CN114426991B - 一种优化的工程菌酿酒酵母w2发酵体系及其应用 - Google Patents
一种优化的工程菌酿酒酵母w2发酵体系及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114426991B CN114426991B CN202210056026.2A CN202210056026A CN114426991B CN 114426991 B CN114426991 B CN 114426991B CN 202210056026 A CN202210056026 A CN 202210056026A CN 114426991 B CN114426991 B CN 114426991B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- saccharomyces cerevisiae
- lycopene
- liquid
- engineering bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 48
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title claims abstract description 48
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 33
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 claims abstract description 58
- JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N Lycophyll Natural products OC/C(=C/CC/C(=C\C=C\C(=C/C=C/C(=C\C=C\C=C(/C=C/C=C(\C=C\C=C(/CC/C=C(/CO)\C)\C)/C)\C)/C)\C)/C)/C JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N 0.000 claims abstract description 58
- OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N lycopene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CCC=C(C)C OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N 0.000 claims abstract description 58
- 229960004999 lycopene Drugs 0.000 claims abstract description 58
- 235000012661 lycopene Nutrition 0.000 claims abstract description 58
- 239000001751 lycopene Substances 0.000 claims abstract description 58
- ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N trans-isorenieratene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/c1c(C)ccc(C)c1C)C=CC=C(/C)C=Cc2c(C)ccc(C)c2C ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N 0.000 claims abstract description 58
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 28
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 24
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 13
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 abstract description 7
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 abstract description 5
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 abstract description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
本发明公开了一种优化的工程菌酿酒酵母W2发酵体系及其应用，属于生物发酵技术领域。本发明是将工程菌酿酒酵母W2按12％的接种量将其种子液接种于发酵培养基中，发酵条件：温度30℃，转速200rpm，发酵时间120h，优选发酵培养基甘蔗糖蜜液含量5.31％，玉米浆干粉含量2.65％，初始pH为4.7。在此条件下做三组平行试验所得的番茄红素浓度的平均值为283.18mg/L，能达到现有高成本培养基的产率。本发明使用的发酵培养基氮碳源来源广泛，价格便宜，且番茄红素得率高，在降低成本的前提下，提高了产量，具有较高的实用价值和实用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种优化的工程菌酿酒酵母W2发酵体系及其应用。
背景技术
番茄红素又称ψ—胡萝卜素，是一种不含氧的类胡萝卜素，与其他类胡萝卜素相比具有最优的清除自由基的效果，同时番茄红素还表现出抗癌活性，如乳腺癌、胰腺癌、前列癌及皮肤癌等。
目前生产番茄红素主要有天然产物提取法、化学合成法以及发酵法。天然产物提取法是目前获取番茄红素的主流方法，但是通常每吨西红柿中仅含20克番茄红素，且提取工艺复杂、提取技术含量高、生产成本极其昂贵。且番茄生产受产地及季节等条件的限制，无法满足市场对番茄红素的需求。从生产成本及原料、产品活性和纯度等方面考虑，微生物发酵法具有明显的优势，是番茄红素非常理想的产业化生产方法。目前利用基因工程菌生产番茄红素已成为研究的热点，而通过工程菌酿酒酵母W2生产番茄红素具有天然、绿色、无毒、无溶剂残留、无重金属残留、生产周期短等优点，且生产原料来源广泛而廉价。
碳源、氮源、无机盐、维生素等是酿酒酵母培养体系的重要成分。酿酒酵母培养体系种类多，培养体系的不同成分、不同浓度对酿酒酵母的菌体生长影响差异大。现常用酿酒酵母菌体系为酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextract peptonedextrose，YPD)培养体系，该体系的碳源与氮源为葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉。在工业生产中，这三种物质需求量大，价格贵，阻碍酿酒酵母菌发酵的工业化生产。因此为了降低工程菌酿酒酵母W2工业化生产成本的同时提高其番茄红素浓度，优化酿酒酵母培养体系十分必要。废糖蜜是糖厂的副产物，糖蜜中含有丰富的酵母，是可以利用的可发酵性糖。随着我国制糖工业的发展，糖蜜的产量日益增加，进行废糖蜜利用的研究是非常必要的。玉米浆粉是经过特殊工艺：除去杂质、喷雾干燥而制得的，这样即减少了杂质和色素对微生物生长、代谢的影响，从而发酵时更加稳定；同时还可以降低后期的产品提取难度。尤其适用于要求比较高的基因工程菌发酵使用。
因此，如何有效利用响应面法优化工程菌发酵培养基是本发明需要解决的问题。
发明内容
本发明针对现有技术中酿酒酵母的番茄红素产率较低的不足，在单因素试验基础上，设计Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验，采用响应面法进行优化，提供一种产番茄红素酿酒酵母的低成本发酵培养基及其应用，利用该培养基，能够有效地获得较高密度菌体量，提高番茄红素的产量。
本发明的第一个目的是提供一种产番茄红素酿酒酵母的发酵培养基，其含有甘蔗糖蜜液50-60g/L，玉米浆干粉20-30g/L，pH为4.5-5。
优选地，所述的发酵培养基含有甘蔗糖蜜液53.1g/L，玉米浆干粉26.5g/L，pH为4.7。
本发明的第二个目的是提供所述的发酵培养基在生产番茄红素中的应用。
优选地，所述的应用包括以下步骤：a.将保存的产番茄红素酿酒酵母进行活化、培养获得种子液；b.将步骤a得到的种子液接种于权利要求1所述的发酵培养基中进行发酵；c.发酵完成后，然后收集和分离番茄红素。
更优选地，所述的产番茄红素酿酒酵母为工程菌酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W2，其保藏编号为GDMCC No：61335。
更优选地，所述接种的量为12％。
更优选地，所述发酵的温度为30℃。
更优选地，所述发酵的转速为200rpm。
更优选地，所述发酵的时间为120h。
更优选地，所述的将保存的产番茄红素酿酒酵母进行活化、培养获得种子液是将产番茄红素酿酒酵母活化，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃摇床震荡培养12小时后，按1％接种量将菌液转接于新的YPD液体培养基中，培养12小时后作为种子培养液。
更优选地，所述的YPD液体培养基，其成分为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明使用的发酵培养基氮碳源来源广泛，价格便宜，且番茄红素得率高，在降低成本的前提下，提高了产量，具有较高的实用价值和实用前景。
本发明的Saccharomyces cerevisiae W2，于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：GDMCC No：61335。
附图说明
图1为本发明中甘蔗糖蜜含量对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的影响；
图2为本发明中玉米浆干粉含量对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的影响；
图3为本发明中初始pH对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的影响；
图4为本发明中温度对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的影响；
图5为本发明中接种量对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的影响；
图6为本发明中发酵培养时间含量对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的影响；
图7为本发明中甘蔗糖蜜含量与玉米浆干粉含量对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的三维响应面图和二维等高线图；
图8为本发明中甘蔗糖蜜含量与pH对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的三维响应面图和二维等高线图；
图9为本发明中玉米浆干粉含量与pH对工程菌酿酒酵母W2发酵番茄红素产量的三维响应面图和二维等高线图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1单因素实验
YPD液体培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水；制平板添加琼脂20g/L。
将保存的工程菌酿酒酵母W2(保藏编号为：GDMCC No：61335)在YPD平板上活化，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃摇床震荡培养12小时后，按1％接种量将菌液转接于YPD液体培养基中，培养12小时后作为种子液。将得到的种子液，按一定接种量接入成分有甘蔗糖蜜、玉米浆干粉的发酵培养基中，调节初始pH，装液量50ml/250ml，其中用八层纱布和四层报纸封口，设置好发酵温度、时间。分别考察以下各因素对番茄红素产量的影响。初始培养条件：甘蔗糖蜜含量为4％，玉米浆干粉含量为2％，余量为水，pH为5，发酵温度为30℃，发酵时间为96h，接种量为体积比10％。单因素实验保持其他因素不变。所述含量均指质量分数。
实验设置甘蔗糖蜜含量分别为2％，4％，6％，8％，10％，玉米浆干粉含量为2％，pH为5，发酵温度为30℃，发酵时间为96h，接种量为10％。
实验设置玉米浆干粉含量分别为1％，2％，4％，6％，8％，甘蔗糖蜜含量为4％，pH为5，发酵温度为30℃，发酵时间为96h，接种量为10％。
实验设置pH分别为4，4.5，5，5.5，6，甘蔗糖蜜含量为4％，玉米浆干粉含量为2％，发酵温度为30℃，发酵时间为96h，接种量为10％。
实验设置发酵温度分别为25℃，28℃，30℃，32℃，35℃，甘蔗糖蜜含量为4％，玉米浆干粉含量为2％，pH为5，发酵时间为96h，接种量为10％。
实验设置发酵时间分别为72h，96h，120h，144h，168h，甘蔗糖蜜含量为4％，玉米浆干粉含量为2％，pH为5，发酵温度为30℃，接种量为10％。
实验设置接种量分别为5％，10％，15％，20％，甘蔗糖蜜含量为4％，玉米浆干粉含量为2％，pH为5，发酵时间为96h，发酵温度为30℃。
由上述实施方式中所获得的发酵液进行番茄红素浓度测定实验，具体叙述如下：
向1mL发酵液中加入3mol/L的盐酸1mL，在沸水浴中煮沸4min，迅速放在冰上冷却。离心(10000r/min，10min)水洗三次，直至发酵液的上清无色。这一步的目的是为了洗去培养基的杂质。之后利用超声波辅助破碎细胞壁，向离心后的菌体中加入3mL的丙酮超声萃取，超声波细胞破碎仪的功率为20HZ，超声三秒，暂停三秒，每一个样品超声3min，之后反复萃取直至细胞碎片呈无色。
将超声破碎细胞后的含有番茄红素的丙酮浸提液离心(10000r/min，10min)，得上清液即为番茄红素提取液，如细胞碎片中仍有色素，加丙酮进一步超声破碎细胞壁提取，合并上清液。将浸提液适当稀释后用紫外可见分光光度计在470nm下测定吸光度值。番茄红素产量计算公式为：式中A为稀释样品的吸光度读数(0.5AU)，V1为稀释因子(10×)，A1％为1％溶液的吸光度(即吸光系数)；C1％是1％溶液的浓度(10mg/mL)。
单因素实验结果如下：
a.不同甘蔗糖蜜含量的影响：结果如图1所示，甘蔗糖蜜含量为4％时，番茄红素浓度最高。因此，选择甘蔗糖蜜添加量4％为响应面优化含量。
b.不同玉米浆干粉含量的影响：结果如图2所示，玉米浆干粉含量为2％时，番茄红素浓度最高。因此，选择玉米浆干粉添加量2％为响应面优化含量。
c.不同pH的影响：结果如图3所示，初始pH为5时，番茄红素浓度最高。因此，选择初始为5作为响应面优化含量。
d.不同温度的影响：结果如图4所示，培养温度为30℃时，番茄红素浓度最高。因此，选择温度30℃作为工程菌酿酒酵母W2发酵培养的最适温度。
e.不同接种量的影响：结果如图5所示，接种量为10％时，番茄红素浓度最高。
f.不同发酵时间的影响：结果如图6所示，发酵时间为120h时，番茄红素浓度最高。因此，选择120h作为最适发酵时间。
实施例2响应面实验
将保存的工程菌酿酒酵母W2在YPD培养基平板上活化，挑取单菌接种于YPD液体培养基中，30℃摇床震荡培养12小时后，按1％接种量将菌液转接于YPD液体培养基中，培养12小时后作为种子培养液；
将得到的种子液，按12％的接种量将种子培养液接种于低成本发酵培养基中，装液量50ml/250ml，其中用八层纱布和四层报纸封口，发酵条件：温度30℃，转速200rpm，发酵时间120h，其中甘蔗糖蜜，玉米浆干粉和pH按照利用Design Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken响应面优化设计，以番茄红素产量为响应值，采用三因素三水平的响应面分析法优化工程菌酿酒酵母W-2发酵培养基。
基于单因素实验结果，利用Design Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken设计3因素3水平实验，以番茄红素浓度为响应值，实验因素水平和实验设计方案如表1和表2所示：
表1响应面实验因素水平设计
表2响应面实验设计方案
采用统计软件Design-expert 8.0.5对模型的实验结果进行拟合分析，得到多元二次回归方程：Y＝+280.09+14.16A-11.47B+10.15C+16.12AB+4.79AC-2.69BC-15.64A2-10.22B2-30.66C2。其实验结果和方差分析如表3和4所示；响应面实验结果如下：
表3响应面设计实验结果
表4响应面实验结果的分析
注:**P<0.01为极显著性差异，*P<0.05为显著差异。
由表4可知，模型P值为0.0001，回归项极显著(P＜0.01)，说明本模型有效；失拟项P值为0.0517，失拟项不显著(P＞0.05)，说明该模型自变量与因变量之间函数关系极显著，几乎不存在失拟现象；本模型的决定系数R2为97.39％，调整决定系数R2adj为94.03％，变异系数(coef-ficient ofvariation，CV)为2.51％，说明此模型显著，拟合度好，可以用于工程菌酿酒酵母W2培养体系优化与番茄红素浓度预测。根据各因素P值大小，一次项A、B、C对工程菌酿酒酵母W2发酵产番茄红素的浓度影响极显著(P＜0.01)，二次项A2、C2对工程菌酿酒酵母W2发酵产番茄红素的浓度影响极显著(P＜0.01)。依据F值，将3个因素对工程菌酿酒酵母W2影响大小进行排序，影响顺序为甘蔗糖蜜＞玉米浆干粉＞pH。
实验模型的3D图和等高线图如图7-9所示，甘蔗糖蜜，玉米浆干粉和pH的曲面倾斜度高，说明各因素对工程菌酿酒酵母W2发酵产番茄红素的浓度具有显著影响；这与方差分析结果一致。
验证实验
根据响应面的模型，得到工程菌酿酒酵母W2发酵产番茄红素的最佳发酵条件为：按12％的接种量将种子培养液接种于低成本发酵培养基中，装液量50ml/250ml，其中用八层纱布和四层报纸封口，发酵条件：温度30℃，转速200rpm，发酵时间120h，其中发酵培养基中经响应面优化得到甘蔗糖蜜液含量5.31％，玉米浆干粉含量2.65％，初始pH经1mol/LNaOH碱溶液调节为4.7。在此条件下做三组平行试验，使用实施例1所述的方法测得番茄红素浓度的平均值为283.18mg/L，与理论值相对误差为2.09，表明采用的响应面优化法参数可靠准确。
对比例：
同时配制专利申请号2020116323342中的培养基，即甘蔗糖蜜液35g/L，玉米浆干粉20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，MgSO4.7H2O 3g/L，硫酸钾5g/L，余量为水。操作步骤和其他条件与实施例2相同，在此条件下做三组平行试验，使用实施例1所述的方法测得番茄红素浓度的平均值为92.07mg/L。
Claims (3)
1.发酵培养基在生产番茄红素中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
a、将保存的产番茄红素酿酒酵母进行活化、培养获得种子液；
b、将步骤a得到的种子液接种于发酵培养基中进行发酵；
c、发酵完成后，然后收集和分离番茄红素；
所述的产番茄红素酿酒酵母为工程菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W2，其保藏编号为GDMCC No：61335；
所述的发酵培养基，其含有甘蔗糖蜜液53.1g/L，玉米浆干粉26.5g/L，pH为4；
所述接种的量为12％；
所述发酵的温度为30℃；
所述发酵的时间为120h。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的将保存的产番茄红素酿酒酵母进行活化、培养获得种子液是将产番茄红素酿酒酵母活化，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃摇床震荡培养12小时后，按1％接种量将菌液转接于新的YPD液体培养基中，培养12小时后作为种子培养液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的YPD液体培养基，其成分为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210056026.2A CN114426991B (zh) | 2022-01-18 | 2022-01-18 | 一种优化的工程菌酿酒酵母w2发酵体系及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210056026.2A CN114426991B (zh) | 2022-01-18 | 2022-01-18 | 一种优化的工程菌酿酒酵母w2发酵体系及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114426991A CN114426991A (zh) | 2022-05-03 |
| CN114426991B true CN114426991B (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=81313834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210056026.2A Active CN114426991B (zh) | 2022-01-18 | 2022-01-18 | 一种优化的工程菌酿酒酵母w2发酵体系及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114426991B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200034867A (ko) * | 2018-09-21 | 2020-04-01 | 한국생산기술연구원 | 베타카로틴을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 베타카로틴의 생산방법 |
| CN112779295A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-11 | 广东博沃特生物科技有限公司 | 一种产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基 |
| CN113881584A (zh) * | 2021-09-16 | 2022-01-04 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一株经航天育种技术选育的酿酒酵母及其突变位点应用 |
-
2022
- 2022-01-18 CN CN202210056026.2A patent/CN114426991B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200034867A (ko) * | 2018-09-21 | 2020-04-01 | 한국생산기술연구원 | 베타카로틴을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 베타카로틴의 생산방법 |
| CN112779295A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-11 | 广东博沃特生物科技有限公司 | 一种产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基 |
| CN113881584A (zh) * | 2021-09-16 | 2022-01-04 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一株经航天育种技术选育的酿酒酵母及其突变位点应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Engineering a growth-phase-dependent biosynthetic pathway for carotenoid production in Saccharomyces cerevisiae;Buli Su等;《J Ind Microbiol Biotechnol》;参见全文 * |
| 番茄红素高产菌株发酵条件优化;杨润蕾等;《安徽农业科学》;参见全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114426991A (zh) | 2022-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Svetlitchnyi et al. | Single-step ethanol production from lignocellulose using novel extremely thermophilic bacteria | |
| Ge et al. | A shortcut to the production of high ethanol concentration from Jerusalem artichoke tubers | |
| CN102719371B (zh) | 拜氏梭菌及其以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法 | |
| CN102174433B (zh) | 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用 | |
| US20080085536A1 (en) | Production of Cellulose in Halophilic Photosynthetic Prokaryotes (Cyanobacteria) | |
| CN101633896B (zh) | 一种耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株及其应用 | |
| CN103403155A (zh) | 新型酿酒酵母菌株 | |
| CN104673712A (zh) | 一株同步利用葡萄糖与木糖生产醇类燃料的菌株及其应用 | |
| CN103421850A (zh) | 一种利用丰富栅藻生产生物乙醇的方法 | |
| CN108841889B (zh) | 利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法 | |
| CN102146345B (zh) | 一种乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株及菌株筛选方法 | |
| Wang et al. | Research on separation, identification, and kinetic characterization of mixed photosynthetic and anaerobic culture (MPAC) for hydrogen production | |
| CN114426991B (zh) | 一种优化的工程菌酿酒酵母w2发酵体系及其应用 | |
| CN101948759B (zh) | 一种深黄被孢霉及其应用 | |
| CN116200286B (zh) | 一株高效糖化纤维素的热纤梭菌及其应用 | |
| Modi et al. | Isolation and characterization of xylose fermenting yeast from different fruits for bioethanol production | |
| CN102174434B (zh) | 一株高丁醇比贝氏梭菌及其应用 | |
| CN112779295B (zh) | 一种产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基 | |
| CN1141377C (zh) | 高海藻糖含量的酿酒酵母及其生产方法 | |
| CN101906454B (zh) | 从酵母菌中提取虾青素和谷胱甘肽的方法 | |
| CN101519638B (zh) | 一种生产酒精的方法及其专用克鲁斯假丝酵母菌株 | |
| CN104178438A (zh) | 一株适合于糖蜜发酵生产高纯度l-乳酸的德式乳酸杆菌及发酵方法和应用 | |
| CN103667147B (zh) | 一株高阿魏酸抗逆性拜氏梭菌及其应用 | |
| CN103898010A (zh) | 一株高耐受性拜氏梭菌及其应用 | |
| Saeid et al. | Isolation and Identification of the Hanseniaspora opuntiae MK 460485 as an efficient strain for ethanol production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |