CN1928100A - 生物合成生产十二碳二元酸的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用生物合成生产长链α、ω－二羧酸的方法，特别是高产十二碳二元酸(DC₁₂)的方法。所用微生物为CH－14－204突变菌株，属于热带假丝酵母(Candidatropicalis)。其特点是在微生物菌种接入含有C₁₁～C₁₈各种正烷烃为基质的培养基后，第一阶段，控制体系以菌体生长为主，也转化正烷烃生产二元酸；第二阶段，控制反应系统，以产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，控制系统只产酸，不长菌体。本方法用于转化正十二烷(nC₁₂)生产DC₁₂时，接种后67小时，产酸达110.7g/L，139小时，DC₁₂产量达到192.3g/L，到163小时，产量达到214g/L。

Description

生物合成生产十二碳二元酸的新方法

技术领域    本发明涉及微生物转化正烷烃生产α，ω-二羧酸，尤其是转化正十二烷(nC₁₂)，高产十二碳二元酸(DC₁₂)的方法。

背景技术    长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、树脂和医药等的重要原料。DC₁₂是合成高性能尼龙工程塑料尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料的重要原料。尼龙12是目前国际上开发出来碳链最长，质量最好，价格最高，年产量达到10万吨的高级尼龙工程塑料。尼龙12是1966年由德国Hüls公司和瑞士Emser公司投产，后来法国、日本、美国也均有生产，他们多采用纯化学方法，以丁二烯为原料，在高温、高压、催化剂条件下，经过7个复杂的反应步骤生产的，步骤多、收率低，成本高，我国目前还不能生产。如果以DC₁₂为原料合成尼龙1212，只需经过4个反应步骤，条件温和，步骤少，收率高，成本低，而且尼龙1212(双号码尼龙)比尼龙12(单号码尼龙)性能更优。是竞争力最强的合成方法。而DC₁₂自然界中不存在，化工上难以合成，因此，利用微生物特异的氧化能力，在常温常压下转化石油中的正十二烷，生产DC₁₂，开辟了DC₁₂的新来源，为尼龙1212、服装用高档热熔胶和高级涂料等的工业生产提供物美价廉的重要原料。

在专利文献中，有从正十二烷发酵生产十二碳二元酸的实验例，大都是实验室水平。在US 4339536中，有生产DC₁₂的实验例，但只达到45g/L水平，在公开号CN 1071951A中，其实验例2是异步发酵生产DC₁₂，在3L自动控制罐内DC₁₂达到102g/L，转化率为75％，而在专利号ZL 95117436.3中，实验例5表明，在3000L发酵罐中试，130小时，产酸145g/L。

发明内容    本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)CH-14-204，是以一株氧化正烷烃生产混合二元酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)：88～93，1980)为出发菌株，通过硝基胍、亚硝酸、紫外线和N⁺注入等多种诱变方法，经过多次反复诱变筛选培育出来的，能从C₁₁～C₁₈的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十二烷，高产出生产相应链长的二元酸。热带假丝酵母CH-14-204(以下简称CH-14-204)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.1783CH-14-204的生理特征如下：

一、糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。

二、同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤鲜醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。

三、生长素的需要：生物素++，维生素B₁++，维生素B₂+，维生素B₆+，维生素B₁₂+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。

四、其它：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。

形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。

培养特征：在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。

本发明的种子培养基：

(1)10Be’糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；

(2)10Be’糖度的麦芽汁液体培养基；

(3)烷烃种子培养基包含：KH₂PO₄ 6～12g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，蔗糖3～6g/L，重蜡40～70g/L，自来水配置，自然pH。

培养种子的过程为：取一接种环CH-14-204酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(φ15×180试管，每支装6～7mL培养基，灭菌后放成斜面)，于29～30℃培养40小时。取一支上述培养好的CH-14-204菌种全部刮入装有30mL烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于29～30℃ 220转/分的旋转摇床上培养40～48小时，作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的CH-14-204斜面菌种全部刮入装有500mL培养基的5000mL三角瓶中，于200转/分的旋转摇床29～30℃培养44～48小时，作为一级种子罐的种子。

用本发明的CH-14-204菌株生产长链二元酸，特别是十二碳二元酸的具体方法是：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液接入pH5.5～9.0，最好是6.0～6.8的含有15～30％(v/v)的C₁₁-C₁₈的正烷烃和85～70％(v/v)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，氯化钠0.5～2.5g/L，最好为1.0～2.0g/L，消泡剂400～1200ppm，重蜡或蔗糖15～30g/L及一些其他公知的营养源，在pH6.0～7.5下将上述混合物在25～34℃，最好在27～31℃通气发酵72～170小时。第一阶段，体系pH控制在6.0～6.8，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系pH控制7.0～8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体。从72小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)，碱金属磷酸盐可从KH₂PO₄或NaH₂PO₄中选一种。

发酵结束后，进行破乳分层，上层残油回收再用，放出中间清液，下层菌体层再处理一次或压滤；合并清液，加入适量活性炭在85～90℃脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至70～80℃，加HCl或H₂SO₄至pH3进行酸化结晶，冷却至30℃，压滤，空气吹干，烘干机烘干，得白色二元酸。

用本发明的CH-14-204菌株和发酵方法，可生产C₁₁～C₁₈的各种单一二元酸和混合二元酸。其中在50m³发酵罐，从nC₁₂发酵生产DC₁₂时，发酵163小时，产酸量达200g/L以上，转化率达到88％以上，后处理总收率达到85％以上，DC₁₂纯度达到98％以上。

具体完成方式    实例1.

(1)取一接种环CH-14-204菌种，涂布在Φ15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天。

(2)取上述菌种一支，接入装有30mL烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃在220转/分的旋转摇床上培养46小时。烷烃种子培养基中KH₂PO₄ 8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆3g/L，蔗糖5g/L，尿素3g/L，重蜡50mL/L，自来水配制，pH5.0，110℃灭菌30分钟。

(3)在装有15mL发酵培养基的500mL三角瓶中，接入3.5mL上述种子液，在220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH调一次pH至7.5～8.0。发酵培养基中含KH₂PO₄ 8g/L，酵母膏2g/L，玉米浆2.5g/L，NaCl 1g/L，尿素1.2g/L，蔗糖20g/L，nC₁₂(纯度＞99％)200mL/L，自来水配制，pH7.3，110℃灭菌30分钟。发酵结束后，用6mol HCl调pH至3。用乙醚提取，除去乙醚，得白色结晶，用标准NaOH溶液滴定，计算二元酸含量。结果DC₁₂产量为88.9g/L，DC₁₂纯度98.43％。

实例2.

按照实例1的方法，只是正烷烃用nC₁₁(纯度99％)结果DC₁₁产量为46.5g/L，DC₁₁纯度为98.2％。

实例3.

按照实例1的方法，只是正烷烃用nC₁₄(纯度98％)，不加重蜡，结果DC₁₄产量为72.3g/L，DC₁₄纯度为97.4％。

实例4.

按照实例1的方法，只是正烷烃用nC₁₇(纯度98％)，结果DC₁₇产量为54.1g/L，DC₁₇纯度为97.3％。

实例5.

(1)种子培养基及培养方法和发酵培养基同实例1。

(2)把3000mL培养两天，OD(×30，620nm)为0.81 pH 3.8，健壮，无杂菌种液接入装有700L种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃ 350转/分，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。

(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的700L种液接入装有6.5m³种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m³二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.7，培养40～48小时，作为发酵的种子。

(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的种液，接入装有33m³发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m³发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.5，开始时，nC₁₂4m³，30小时内，体系pH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生28.5g/L DC₁₂，然后体系pH在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到110.7g/L，70小时后每天补加一定量nC₁₂，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达192.3g/L，发酵到163小时结束，产酸量达214g/L。发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC₁₂，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H₂SO₄至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色粉末状DC₁₂产品。nC₁₂转化率为88.8％，后处理总收率达到90.5％，DC₁₂纯度达到98.65％。

Claims (8)

1、一种利用生物合成生产长链α，ω-二羧酸的方法，其特征在于：

(1)把用一株热带假丝酵母CH-14-204(Candida tropicalis)培养成的种母液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)10～18个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。发酵培养基组成为：碱金属磷酸盐4～15克/升，氯化钠0.5～2.5克/升，蔗糖10～30克/升，硝酸盐1～10克/升，尿素1～5克/升，吐温0.2～1.5克/升及其他营养源。

(2)上述混合液在24～34℃下转化48～168小时，然后将生产的α，ω-二羧酸进行分离纯化。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于混合液中正烷烃的含量为15～40％(v/v)，发酵培养基含量85～60％(v/v)。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养基的组成中：碱金属磷酸盐6～10克/升，硝酸盐2～8克/升，尿素1.5～2.5克/升，吐温0.4～0.8克/升。

4、根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于所说的正烷烃含有11～13个碳原子。

5、根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于所说的正烷烃含有12个碳原子。

6、根据权利要求1和3所述的方法，其特征是碱金属磷酸盐最好是钠盐或钾盐；硝酸盐最好是KNO₃或NaNO₃，吐温最好是吐温60或吐温80。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征是发酵混合液的温度控制在26～32℃，pH值为6.5～8.5。

8、热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC 1783菌株。