CN1225546C - 用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法，属于生物法生产虾青素技术。该方法采用主要成分包括乙酸、丙酮酸、柠檬酸的红发夫酵母、粘红酵母、深红酵母的发酵残液，培养雨生红球藻和绿球藻生产虾青素，其过程包括调整酵母发酵残液，在发酵残液中加入无机盐配制成培养基，在容器内按照培养条件培养雨生红球藻或绿球藻，经过分离提取虾青素。与雨生红球藻和绿球藻光合自养及混合营养(添加有机碳源)两种培养方法相比，本发明优点在于：虾青素产量较上述两种方法雨生红球藻虾青素产量最高分别提高2.5倍和0.37倍；能节省碳源和氮源，提高了糖的利用率和转化率，降低了生产成本；发酵废液实现零排放。
Description
技术领域
本发明提供了一种利用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法，属于生物法生产虾青素技术。
背景技术
虾青素是一种红色的次生类胡萝卜素，具有极强的生物抗氧化性，在医药，食品，化妆品及水产业等方面有着广阔的应用前景。
红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，深红酵母(Phadotoralarubra)；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，绿球藻(Chlorococcum sp)，能够在细胞内合成并积累虾青素，是生物技术法生产虾青素所采用的两类主要微生物。雨生红球藻和绿球藻是含叶绿素的单细胞藻，除能以二氧化碳为碳源进行光合作用外，同时又能吸收利用有机酸盐(如乙酸盐，丙酮酸盐等)和糖(如葡萄糖等)等做碳源进行化能异养代谢，并且混合营养(光合作用加异养代谢)比光合自养的生物量和虾青素产量都高很多。雨生红球藻和绿球藻适于微偏碱性环境，生长速度较慢，但虾青素含量高；红发夫酵母，粘红酵母和深红酵母能以各种糖类，糖蜜，甘油，玉米淀粉以及木材水解液等多种有机物质为底物进行发酵，发酵过程中产生大量的有机酸并同时在细胞内积累虾青素。它们适于偏酸性环境，繁殖速度快，但虾青素含量低。
目前生物技术生产虾青素的方法都是将上述藻类或酵母单独地进行培养或发酵。在雨生红球藻和绿球藻的培养过程中，由于其在光合自养条件下的生长速度较慢，因此通常添加有机酸盐或糖作为辅助碳源以提高生物量和虾青素产量；在红发夫酵母，粘红酵母和深红酵母的发酵过程中，细胞代谢产生的有机酸使发酵液的pH迅速下降，抑制了酵母细胞的生长和虾青素的积累，因此通常采用加碱中和的方法控制pH。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法，该方法过程简单，生产成本低。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。所述的酵母为红发夫酵母、粘红酵母或深红酵母，采用主要成分包括乙酸、丙酮酸、柠檬酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸的红发夫酵母、粘红酵母、深红酵母的发酵残液，培养雨生红球藻和绿球藻生产虾青素的方法，其特征在于，包括下列具体步骤：
1、直接采用有机碳(羧酸盐或糖)的浓度达0.1-5.0g/l，残氮浓度达0.01-3.0g/l的酵母发酵残液作为基本培养基，或对酵母发酵残液加羧酸盐或糖进行调整，使酵母发酵残液中的有机碳的浓度达到0.1-5.0g/l，残氮浓度为0.01-3.0g/l后作为基本培养基。
2、向如步骤1所述的基本培养基中加入下述无机盐，无机盐用量的浓度单位为mg/l，MgSO4·7H2O：25-175；CaCl2·2H2O：5-55；K2HPO4：15-120；KH2PO4：30-225；NaCl2：5-60；ZnSO4·7H2O：0.50-30；MnCl2.4H2O：0.10-6.5；MoO3：0.1-2.5；CuSO4·5H2O：0.20-3.2；Co(NO3)2·6H2O：0.01-2.0；H3BO3：1.5-22.5；EDTANa2：5-88；FeSO4·7H2O：0.1-6.5，用1.0M的NaOH调节pH值调至6-8，配制成培养基。
3、在反应器内按容器容积的10-60％装入如步骤2所述的培养基，灭菌后接种雨生红球藻或绿球藻，接种液的细胞密度为0.5×105-2×105个细胞/ml，接种量为1-20％；培养过程中，温度控制在16-28℃，转速为50-350rpm，光照控制在1500-15000lx之间，pH控制在6-8，培养72-168小时。
4、用离心分离法或膜过滤法收集细胞，然后在避光的条件下，用1∶6的二甲基亚砜和丙酮提取虾青素。
本发明与雨生红球藻和绿球藻光合自养及混合营养(添加有机碳源)两种培养方法相比，主要有如下优点：生物量较上述两种方法雨生红球藻细胞干重最高分别提高了3.5倍和0.3倍，绿球藻提高了3.7倍和0.36倍；虾青素产量较上述两种方法雨生红球藻虾青素产量最高分别提高2.5倍和0.37倍，绿球藻提高了4.6倍和0.5倍；将酵母发酵和藻类培养两种生产天然虾青素的方法联合起来，能节省碳源和氮源，提高了糖的利用率和转化率，降低了生产成本；发酵废液实现零排放，有利于保护生态环境。
具体实施方式
采用不需要添加碳源和氮源的酵母发酵残液加入下列的无机盐，各种无机盐的浓度(mg/l)如下：MgSO4·7H2O：85；CaCl2·2H2O：35；K2HPO4：80；KH2PO4：180；NaCl2：25；ZnSO4·7H2O：8.0；MnCl2·4H2O：1.6：MoO3：0.8；CuSO4·5H2O：1.82；Co(NO3)2·6H2O：0.58；H3BO3：12.2；EDTANa2：50；FeSO4·7H2O：5.2。用1.0M的NaOH将按上述条件制备的培养基的pH调至7.8。
在反应器内装入上述培养基，装液量为反应器容积的50％，先用该培养基对藻种进行预培养48小时，使细胞数量达到1.2×105个细胞/ml。然后按10％的接种量进行接种；培养过程中，温度控制在25℃，转速180rpm，光照前96小时控制在2000lx，然后调至12000lx，pH控制在7.8。培养168小时。用离心分离法收集细胞测定生物量和虾青素含量。在上述的培养基中再分别加入不同碳源和氮源，其实验结果如下：
(1)葡萄糖为碳源(20g/l)，酵母膏为氮源(3g/l)的粘红酵母发酵残液培养雨生红球藻和绿球藻生物量分别为(细胞干重g/l)：3.86，2.21；虾青素产量(mg/l)分别为：11.52，5.33
(2)葡萄糖为碳源(20g/l)，蛋白胨为氮源(3g/l)的粘红酵母发酵残液培养雨生红球藻和绿球藻。生物量(细胞干重g/l)：4.33，2.52；虾青素产量(mg/l)：13.29，8.11
(3)葡萄糖为碳源(20g/l)，尿素为氮源(3.5g/l)的深红酵母发酵残液培养雨生红球藻和绿球藻。生物量(细胞干重g/l)：4.16，2.96；虾青素产量(mg/l)：10.11，5.23
(4)葡萄糖为碳源(20g/l)，(NH4)2SO4为氮源(3.5g/l)的红发夫酵母发酵残液培养雨生红球藻和绿球藻。
生物量(细胞干重g/l)：3.02，1.89；虾青素产量(mg/l)：8.83，3.99
(5)以蔗糖为碳源(20g/l)，(NH4)2SO4为氮源(3.5g/l)的深红酵母发酵残液培养雨生红球藻和绿球藻。
生物量(细胞干重g/l)：2.86，1.53；虾青素产量(mg/l)：6.61，3.08
(6)以糖蜜为碳源(20g/l)，尿素为氮源(3.5g/l)的红发夫酵母发酵残液培养雨生红球藻和绿球藻。
生物量(细胞干重g/l)：4.53，2.86；虾青素产量(mg/l)：12.36，8.52
(7)用乙酸钠(2g/l)代替红酵母发酵残液，并添加NaNO3(0.2g/l)，培养雨生红球藻和绿球藻。
生物量(细胞干重g/l)：3.56，2.11；虾青素产量(mg/l)：9.71，5.68
(8)无机盐组成的培养基不添加红酵母发酵残液和其他有机碳源(光合自养)，只添加NaNO3(0.2g/l)，培养雨生红球藻和绿球藻。
生物量(细胞干重g/l)：1.01，0.61；虾青素产量(mg/l)：3.89，1.52。
Claims (1)
1、一种用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法，所述酵母为红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)或深红酵母(Phadoto ralarubra)，该方法采用主要成分包括乙酸、丙酮酸、柠檬酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸的红发夫酵母、粘红酵母、深红酵母的发酵残液，培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和绿球藻(Chlorococcum sp)生产虾青素，其特征在于，包括下列具体步骤：
1)直接采用有机碳的浓度达0.1-5.0g/l，残氮浓度达0.01-3.0g/l的酵母发酵残液作为基本培养基，或对酵母发酵残液加羧酸盐或糖进行调整，使酵母发酵残液中的有机碳的浓度达到0.1-5.0g/l，残氮浓度为0.01-3.0g/l后作为基本培养基；
2)向如步骤1)所述的基本培养基中加入下述无机盐，无机盐用量的浓度单位为mg/l，MgSO4·7H2O：25-175；CaCl2·2H2O：5-55；K2HPO4：15-120；KH2PO4：30-225；NaCl2：5-60；ZnSO4·7H2O：0.50-30；MnCl2·4H2O：0.10-6.5；MoO3：0.1-2.5；CuSO4·5H2O：0.20-3.2；Co(NO3)2·6H2O：0.01-2.0；H3BO3：1.5-22.5；EDTANa2：5-88；FeSO4·7H2O：0.1-6.5，用1.0M的NaOH调节pH值调至6-8，配制成培养基；
3)在反应器内按容器容积的10-60％装入如步骤2)所述的培养基，灭菌后接种雨生红球藻或绿球藻，接种液的细胞密度为0.5×105-2×105个细胞/ml，接种量为1-20％；培养过程中，温度控制在16-28℃，转速为50-350rpm，光照控制在1500-15000lx之间，pH控制在6-8，培养72-168小时；
4)离心分离法或膜过滤法收集细胞，然后在避光的条件下，用1∶6的二甲基亚砜和丙酮提取虾青素。
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