CN101497902A - 一种微生物油脂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物油脂的制备方法，首先将N－乙酰葡糖胺和/或葡糖胺制成总浓度为20～200g/L的水溶液，添加0～3g/L其它营养成份，灭菌后接入产油微生物种子液，接种量v/v为2％～20％，于20～37℃通气培养36～240小时，停止发酵，离心收集菌体，破碎菌体，经有机溶剂提取获得微生物油脂。每100gN－乙酰葡糖胺和/或葡糖胺可获得含油率为15～66％的产油酵母干菌体12.0g～45.0g。本方法使用的原料具有来源丰富、价格低廉的特点，并且发酵获取油脂工艺简便、方法易行，是一种利用可再生资源、几乎不额外占用耕地、可连续生产的微生物油脂制备新途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物转化法制备油脂，具体地说是一种利用微生物转化N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺制备油脂的方法。
背景技术
长链脂肪酸甘油酯(油脂)是重要的食用品和化工原料。作为化工原料，油脂可用于生产可生物降解的润滑油、溶剂油、油漆和油墨溶剂、表面活性剂、粘接剂等产品。近年来，油脂还广泛应用于生产可再生能源产品生物柴油。因此，油脂资源的需求量显著增加。通常油脂来源于油料植物的种子和果实以及动物脂肪组织，其中油料植物是提取油脂的主要原料。种植油料植物和油料作物需要占用耕地，生产受到季节和自然条件的制约，不利于油脂原料稳定和连续供应。
许多微生物，如酵母、霉菌和藻类等在一定条件下，可以碳水化合物、碳氢化合物等为碳源，在体内合成并贮存大量脂肪酸甘油酯，这种油脂称为微生物油脂。微生物发酵底物范围较广，包括可直接利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、乳清以及淀粉和纤维素水解产物等(Ratledge C，Wynn J.The Biochemistry andMolecular Biology of Lipid Accumulation in Oleaginous Microorganisms.Adv ApplMicrobiol，2002，51：1-51)。据报道，部分微生物能在菌体内积累含量超过细胞干重60％以上的油脂。部分微生物油脂和一般植物油具有相似的脂肪酸组成，仍以C16和C18系脂肪酸为主。微生物油脂发酵不但可提供新的油脂生产方法，而且可合理利用废弃生物质，降低油脂生产成本，保护环境。因此，微生物油脂是潜在的动植物油脂替代资源，具有广阔的应用空间。
壳多糖(Chitin)又名甲壳质，几丁质，广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物外骨骼中，是自然界中含量仅次于纤维素的一种多糖，也是地球上数量最大的含氮有机化合物(Austin PR，Brine C J，Castl J E，et al.Chitin：flew facets of research.Science，1981，212：749-753)。壳多糖是一类由结构单元N-乙酰葡糖胺(2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖)以β-1，4-糖苷键连接而形成的高聚物。壳多糖经过酸水解或酶水解可以得到N-乙酰葡糖胺和葡糖胺，这两种单糖资源丰富，对工业微生物发酵生产具有重要价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、工艺简便、方法易行的利用生物转化法制备微生物油脂的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种微生物油脂的制备方法，其以N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺为主要原料进行微生物发酵培养，获得微生物油脂。
是将N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺作为培养基碳源，其中可添加少量其它微生物生长必需营养成份，灭菌后接入产油微生物种子液，于20℃～37℃通气培养，发酵终止后分离收集菌体，提取获得微生物油脂。利用本发明菌体含油率15％～66％(w/w)。
具体为：(1)将N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺制成总浓度为20g/L～200g/L的水溶液，添加0～3g/L常规微生物生长所需营养成份，如酵母粉、蛋白胨、麦牙汁、磷酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等，调节pH5.5～7.5，所得培养基灭菌后备用；
(2)产油微生物在液体种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，余量为水，pH5.5～6.0)中，于30℃，180～200转/分钟振荡培养20小时～36小时，得每毫升含105～108个活细胞的种子液；
(3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量2％～20％(v/v)，在20℃～37℃下通气培养36小时～240小时，发酵液中总还原糖浓度可降至1％以下；
(4)终止发酵，固液分离收集菌体，经有机溶剂提取得到微生物油脂。
本发明可参照文献(李植峰，张玲，沈晓京，等.四种真菌油脂提取方法的比较研究.微生物学通报，2001，28(6)：72～75)使用酸热法提取微生物油脂。按每克菌体加入2～4mol/L盐酸5～10mL，于78℃水浴处理1小时，冷却后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿层，水洗，以无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经浓缩除去低沸点有机溶剂，并在105℃干燥得到微生物油脂。以油脂质量除以提取时使用的干菌体质量得到菌体油脂含量(w/w)。按文献方法(张峻，邢来君，王红梅.γ—亚麻酸高产菌株的选育及发酵产物的分离提取.微生物学通报，1993，20(3)：140～143)进行气相色谱分析，构成本发明所得到微生物油脂的脂肪酸包括碳链长度含有12～22个碳原子的脂肪酸。原料对菌体得率在15％～45％(w/w)，菌体含油率为15％～66％(w/w)。
所述N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺水溶液可以是含壳多糖原料的水解液；所述含壳多糖原料的水溶液为蟹壳、虾壳和/或鱼鳞的酸水解液或者酶水解液。
本发明使用的产油微生物包括圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus、解脂亚罗酵母Yarrowia lipolytica、乳糖红酵母Rhodotorula lactosa、小红酵母Rhodotorula minuta、橘林油脂酵母Lipomyceskononenkoae、皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum、发酵性丝孢酵母Trichosporonfermentans、健强地霉Geotrichum robustum和深黄被孢霉Mortierella isabellina。
本发明的有益效果是：(1)与传统通过油料植物获取油脂的方法相比，本发明技术简单有效，周期短，可连续操作，节约耕地，不受场地、季节、气候变化的影响；(2)与生物转化其它淀粉质和纤维质糖源制备油脂的方法相比，本发明使用的原料来源于壳多糖，资源丰富，成本低；(3)本发明可用于大量获取油脂，有利于资源综合利用和环境保护，可获得显著的综合效益。
具体实施方式
下面是本发明的具体实施例，其中使用到的产油微生物圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389、解脂亚罗酵母Yarrowia lipolytica AS 2.1398、小红酵母Rhodotorulaminuta AS 2.277、乳糖红酵母Rhodotoru lalactosa AS 2.1514、皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571和深黄被孢霉Mortierella isabellinaAS3.3410购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；橘林油脂酵母Lipomyceskononenkoae CICC 1714、发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans CICC 1368和健强地霉Geotrichumrobustum CICC 1256购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509购自美国普通微生物菌种保藏管理中心。通过实施例可进一步了解不同微生物转化N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺生产油脂的能力，但不以任何形式限制产油微生物的具体种属。
实施例1：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH5.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入圆红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30℃通气培养96小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体9.3g/L。
按每克干菌体加入3mol/L盐酸8mL，于78℃水浴处理1小时，冷却，加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿层，水洗，以无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经浓缩除去低沸点有机溶剂，并在105℃干燥得到微生物油脂产品2.6g/L，菌体油脂含量28％(w/w)。
实施例2：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺20，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH6.0。121℃灭菌15min后，以5％(v/v)接种量接入圆红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30℃通气培养36小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体5.5g/L，菌体油脂含量23％。
实施例3：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺100，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH7.0。121℃灭菌15min后，以15％(v/v)接种量接入圆红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30℃通气培养120小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体25g/L，菌体油脂含量30％。
实施例4：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺200，KH2PO4 1.7，MgSO4·7H2O0.4，酵母粉0.5，调节pH6.5。121℃灭菌15min后，以20％(v/v)接种量接入圆红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30℃通气培养168小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体45g/L，菌体油脂含量32％。
实施例5：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 1.2，MgSO4·7H2O0.4，酵母粉0.5，调节pH6.5。121℃灭菌15min后，以20％(v/v)接种量接入圆红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于37℃通气培养96小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体9.1g/L，菌体油脂含量21％。
实施例6：培养基组成(g/L)：葡糖胺70，KH2PO4 1.2，MgSO4·7H2O 0.4，酵母粉0.5，调节pH7.0。121℃灭菌15min后，以20％(v/v)接种量接入圆红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于37℃通气培养108小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体10.3g/L，菌体油脂含量18％。
实施例7：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH5.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入解脂亚罗酵母AS 2.1398种子液，于30℃通气培养108小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体10.2g/L，菌体油脂含量35％。
实施例8：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH6.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30℃通气培养120小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体13.5g/L，菌体油脂含量52％。
实施例9：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉1.0，CaCl2 0.04，FeSO4·7H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.001，MnSO4 0.0007，调节pH6.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC20509种子液，于30℃通气培养168小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体24.5g/L，菌体油脂含量65％。
实施例10：培养基组成(g/L)：葡糖胺100，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.2，酵母粉0.5，调节pH7.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30℃通气培养120小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体17.5g/L，菌体油脂含量25％。
实施例11：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，调节pH6.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入小红酵母AS 2.277种子液，于30℃通气培养72小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体8.0g/L，菌体油脂含量20％。
实施例12：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH6.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入乳糖红酵母AS 2.1514种子液，于30℃通气培养96小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体15.0g/L，菌体油脂含量32％。
实施例13：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH7.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入皮状丝孢酵母AS 2.571种子液，于30℃通气培养120小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体14.8g/L，菌体油脂含量40％。
实施例14：培养基组成(g/L)：葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.2，酵母粉0.1，调节pH7.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入皮状丝孢酵母AS 2.571种子液，于30℃通气培养120小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体13.5g/L，菌体油脂含量33％。
实施例15：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH6.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入橘林油脂酵母CICC 1714种子液，于30℃通气培养168小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体12.3g/L，菌体油脂含量28％。
实施例16：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH7.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入发酵性丝孢酵母CICC 1368种子液，于30℃通气培养144小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体17.6g/L，菌体油脂含量45％。
实施例17：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH6.5。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入健强地霉CICC 1256种子液，于30℃通气培养132小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体15.8g/L，菌体油脂含量33％。
实施例18：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉0.1，调节pH6.0。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入深黄被孢霉AS 3.3410种子液，于20℃通气培养240小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体18.0g/L，菌体油脂含量37％。
实施例19：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺20，葡糖胺50，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.2，酵母粉1.0，蛋白胨0.1，调节pH7.0。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30℃通气培养120小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体14.5g/L，菌体油脂含量37％。
实施例20：培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺45，葡糖胺25，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.2，酵母粉1.0，蛋白胨0.1，调节pH7.0。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30℃通气培养120小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体20.5g/L，菌体油脂含量43％。
实施例21：以壳多糖(购自Sigma，货号：C9213)为原料，参照文献方法(Pichyangkura R，Kudan S，Kuttiyawong K，Sukwattanasinitt M，Aiba S，Quantitativeproduction of 2-acetamido-2-deoxy-d-glucose from crystalline chitin by bacterialchitinase，Carbohydrate Research，2002，337，557-559)进行酶水解处理，调整N-乙酰葡糖胺浓度为20g/L，添加酵母粉1.0g/L，pH6.5，于121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30℃通气培养36小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体6.5g/L，菌体油脂含量50％。
实施例22：以蟹壳为原料，参照文献方法(Muzzarelli，R.A.A.Chitin in natureand technology，Pleum Press，New York，1986)进行酸水解处理，得到水解液，调整总还原糖浓度为50g/L，其中N-乙酰葡糖胺35g/L，葡糖胺10g/L，添加酵母粉0.6g/L，KH2PO4 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，pH6.5，于121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30℃通气培养48小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体8.2g/L，菌体油脂含量45％。
实施例23：以虾壳为原料，参照文献方法(李南，李继珩.D-氨基葡萄糖盐酸盐的制备研究.中国药科大学学报，1997，28(1)，56-58)进行酸水解处理，得到水解液，调整总还原糖浓度为55g/L，其中N-乙酰葡糖胺5g/L，葡糖胺48g/L，添加酵母粉1.0g/L，KH2PO4 0.7g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，pH6.2，121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入圆红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30℃通气培养60小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体9.3g/L，菌体油脂含量38％。
每100g N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺可获得含油率为15～66％的产油酵母干菌体12.0g～45.0g。与传统通过油料植物获取油脂的方法相比，本发明技术简单有效，周期短，可连续操作，节约耕地；与生物转化其它淀粉质和纤维质糖源制备油脂的方法相比，本发明使用的原料来源于含壳多糖的生物原料，如蟹壳、虾壳或鱼鳞等，具有资源丰富、价格低廉的特点，并且发酵获取油脂工艺简便、方法易行，成本低，是一种利用可再生资源、几乎不额外占用耕地、可连续生产的微生物油脂制备新途径，同时也为水产养殖业废弃物高值化利用开辟了新的方向。
Claims (7)
1.一种微生物油脂的制备方法，其特征在于：其以N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺为原料进行微生物发酵培养，获得微生物油脂。
2.按照权利要求1所述微生物油脂的制备方法，其特征在于：是将N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺制成总浓度为20～200g/L的水溶液，灭菌处理，接入产油微生物种子液，通空气培养后分离菌体，提取获得微生物油脂。
3.按照权利要求2所述微生物油脂的制备方法，其特征在于：具体过程如下，
(1)所述N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺水溶液pH5.5～7.5，其中还可含有0～3.0g/L常规微生物生长所需营养成份；
(2)所述产油微生物的培养条件为：接种量v/v为2～20％，温度20℃～37℃，培养时间为36小时～240小时；
(3)所述产油微生物培养终止后经固液分离收集菌体，菌体破碎，按常规方法提取，得到微生物油脂。
4.按照权利要求3所述微生物油脂的制备方法，其特征在于：所述常规微生物生长所需营养成份为酵母粉、蛋白胨、麦牙汁、磷酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钙和/或硫酸亚铁。
5.按照权利要求2所述微生物油脂的制备方法，其特征还在于：所述N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺水溶液可以是含壳多糖原料的水解液。
6.按照权利要求5所述微生物油脂的制备方法，其特征还在于：所述含壳多糖原料的水溶液为蟹壳、虾壳和/或鱼鳞的酸水解液或者酶水解液。
7.按照权利要求1或2所述微生物油脂的制备方法，其特征还在于：
所用产油微生物为圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus、解脂亚罗酵母Yarrowia lipolytica、乳糖红酵母Rhodotorulalactosa、小红酵母Rhodotorula minuta、橘林油脂酵母Lipomyces kononenkoae、皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum、发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans、健强地霉Geotrichum robustum和/或深黄被孢霉Mortierella isabellina。
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