基 II ：各组份为磷酸二氢钠 2.0g,磷酸氢二钾 5.0g,氯化钠 1.0g, 酵母浸膏 0.5g, 硫酸铵 2.0g, 七水合硫酸镁 0.5g， 琼脂 20.0g, 蔗糖 15.0g， 纯水 1000ml, pH7.0 ；
[0053] 筛选培养基 III ： 各组份为蔗糖 15.0g, 磷酸二氢钠 2.0g, 磷酸氢二钾 5.0g, 氯化钠 1.0g, 七水合硫酸镁 0.5g， 酵母浸膏 0.5g, 尿素 1.5g, 琼脂 20.0g, 正构 十二碳垸烃 nC1230ml， 纯水 1000ml, pH7.5, 酚红指示剂 1% ；
[0054] d、 发酵培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0g, 氯化纳 1.0g， 七水合硫酸镁 0.5g, 蔗糖 15.0g， 玉米浆 1.0g， 酵母浸膏 1.0g， 无水醋酸钠 3.0g， 尿素 2.0g, 维生素 B10. lg， 硫酸铵 2.0g， 丙烯酸 0.001g, 正构十二碳烷烃 nC123Q0inl， 纯水 1000ml ；
[0055] 热带假丝酵母菌的诱变：
[0056] e. 将热带假丝酵母菌菌株接入步骤 a麦芽汁斜面， 在温度 2<TC的培养箱中 培养 48小时， 向斜面内加入 15ml无菌水， 用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻 璃珠的 250ml 三角瓶中， 振荡 30分钟充分打散菌体， 分别吸取 10ml菌悬液于 50ml 无菌三角瓶中， 用钴 60γ-射线进行辐照， 辐照剂量为 0.6KGy, 将辐照后的菌悬液 进行梯度 103、 104、 105、 106 倍稀释， 分别取 0.2ml 涂麦芽汁平板， 每个稀释度 涂 3个平板， 在温度 29°C的培养箱中培养 60小时， 选择经辐照后平板中成活率在 25% 的热带假丝酵母菌的单菌落；
[0057] f、 将步骤 e筛选出的平板中成活率在 25%的单菌落用无菌竹签分别一一对 应接种到含筛选培养基 I的平板和含筛选培养基 Π的平板上， 在温度 29°C的培养箱 中培养 72 小时， 选择在筛选培养基 I平板上不生长而在筛选培养基 II平板上生长 旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
[0058] g、 再将步骤 f 筛选出的单菌落接种于含筛选培养基 III的平板上， 在温度 29 °C的培养籍中培养 60 小时， 选择 R 值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株， 其中 R 为 菌落产酸面积 /菌落面积； [ 0059 ] 热带假丝酵母菌诱变菌株的验证：
[0060] h、 将步骤 g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤 b种 子培养基进行种子培养， 再将培养好的种子接种到步骤 d发酵培养基中进行产酸培 养， 将新获得的诱变菌株在 20m 的反应器内以正构十二碳烷烃为底物， 在温度 29 °C, 通气量 0.6-1.6VVM ( ην'空气 /m:' 发酵液 . min ) 下培养 144 小时， 进行发酵试 验， 发酵结束经后处理得十二烷二元酸产品， 产酸量为 190g/L
[0061] 实施例 3 ：
[0062] 制备培养基：
[0063] a、 麦芽汁培养基： 12Brix 麦芽汁， 2% 琼脂；
[0064] b、 种子培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0g， 氯化钠 l. Og, 七水合硫酸镁 0.5g, 蔗糖 15. Og, 玉米浆 l. Og, 酵母浸膏 l. Og, 尿素 2.5g, 维生素 B10. lg， 正 构十三碳烷烃 nCl 340ml, 纯水 1000ml ；
[0065] c、 筛选培养基：
[0066] 筛选培养基 I ：各组份为磷酸二氢钠 2. 0g,磷酸氢二钾 5. 0g,硫酸铵 2.0g, 氯化钠 l. Og, 酵母浸膏 0.5g, 七水合硫酸镁 0.5g， 琼脂 20. 0g, 正构十三碳烷烃 nC1330ml, 纯水 lOQOml, pH7. 0 ；
[0067] 筛选培养基 II ： 各组汾为磷酸二氨钠 2. 0g,磷酸氢二钾 5.0g,氯化钠 1. 0g, 酵母浸膏 0.5g， 硫酸铵 2. 0g， 七水合琉酸镁 0.5g, 琼脂 20. 0g, 蔗糖 15. 0g, 纯水 1000ml, pH7. 0 ；
[0068] 筛选培养基 III ： 各组份为蔗糖 15. 0g, 磷酸二氢钠 1.0g, 磷酸氢二钾 5. 0g, 氯化钠 1. 0g， 七水合硫酸镁 0. 5g， 酵母浸膏 0.5g， 尿素 1.5g, 琼脂 20.0g, 正构 十三碳烷烃 nC1330ml, 纯水 1000ml, pH7.5, 酚红指示剂 1% ；
[0069] d、 发酵培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5. 0g， 氯化钠 l. Og, 七水合硫酸镁 0.5g, 蔗糖 15.0g， 玉米浆 l. Og, 酵母浸膏 l. Og, 无水醋酸钠 3. 0g， 尿素 2.0g, 维生素 B10. lg， 硫酸铵 2.0g， 丙烯酸 0. 001g, 正构十三碳烷烃 nCl 3300ml , 纯水 1000ml ；
[0070] 热带假丝酵母菌的诱变：
[0071] e、 将热带假丝酵母菌菌株接入歩骤 a麦芽汁斜面， 在温度 29°C的培养箱中 培养 48小时， 向斜面内加入 15ml 无菌水， 用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻 璃珠的 250ml 三角瓶中， 振荡 30分钟充分打散菌体， 分别吸取 10ml菌悬液于 50ml 无菌三角瓶中， 用钴 60γ-射线进行辐照， 辐照剂量为 0.7KGy, 将辐照后的菌悬液 进行梯度 103、 104, 105、 106 倍稀释， 分别取 0.2ml 涂麦芽汁平板， 每个稀释度 涂 3个平板， 在温度 29°C的培养箱中培养 60小时， 选择经辐照后平板中成活率在 25% 的热带假丝酵母菌的单菌落；
[0072] f、 将步骤 e筛选出的平板中成活率在 25»/»的单菌落用无菌竹签分别一一对 应接种到含筛选培养基 I的平板和含筛选培养基 Π的平板上， 在温度 29°C的培养箱 中培养 72 小时， 选择在筛选培养基 I平板上不生长而在筛选培养基 II平板上生长 旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
[0073] g、 再将步骤 f 筛选出的单菌落接种于含筛选培养基 m的平板上， 在温度 29 °C的培养箱中培养 60 小时， 选择 R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株， 其中 R 为 菌落产酸面积 /菌落面积；
[0074] 热带假丝酵母菌诱变菌株的验证：
[0075] h、 将步骤 g 得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤 b种 子培养基进行种子培养， 再将培养好的种子接种到步骤 d发酵培养基中进行产酸培 养， 将新获得的诱变菌株在 20m3 的反应器内以正构十三碳烷烃为底物， 在温度 29 °C, 通气量 0.6-1.6VVM (m3 空气 /or'发酵液 · min ) 下培养 144 小时， 进行发酵试 验， 发酵结束经后处理得十三垸二元酸产品， 产酸量为 185g/L。
[0076] 实施例 4 ：
[0077] 制备培养基：
[0078] a、 麦芽汁培养基： 12Brix 麦芽汁， 2% 琼脂；
[0079] b、 种子培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0g, 氯化纳 1.0g， 七水合硫酸镁 0.5g, 蔗糖 15.0g, 玉米浆 1.0g， 酵母浸膏 l. Og, 尿素 2.5g， 维生素 B10. lg, 正 构烷烃 nCll_nC1440ml， 纯水 1000ml ；
[0080] c、 筛选培养基：
[0081] 筛选培养基 I ：各组份为磷酸二氢钠 2.0g,磷酸氢二钾 5.0g,硫酸铵 2.0g, 氯化纳 l. Qg, 酵母浸膏 0.5g， 七水合硫酸镁 0.5g, 琼脂 20.0g， 正构烷烃 nCll-nC1430ml, 纯水 1000ml, pH7.0 ；
[0082] 筛选培养基 II ： 各组份为磷酸二氢钠 2. Og,磷酸氢二钾 5. Og,氯化钠 1. Og, 酵母浸膏 0.5g, 硫酸铵 2. Og, 七水合硫酸镁 0.5g, 琼脂 20.0g, 蔗糖 15.0g, 纯水 1000ml, pH7.0 ；
[0083] 筛选培养基 III ： 各组份为蔗糖 15.0g, 磷酸二氢钠 2.0g, 磷酸氢二钾 5.0g, 氯化纳 1.0g, 七水合硫酸镁 0.5g, 酵母浸膏 0.5g, 尿素 1.5g， 琼脂 20.0g, 正构 烷烃 nCll-nC1430ml, 纯水 1000ml, pH7.5, 酚红指示剂 1% ;
[0084] d、 发酵培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0g, 氯化钠 l. Og, 七水合硫酸镁 0.5g, 蔗糖 15.0g， 玉米浆 1.0g， 酵母浸膏 1.0g， 无水醋酸钠 3.0g， 尿素 2.0g, 维生素 B10. lg,硫酸铵 2.0g，丙烯酸 0.001g，正构烷烃 nCllnC14300ml，纯水 1000ml；
[0085] 热带假丝酵母菌的诱变：
[0086] e、 将热带假丝酵母菌菌株接入步骤 a麦芽汁斜面， 在温度 29°C的培养箱中 培养 48小时， 向斜面内加入 15ml无菌水， 用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻 璃珠的 250ral 三角瓶中， 振荡 30分钟充分打散菌体， 分别吸取 10ml菌悬液于 50ml 无菌三角瓶中， 用钴 60γ-射线进行辐照， 辐照剂量为 0.6KGy， 将辐照后的菌悬液 进行梯度 103、 104、 105. 106 倍稀释， 分别取 0.2ml 涂麦芽汁平板， 每个稀释度 涂 3 个平板， 在温度 29°C的培养箱中培养 60小时， 选择经辐照后平板中成活率在 20% 的热带假丝酵母菌的单菌落；
[0087] f、 将步骤 e 筛选出的平板中成活率在 20%的单菌落用无菌竹签分别一一对 应接种到含筛选培养基 I的平板和含筛选培养基 Π的平板上， 在温度 29°C的培养箱 中培养 72 小时， 选择在筛选培养基 I平板上不生长而在筛选培养基 Π平板上生长 旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
[0088] g、 再将步骤 f 筛选出的菌株接种于含筛选培养基 III的平板上， 在温度 29 °C的培养箱中培养 60 小时， 选择 R 值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株， 其中 R 为 菌落产酸面积 / 菌落面积；
[0089] 热带假丝酵母菌诱变菌株的验证：
[0090] h、 将歩骤 g 得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤 b种 子培养基进行种子培养， 再将培养好的种子接种到歩骤 d发酵培养基中进行产酸培 养， 将新获得的诱变菌株在 20m 的反应器内以正构十一碳烷烃或正构十二碳烷烃或 正构十三碳烷烃或正构十四碳烷烃为底物， 在温度 29 ， 通气量 0.6-1.6VVM (m3空 气 /m;发酵液 · min ) 下培养 144小时， 进行发酵试验， 发酵结束经后处理得十四烷 二元酸产品， 产酸量为 182g/L

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法， 其特征在于按下列步骤进 行：
制备培养基：
a、 麦芽汁培养基： 12Brix 麦芽汁， 2% 琼脂；
b、 种子培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0-6. Og, 氯化钠 1.0-1.5g， 七水合硫 酸镁 0.5-1. Og, 蔗糖 15.0-25. Og, 玉米浆 1.0-2. Og, 酵母浸膏 1.0-2.0g, 尿素 2.5-3. Og, 维生素 B10.1-0.3g, 正构烷烃 C8- CI 840- 50ml , 纯水 1000ml ；
c、 筛选培养基：
筛选培养基 I ： 各组份为磷酸二氢钠 2.0-3.0g, 磷酸氢二钾 5.0-6. Qg, 硫酸 铵 2.0-3.0g， 氯化钠 1.0-1.5g, 酵母浸膏 0.5-1.0g, 七水合硫酸镁 0.5-1. Og, 琼 脂 15.0-20.0g， 正构烷烃 nC8- nC1820-50nil, 纯水 1000ml, pH7.0 ；
筛选培养基 II ： 各组份为磷酸二氢钠 2.0-3.0g, 磷酸氢二钾 5.0-6.0g， 氯化 钠 1.0-1.5g, 酵母浸膏 0.5- 1.0g, 硫酸铵 2.0-3.0g, 七水合硫酸镁 0.5-1. Og, 琼 脂 15.0-20.0g， 蔗糖 15.0-20.0g, 纯水 1000ml, pH7.0 ；
筛选培养基 ΙΠ ： 各组份为蔗糖 15.0-20.0g, 磷酸二氢钠 2.0-3.0g， 磷酸氢二 钾 5.0-6.0g, 氯化钠 1.0- 1.5g, 七水合硫酸镁 0.5- 1.0g， 酵母浸膏 0.5- 1.0g, 尿 1.5-2.0g, 琼脂 15.0-20· 0g, 正抅烷烃 nC8- nC1820-50ml , 纯水 1000ml, pH7.5, 酚红指示剂 1% ；
d、 发酵培养基： 各组份为磷酸二氢钾 5.0-6.0g, 氯化钠 1.0- 1.5g, 七水合硫 酸镁 0.5-1.0g， 蔗糖 15.0- 25.0g， 玉米浆 1.0- 2.0g, 酵母浸膏 1.0-2.0g, 无水醋 酸钠 3.0- 4.0g， 尿素 2.0- 3.0g， 维生素 B10.1-0.3g， 硫酸铵 2.0-3.0g， 丙烯酸 0.001-0.002g, 正构烷烃 nC8-nC18300-400niI, 纯水 1000ml;
热带假丝酵母菌的诱变：
e、 将热带假丝酵母菌菌株接入麦芽汁培养基斜面， 在温度 28-34 的培养箱中 培养 24-48 小时， 向斜面内加入 15ml 无菌水， 用无菌接种环将菌体刮入无菌的含 有玻璃珠的 250ml 三角瓶中， 振荡 30 分钟充分打散菌体， 分别吸取 10ml 菌悬液 于 50ml无菌三角瓶中， 用钴 60γ- 射线进行辐照， 辐照剂量为 0.5-0.7KGy， 将辐 照后的菌悬液进行梯度稀释， 并涂麦芽汁平板， 在温度 28-34°C的培养箱中与对照 平板一起培养 36-72 小时， 选择经辐照后平板中成活率在 10- 40»/» 的热带假丝酵母 菌的单菌落； f、 将步骤 e筛选出的平板中成活率在 10 - 40%的单菌落分别一一对应接种到含 筛选培养基 I 的平板和含筛选培养基 II的平板上， 在温度 28- 34 'C的培养箱中培养 36-72 小时， 选择在筛选培养基 I平板上不生长而在筛选培养基 II平板上生长旺盛 的热带假丝酵母菌的单菌落；
g、 再将步骤 f 筛选出的单菌落接种于含筛选培养基 III的平板上， 在温度 28 - 34 ° 的培养箱中培养 36-72 小时， 选择 R 值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株， 其中 R 为菌落产酸面积 / 菌落面积；
热带假丝酵母菌诱变菌株的验证
h、 将步骤 g 得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤 b 种子 培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤 d发酵培养基中进行产酸培养。
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