CN101519638B - 一种生产酒精的方法及其专用克鲁斯假丝酵母菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产酒精的方法及其专用克鲁斯假丝酵母菌株。本发明所提供的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)64-3 C6MCC No.2241菌株具有耐乙酸和高产酒精的能力，对高浓度的酒精、H2O2、冻融和热击有强耐受性。应用本发明的方法，在含有0.8％乙酸的培养基中，葡萄糖对酒精的转化率达80±1.10％。应用本发明，酒精产量为73.58±1.54g l-1-94.90±2.65g l-1，葡萄糖对酒精的转化率为92.95±2.59％-96.12±2.01％。本发明克服了现有技术的缺欠，提高了产酒精酵母的耐酸性及其它耐逆性，为提高酒精生产效率及利用生物质生产酒精奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种生产酒精的方法及其专用克鲁斯假丝酵母菌株。
背景技术
酒精作为传统的生物发酵产品和潜力巨大的燃料，被公认为最具发展前景的可再生清洁能源之一。随着石油资源的日渐枯竭，酒精已替代部分汽油，需求逐年增长。
在酒精发酵过程中，酵母细胞会遇到一系列的环境压力，包括高浓度的酒精和发酵或预处理过程的某些副产物(Narendranath，N.V.et al：J.Ind.Microbiol.Biotechnol.26：171-177，2001)。生物质预处理及酒精发酵的副产物乙酸，对酵母的生长和代谢都有抑制作用，在酒精生产中特别引人关注。乙酸会引起酵母延滞期延长、降低生长和发酵速度、减少酒精产量，浓度高时甚至导致酵母细胞死亡(Graves，T.et al：Appl.Microbiol.Biotechnol.73：1190-1196，2007)。乙酸与酒精对抑制酵母的生长和发酵具有协同作用。一方面，在酒精发酵过程中乙酸的产生是不可避免的(Skinner，K.Aet al：J.Ind.Microbiol.Biotechnol.31：401-408，2004)；另一方面，在利用生物质生产酒精的过程中，乙酸普遍存在于木质纤维素等生物质的水解物中(Keating，J.D.et al：Biotechnol.Bioeng.93，1196-1206，2006)。因此，提高酵母菌的耐酸性已成为从生物质发酵酒精技术的关键之一。由于耐酸性等耐逆性表型是由多基因决定的，且对耐酸性的机理目前并不是很清楚，提高酵母菌的耐酸性及其它耐逆性是很困难的(Kawahata，M.FEMSYeast Res.6：924-936，2006)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株耐酸产酒精的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)菌株。
本发明所提供的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)，名称为G4-3，已于2007年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2241。
克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241是以克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)GL648作为出发菌株，利用基因组改组(genome shuffling)的方法得到的，对高浓度的酒精、H2O2、冻融及热击等环境压力具有强耐受性。
本发明的第二个目的是提供一种利用克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3CGMCC No.2241生产酒精的方法。
本发明所提供的生产酒精的方法，是发酵克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241得到酒精。
所述克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241的发酵培养基配制方法如下：150-200g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
上述发酵培养基具体的配制方法如下：177.5g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
所述克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241的发酵条件可为：在30-40℃、100-200rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养至OD600为3.0，接着30-40℃静态发酵22-26小时。
上述发酵条件具体可为：在30℃、150rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养至OD600为3.0，接着30℃静态发酵24小时。
所述克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241可以5-10％(体积/体积)的接种量接种到上述发酵培养基中。
上述接种量具体可为8％(体积/体积)。
所述利用克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3生产酒精的方法中，还可将克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241先接入如下种子培养基中摇床上培养过夜，再接入所述发酵培养基。
上述种子培养基的配制方法如下：20-100g葡萄糖、其余组分同发酵培养基，用水定容至1000ml。
本发明提供的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241能耐受高浓度的乙酸，在含有0.40％(体积百分含量)乙酸的发酵培养基中，葡萄糖对酒精的转化率达94.29±1.85％；在含有0.60％乙酸的发酵培养基中，葡萄糖对酒精的转化率达83±0.85％；在含有0.8％乙酸的培养基中，葡萄糖对酒精的转化率达80±1.10％。
使用本发明提供的方法，酒精产量为73.58±1.54g l-1-94.90±2.65g l-1，葡萄糖对酒精的转化率为92.95±2.59％-96.12±2.01％。
本发明克服了现有技术的缺欠，提高了产酒精酵母的耐酸性及其它耐逆性，为提高酒精生产效率及利用生物质生产燃料酒精奠定了基础。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为GL648细胞在光学显微镜下的形态。
图2为G4-3细胞在光学显微镜下的形态。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241的获得
一、菌株的获得
从北京平谷区取得果园土样，稀释涂布到含YM培养基(10g葡萄糖、3g麦芽汁(100Bx)、5g蛋白胨、3g酵母膏、20g琼脂、5g乙酸，加水定容至1000ml，pH6.0)的培养皿中，30℃培养48小时。待长出单菌落后，挑选面积大、表面光滑且湿润的菌落，显微镜镜检为酵母菌，接种到发酵培养基(177.5g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，加水定容至1000ml)中，30℃、200rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养至OD600为3.0，接着在30℃静置培养48小时，测定乙醇的产量，挑选产量最高的菌株(名称为GL648)。
将GL648菌株从麦芽汁斜面活化，用YPD培养基(10g l-1酵母提取物、20g l-1蛋白胨、20g l-1葡萄糖)培养至对数生长期，经乙二胺四乙酸二钠(EDTA.2Na)及二硫苏糖醇(DTT)预处理后，加入蜗牛酶，于30℃保温20min，制备原生质体。在诱变处理前，开启15W紫外线灯预热约30min，使光波稳定。将5ml制备好的原生质体(约1×107个/ml)置于带有磁力搅拌子的无菌培养皿(90mm)中，放置在磁力搅拌器的载物台上，与紫外灯管的垂直距离为30cm。开启磁力搅拌器，打开皿盖，边照射边搅拌，5min后停止照射，用高渗液(0.8mol l-1 KCl)稀释后涂布到含0.70％(体积百分含量)乙酸的高渗YPD再生平板(10g l-1酵母提取物、20g l-1蛋白胨、20g l-1葡萄糖，0.8mol l-1 KCl，8g l-1琼脂)上，置于30℃培养箱避光培养至菌落长出。挑选较大菌落于YPD液体培养基中培养，转接5次，挑选耐酸性没有下降的菌株，得到Candida krusei GL648的耐酸性正突变菌株库。
将正突变菌株库各菌株制备成约1×107个/ml的原生质体悬浮液，等体积混合于离心管中，原生质体制备方法同上。3000g离心5min，弃上清，加入与原生质体悬浮液等体积的35％PEG6000融合剂(含10mol l-1 CaCl2)，用移液枪温和地吹吸混匀，30℃放置45min，3000g离心5min，去上清，用高渗液(0.8mol l-1 KCl)洗两遍，分别涂布到乙酸的体积百分浓度依次为0.74％、0.78％、0.81％、0.85％的YPDK再生平板(10g l-1酵母提取物、20g l-1蛋白胨、20g l-1葡萄糖，0.8mol l-1 KCl，8gl-1琼脂)上，置于30℃培养箱，培养至有菌落出现。
每一轮融合后再生的菌株用作下一轮的基因组改组的出发菌株，同时保存下来做进一步的分析。共进行了四轮原生质体融合，第四轮融合后得到的突变株耐酸性最强，从中筛选出突变株G4-3。
二、菌株鉴定
将GL648接种于5ml YPD培养基中，30℃、220rpm摇床培养过夜。提取酵母细胞的基因组DNA作为模板进行PCR反应。采用通用引物NL1、NL4扩增菌株的26SrDNA D1/D2区域；采用通用引物ITS1和ITS4，扩增菌株的ITS1-5.8S-ITS2区域。
引物NL1、NL4、ITS1和ITS4的序列如下：
NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，
NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。
PCR扩增产物经过PCR PurificationK it(Qiagen公司)纯化回收，用自动测序仪(ABIPR ISM3 77D NAS equencer，A BIPR ISM3 100G eneticAnalyzer)进行测序。GL648的26S rDNA D1/D2区域核苷酸序列见序列表的序列1，ITS1-5.8S-ITS2区域核苷酸序列见序列表的序列2。通过NCBI数据库中的BLAST网络服务搜索相似性序列，将GL648的26S rDNA D1/D2区域核苷酸序列及ITS1-5.8S-ITS2区域核苷酸序列与搜索到的相似性序列进行序列比对确定酵母的分类。DNAMAN软件用于序列比对分析。BLAST分析揭示，所得到GL648的26S rDNA D1/D2区域序列核苷酸序列(序列表的序列1)与GenBank中的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)26S rRNA基因(GenBank accession number EF585436及EF694601)部分序列完全相同；GL648ITS1-5.8S-ITS2区域片段(序列表的序列2)与GenBank中的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)5.8S rRNA基因(GenBank accession number AB305095及AY679093)部分序列完全相同。
GL648细胞在光学显微镜下的形态见图1。细胞为杆状，发芽生殖，有假菌丝形成。鉴定GL648为克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)。
突变株G4-3细胞在光学显微镜下的形态见图2。细胞为杆状，发芽生殖，有假菌丝出现，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2241。
实施例2、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241对各种环境压力耐受性的测定
离心(3000g，2min)收集处于稳定期的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241细胞并重新悬浮于相同体积的YNB溶液(0.67％不含氨基酸的酵母氮碱(Difco))中，分别进行下述耐逆性测定。
下述实验中，生存率表示为百分数，为经过处理的培养液涂布的平板上长出的菌落数与未处理的培养液涂布的平板上长出的菌落数的百分比。
1、对乙醇的耐逆性
取上述细胞溶液，加入乙醇至终浓度为20％(体积百分含量)，置于30℃水浴中30min。分别将乙醇处理和未经乙醇处理的上述细胞溶液稀释，两种处理的溶液各涂布3个YNBX平板(6.7g l-1不含氨基酸的酵母氮碱(Difco公司)，20g l-1木糖，20g l-1琼脂)，置于30℃培养箱培养3天。取出平板，统计各平板上菌落数，计算酵母细胞生存率。
乙醇处理的上述细胞的生存率为15.47±0.72％。
2、对冻融的耐逆性
取上述细胞溶液，置于液氮中30min，随后在30℃水浴解冻20min。分别将冻融处理和未经冻融处理的上述细胞溶液稀释，两种处理的溶液各涂布3个YNBX平板(6.7g l-1不含氨基酸的酵母氮碱(Difco公司)，20g l-1木糖，20g l-1琼脂)，置于30℃培养箱培养3天。取出平板，统计各平板上菌落数，计算酵母细胞生存率。
冻融处理后的上述细胞的生存率为15.63±0.94％。
3、对H2O2的耐逆性
取上述细胞溶液，加入H2O2至终浓度为0.3mol l-1，在30℃水浴中保温30min。分别将H2O2处理和未经H2O2处理的上述细胞溶液稀释，两种处理的溶液各涂布3个YNBX平板(6.7g l-1不含氨基酸的酵母氮碱(Difco公司)，20g l-1木糖，20g l-1琼脂)，置于30℃培养箱培养3天。取出平板，统计各平板上菌落数，计算酵母细胞生存率。
H2O2处理的上述细胞的生存率为6.60±0.37％。
4、对热击的耐逆性
取上述细胞溶液，置于52℃水浴中10min，然后在冰浴中冷却至30℃。分别将热击处理和未经热击处理的上述细胞溶液稀释，两种处理的溶液各涂布3个YNBX平板(6.7g l-1不含氨基酸的酵母氮碱(Difco公司)，20g l-1木糖，20g l-1琼脂)，置于30℃培养箱培养3天。取出平板，统计各平板上菌落数，计算酵母细胞生存率。
热击处理的上述细胞的生存率为77.60％±2.92％。
实施例3、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241发酵产酒精
该实施例中所用的培养基的配制方法如下：
150g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
种子培养基：20g葡萄糖、其余成分同上述发酵培养基，用水定容至1000ml。
发酵生产酒精的步骤如下：
1)种子培养：将克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241菌种从活化的斜面接种到种子培养基中，摇床上培养过夜。
2)发酵培养：以5％(体积/体积)的接种量将上述种子培养基上的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241接种到装有25ml发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃、100rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养12小时，接着在30℃静态发酵22小时。实验共设50次重复。
3)酒精产量和葡萄糖对酒精的转化率
取发酵上清液进行检测。发酵液中的葡萄糖和乙醇浓度通过高效液相色谱测定，exclusion column型号为Aminex HPX-87H Bio-Rad(CA，USA)；检测器为RI@8X；流动相采用8mmol l-1的硫酸，流速为0.5ml，温度为60℃。
酒精产量的计算公式为：发酵终止时发酵液中的酒精量(g l-1)-接种时发酵液中的酒精量(g l-1)。
葡萄糖对酒精的转化率的计算公式为：(酒精产量(g l-1)÷葡萄糖的消耗量(gl-1)×100)/0.511。
发酵时间为34小时，酒精产量为73.58±1.54(g l-1)，葡萄糖对酒精的转化率(％)为96.12±2.01％。
实施例4、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241发酵产酒精
该实施例中所用的培养基的配制方法如下：
200g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
种子培养基：100g葡萄糖、其余组分同上述发酵培养基，用水定容至1000ml。
发酵生产酒精的步骤如下：
1)种子培养：将克鲁斯假丝酵母(Candida krusei) G4-3 CGMCC No.2241菌种从活化的斜面接种到种子培养基中，摇床上培养过夜。
2)发酵培养：以10％(体积/体积)的接种量将上述种子培养基上的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei) G4-3 CGMCC No.2241接种到装有25ml发酵培养基的250ml三角瓶中，40℃、200rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养6小时，接着在40℃静态发酵26小时。实验共设50次重复。
3)酒精产量和葡萄糖对酒精的转化率
取发酵上清液进行检测。发酵液中的葡萄糖和乙醇浓度通过高效液相色谱测定，exclusion column型号为Aminex HPX-87H Bio-Rad(CA，USA)；检测器为RI@8X；流动相采用8mmol l-1的硫酸，流速为0.5ml，温度为60℃。
酒精产量的计算公式、葡萄糖对酒精的转化率的计算公式同实施例3。
发酵时间为32小时，酒精产量为94.90±2.65(g l-1)，葡萄糖对酒精的转化率(％)为92.95±2.59％。
实施例5、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241发酵产酒精
该实施例中所用的培养基的配制方法如下：
发酵培养基：177.5g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
种子培养基：100g葡萄糖、其余组分同上述发酵培养基，用水定容至1000ml。
发酵生产酒精的步骤如下：
1)种子培养：将克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241菌种从活化的斜面接种到种子培养基中，摇床上培养过夜。
2)发酵培养：以8％(体积/体积)的接种量将上述种子培养基上的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241接种到装有25ml发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃、150rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养6小时，接着在30℃静态发酵26小时。实验共设50次重复。
3)酒精产量和葡萄糖对酒精的转化率
取发酵上清液进行检测。发酵液中的葡萄糖和乙醇浓度通过高效液相色谱测定，exclusion column型号为Aminex HPX-87H Bio-Rad(CA，USA)；检测器为RI@8X；流动相采用8mmol l-1的硫酸，流速为0.5ml，温度为60℃。
酒精产量的计算公式、葡萄糖对酒精的转化率的计算公式同实施例3。
发酵时间为32小时，最终酒精产量为85.81±1.81g l-1，葡萄糖对酒精的转化率为94.59±1.23％。
实施例6、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241在乙酸条件下发酵产酒精
该实施例中所用的培养基的配制方法如下：
发酵培养基(一)：177.5g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
发酵培养基(二)：160.0g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
种子培养基：100g葡萄糖、其余组分同发酵培养基(一)，用水定容至1000ml。
在上述的发酵培养基(一)中分别加入0.4％、0.8％(体积百分含量)的乙酸，在上述的发酵培养基(二)中加入0.6％(体积百分含量)的乙酸，将克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241分别在三种发酵培养基进行发酵生产酒精。发酵过程如下：
1)种子培养：将克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241菌种从活化的斜面接种到种子培养基中，摇床上培养过夜。
2)发酵培养：以8％(体积/体积)的接种量将上述种子培养基上的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCC No.2241接种到装有25ml发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃、150rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养至OD600为3.0，接着在30℃静态发酵。实验共设50次重复。
接种到不同发酵培养基的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3 CGMCCNo.2241采用不同的静态发酵时间，其中接种到含0.4％乙酸的发酵培养基的静态发酵34小时，接种到含0.6％乙酸的发酵培养基的静态发酵60小时，接种到含0.8％乙酸的发酵培养基的静态发酵108小时。
3)酒精产量和葡萄糖对酒精的转化率
取发酵上清液进行检测。发酵液中的葡萄糖和乙醇浓度通过高效液相色谱测定，exclusion column型号为Aminex HPX-87H Bio-Rad(CA，USA)；检测器为RI@8X；流动相采用8mmol l-1的硫酸，流速为0.5ml，温度为60℃。
酒精产量的计算公式、葡萄糖对酒精的转化率的计算公式同实施例3。
在含有0.40％的乙酸发酵培养基中，葡萄糖消耗完全，酒精发酵时间为34小时，最终酒精产量为85.54±1.68g l-1，葡萄糖对酒精的转化率为94.29±1.85％。
在含有0.60％的乙酸发酵培养基中，葡萄糖消耗完全，酒精发酵时间为60小时，最终酒精产量为67.5±0.70g l-1，葡萄糖对酒精的转化率为83±0.85％。
在含有0.80％的乙酸发酵培养基中，葡萄糖消耗基本完全，发酵时间为108小时，最终酒精产量为72.0±1.0g l-1，葡萄糖对酒精的转化率为80±1.10％。
序列表
Claims (8)
1.克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3，其保藏号为CGMCC No.2241。
2.一种生产酒精的方法，是发酵克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)G4-3CGMCCNo.2241得到酒精。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)G4-3CGMCC No.2241中所采用的培养基配制方法如下：150-200g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)G4-3CGMCC No.2241中所采用的培养基配制方法如下：177.5g葡萄糖、6g酵母提取物、10g蛋白胨、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.55g氯化钙，用水定容至1000ml。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)G4-3CGMCC No.2241中所采用的发酵条件为：在30-40℃、100-150rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养至OD600为3.0，30-40℃静态发酵22-26小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)G4-3CGMCC No.2241中所采用的发酵条件为：在30℃、150rpm转速、旋转半径为13mm的摇床上培养至OD600为3.0，接着30℃静态发酵24小时。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)G4-3CGMCC No.2241以5-10％的接种量接种到发酵培养基中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)G4-3CGMCC No.2241以8％的接种量接种到发酵培养基中。
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