CN101948759B

CN101948759B - 一种深黄被孢霉及其应用

Info

Publication number: CN101948759B
Application number: CN2010102812439A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 纪晓俊; 黎志勇; 彭超; 丛蕾蕾; 任路静; 高振
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-09-14
Also published as: CN101948759A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种深黄被孢霉及其在生产γ-亚麻酸中的应用。该菌株分类命名为深黄被孢霉(Mortierella isabellina)ME-L16，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2010195。利用该深黄被孢霉进行发酵可生产较高浓度的γ-亚麻酸，适合工业化生产γ-亚麻酸。同时建立了一种筛选高产γ-亚麻酸菌株的方法，为进一步筛选高产菌株奠定基础。

Description

一种深黄被孢霉及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高产γ-亚麻酸的深黄被孢霉及其应用。

背景技术

γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid或Gamma-Linolenic acid，简称GLA)为全顺式6，9，12-十八碳三烯酸，分子式C₁₈H₃₀O₂，是一种ω-6系列多不饱和脂肪酸，为无色油状液体，在空气中极易氧化。它是人体的一种必需脂肪酸，在人体内由亚油酸转化而来，继而被转化为双高亚麻酸(Dihomo-γ-Linolenic acid，DGLA)及花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)，再转变成前列腺素E1(PGE1)、白三烯(LT)和前列环素I2(PGI2)。γ-亚麻酸具有广泛的生理活性和明显的药理作用，它可以降血脂，抗血栓性心脑血管疾病，预防和治疗高血压、动脉粥样硬化。同时又能够抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、抗HIV感染等，在美容、化妆品方面也有应用，对月经前期综合症具有一定疗效，被高度评价为“21世纪功能性食品主角”(单长海，赵丹.四川食品与发酵，2006，(1)：17-20)。

1919年，Hei-duschka首次从柳叶菜科(Evening Primrose Flamily)植物月见草中发现γ-亚麻酸(吴广礼，王喜君，李君，等.农业与技术，1994，(3)：19-22)。目前已知有80多种高等植物种子油脂中含有一定量的γ-亚麻酸，其中含量较高的有月见草、玻璃苣、黑醋栗、蓝蓟、微孔草等(田歆珍，王贤磊，孙桂琳，等.生物技术，2008，18(1)：89-92)。但是从植物中提取γ-亚麻酸受到诸多因素的限制，植物的生长周期长，占地面积大，且受到自然条件的限制，植物种子的采集比较难，油含量不稳定，难以满足人们日益增长的需求(海华，尚德静，李庆伟.工业微生物，2002，3(24)：46-50)。1948年Bernhard和Albercht(Bernhard K，Albrecht H.Helv Chim Acta，1948，31(4)：977-988)首先从布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)的菌体脂肪中鉴定出γ-亚麻酸，拉开了微生物发酵法生产γ-亚麻酸的序幕。氏须霉属及后来发现的根霉属、毛霉属、曲霉属、犁头霉属、共头霉属等具有较强的γ-亚麻酸合成能力。目前研究较多的菌株为深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)、矮被孢霉(Mortierella nana)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinlata)、鲁西毛霉(Mucorrouxii)等(李忠玲，丘淑宁，王卫卫，等.微生物学杂志，2008，28(1)：94-97)。虽然能够产γ-亚麻酸的菌种如此之多，但是近年来对于野生高产菌的筛选鲜有报道，大多研究都集中在对已有菌种的改造和代谢调控方面，对γ-亚麻酸产量的提高较少，且目前公开的有关γ-亚麻酸发明专利多为刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinlata)(申请号为：95111964.8，95119429.1，200610065889.7，91106190.8)，很少涉及其他的菌株，延缓了γ-亚麻酸的产业化进程，因此筛选高产γ-亚麻酸的微生物资源利于拓展研究空间，同时还可以满足γ-亚麻酸产业化的需求，促进工业化进程，具有重大意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能发酵生产较高浓度γ-亚麻酸的深黄被孢霉。

本发明还要解决的技术问题是提供上述深黄被孢霉在发酵生产γ-亚麻酸中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种深黄被孢霉是从南京工业大学茶园土壤中筛选得到，菌株代号为ME-L16，其分类命名为深黄被孢霉(Mortierella isabellina)。

目前该菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址：武汉武汉大学；邮编：430072；登记入册的编号：CCTCC NO：M 2010195；保藏日期：2010年8月4日。以此菌作为生产菌株。

CCTCC NO：M 2010195的筛选方案如下：

土壤中的微生物经过初筛，复筛，再筛，最后得到高产GLA菌种。其中初筛平板中加入了红四氮唑(TTC)，它能被脱氢酶还原成红色，当菌体内的脱氢酶活性高时，就会在短时间内使菌体呈现红色，红色的深浅可以反映出脱氢酶的活力，而脱氢酶活力越高，不饱和脂肪酸的含量越高。将变红较早的菌株逐一挑出进一步筛选。复筛的平板中加入了一定浓度的甘草酸。作为吡啶族类除草剂，甘草酸可以抑制ω-3脂肪酸的脱饱和作用。当ω-3脂肪酸脱饱和酶受到抑制，代谢流将流向GLA，将会提高GLA的产量，通过筛选甘草酸抗性株可以获得GLA高产菌株。最后通过发酵法检测产物中GLA的含量，筛选得到高产菌株CCTCC NO：M 2010195。

本筛选方法中初筛的基本培养基为PDA，其中加入了红四氮唑(终浓度0.5～2‰g/L)。

本筛选方法中复筛的基本培养基为PDA，其中加入了甘草酸(终浓度0.5～2‰g/L)。

本筛选方法中发酵法的基本培养基为：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，KH₂PO₄3.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，其余为水，pH 7.0。

CCTCC NO：M 2010195菌株具有下述性质：

1、形态特征：

该菌株生长速度快，孢子量多，菌丝生长粗壮。在PDA平板上25℃培养3天，菌落直径达5厘米，菌丛为灰色。显微镜下观察，菌丝粗壮多分枝，结成网；孢囊梗直接从基质中分出，孢子囊顶生，球形，无明显的囊轴；包囊孢子单细胞，球形，经鉴定其为深黄被孢霉(Mortierella isabellina)。

2、营养特征：

培养基为能提供碳源、氮源的常规培养基。培养基中的碳源主要为糖类，其中糖类为葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、半乳糖和糖蜜中的任意一种或多种的混合物；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为硝酸钾、硝酸铵、硝酸钠和氯化铵中的任意一种或多种的混合物，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、牛肉膏和麦芽浸膏中的任意一种或多种的混合物；无机盐为镁盐、钾盐和钠盐中的任意一种或多种的混合物。

上述高山被孢霉在生产γ-亚麻酸(GLA)中的应用。即将CCTCC NO：M 2010195接种于含有碳源、氮源和无机盐的培养基中，在23℃～30℃、pH5.5～7.5条件下，发酵培养5～8天。

其中，优选温度条件为23℃～28℃。

其中，斜面培养基为PDA培养基，包含如下组分：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。配制方法为：200g马铃薯去皮，切成块加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加20g糖及15g琼脂，溶化后补足水至1000mL，121℃灭菌30min。

其中，摇瓶活化培养基包含如下组分：碳源20～40g/L，氮源5～10g/L，无机盐0.1～5g/L；优选包含如下组分：葡萄糖20～40g/L，酵母膏5～10g/L，无机盐2～4g/L，其余为水，pH 6.0～7.0；最优选包含如下组分：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，其余为水，pH 7.0。

其中，发酵培养基包含下列组分：碳源60～120g/L，氮源5～10g/L，无机盐3～10g/L；优选包含如下组分：葡萄糖80～120g/L，酵母膏5～10g/L，无机盐3～8g/L，其余为水，pH6.0～7.0；最优选包含如下组分：葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，KH₂PO₄3g/L，NaNO₃3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，其余为水，pH 7.0。

有益效果：

本发明筛选出的菌株深黄被孢霉ME-L16(CCTCC NO：M 2010195)具有较高的γ-亚麻酸合成能力，GLA占总脂肪酸的百分比高达20％。其生长范围宽，对营养的要求简单，可以通过发酵罐扩大培养，生产的菌油GLA含量高，且易于提取，具有很好的发展前景。不仅为我国GLA生产增加了一个新品种，同时将对我国GLA工业化产生积极的推动作用。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中GLA的分析方法如下：

色谱条件：Thermo Finnigan TRACE DSQ型气相色谱-质谱联用仪，采用DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。起始柱温50℃，以20℃/min升温到250℃，保持2min。进样温度200℃，载气为氦气，载气流速1ml/min，不分流进样。总运行时间为12min。萃取头在进样口于200℃下脱附5min。

质谱检测条件：EI源70eV，离子源温度250℃，传输线温度250℃，扫描范围50～400aum。

以下实施例中所用培养基的溶剂未明确标示时均采用水作为溶剂。

以下实施例中接种量的百分比是指种子液与发酵培养基的体积之比。

以下实施例中pH调节方式：用1mol/L的硫酸和2mol/L的氢氧化钠调节pH。

实施例1：高产GLA菌株的筛选方法。

2009年12月24日从南京工业大学茶园地表采集土样，称取3.0克，90℃烘烤36h，加入到100mL无菌水中制成悬液，再用无菌水进行梯度稀释至10^-6，取0.1mL稀释液涂布于含有一定浓度红四氮唑培养基的平板上，25℃培养观察菌落的颜色变化，依次将变红的菌落挑出在复筛平板(含一定浓度甘草酸)上划线分离，将能在含甘草酸培养基上生长的单菌落划线纯化一代，最后摇瓶发酵，检测菌油中GLA的含量(如表1)，筛选得到高产菌株ME-L16。

本筛选方法中初筛的基本培养基为PDA，其中加入了红四氮唑(0.5-2‰g/L)。

本筛选方法中复筛的基本培养基为PDA，其中加入了甘草酸(0.5-2‰g/L)

本筛选方法中发酵法的基本培养基为：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，KH₂PO₄3.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L。

表1不同菌种的γ-亚麻酸生产情况

(续表1)

实施例2：菌株最佳生长温度及pH范围的测定。

ME-L16菌株转接到PDA固体培养基上，25～28℃培养5～7天，孢子已经生长成熟。用接种环挑取2环孢子于50mL的液体种子培养基中25～28℃培养2天。以10％的接种量接入发酵培养基中培养6～8天，分别对培养温度和pH进行单因子实验，其中培养基的pH分别调为4.5，5.5，6.5，7.5，8.5；培养温度分别为20，23，25，28，30℃。测干重，同时用GC-MS检测GLA的含量。分析菌株发酵生产GLA的最适温度和pH。从表2中可以看出该菌的最适pH为5.5～7.5，从表3中可以看出该菌最适生长温度为25～28℃，而积累GLA最多则为23℃。

液体种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，其余为水，pH 7.0。

发酵基本培养基为：葡萄糖80g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄3g/L，其余为水。

表2不同pH下γ-亚麻酸的生产情况

表3不同温度下γ-亚麻酸的生产情况

实施例3：ME-L16菌种的实验室培养。

PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，加水至1L，121℃灭菌20min。(配制方法：马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL。)当PDA斜面冷却后接入ME-L16菌株，25℃培养5天，将成熟的孢子用无菌水洗下，经6～8层纱布过滤，接入摇瓶活化培养。摇瓶活化培养基包含下列组分：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，其余为水，pH 7.0，装液量250mL的摇瓶装入50mL的活化培养基，120rpm，25℃，活化3天。再将活化后的菌株接入发酵培养基，装液量250mL的摇瓶装入50mL的发酵培养基，接种量10％，125rpm，23℃，发酵6.5天。发酵培养基包含下列组分：葡萄糖80g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄3g/L，其余为水，pH7。

结果：干重：23g/L；油含量48％，GLA/总油为19％。

实施例4：利用ME-L16菌株进行摇瓶发酵。

菌种活化：将深黄被孢霉菌种ME-L16接于PDA斜面25℃培养5～7天。

种子活化：培养成熟的深黄被孢霉孢子用无菌水洗下，经6～8层纱布过滤，再用玻璃珠打散，成均匀的孢子液。摇瓶活化培养基包含下列组分：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，其余为水，pH 7.0，装液量250mL的摇瓶装入50mL的活化培养基。接种量为10⁶个孢子/mL。培养条件为：120rpm，25℃，活化3天。

发酵培养：将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。装液量为250mL装入50mL的发酵培养基，接种量为10％，温度25℃，pH7.0，转速120rpm，周期6～8天。发酵培养基包含下列组分：葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，KH₂PO₄3g/L，NaNO₃3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，其余为水，pH 7.0。

发酵结果：干重：35g/L；油含量50％，GLA/总油为20％。

Claims

1.一种深黄被孢霉，其分类命名为深黄被孢霉(Mortierella isabellina)ME-L16，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO：M 2010195。

2.权利要求1所述的深黄被孢霉在生产γ-亚麻酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将CCTCC NO：M 2010195接种于含有碳源、氮源和无机盐的培养基中，在23～30℃、pH5.5～7.5条件下，培养发酵5～8天。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、半乳糖和糖蜜中的任意一种或多种的混合物；所述氮源为有机含氮化合物或无机含氮化合物，其中，无机含氮化合物为硝酸钾、硝酸铵、硝酸钠和氯化铵中的任意一种或多种的混合物，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、牛肉膏和麦芽浸膏中的任意一种或多种的混合物；所述的无机盐为镁盐、钾盐和钠盐中的任意一种或多种的混合物。