CN107937448A - 一种n‑乙酰‑d‑葡糖胺综合利用的方法 - Google Patents

一种n‑乙酰‑d‑葡糖胺综合利用的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107937448A
CN107937448A CN201710953786.2A CN201710953786A CN107937448A CN 107937448 A CN107937448 A CN 107937448A CN 201710953786 A CN201710953786 A CN 201710953786A CN 107937448 A CN107937448 A CN 107937448A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acetyl
glucosamine
grease
culture medium
comprehensive utilization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710953786.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107937448B (zh
Inventor
龚志伟
唐谋
赵觅
刘义
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Wuhan University of Science and Technology WHUST
Original Assignee
Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University of Science and Engineering WUSE filed Critical Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority to CN201710953786.2A priority Critical patent/CN107937448B/zh
Publication of CN107937448A publication Critical patent/CN107937448A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107937448B publication Critical patent/CN107937448B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B25/00—Phosphorus; Compounds thereof
    • C01B25/16—Oxyacids of phosphorus; Salts thereof
    • C01B25/26—Phosphates
    • C01B25/45—Phosphates containing plural metal, or metal and ammonium
    • C01B25/451—Phosphates containing plural metal, or metal and ammonium containing metal and ammonium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05B—PHOSPHATIC FERTILISERS
    • C05B9/00—Fertilisers based essentially on phosphates or double phosphates of magnesium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Fertilizers (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明适用于甲壳素资源转化利用技术领域，提供一种N‑乙酰‑D‑葡糖胺综合利用的方法，具体的，配制含40～160g/L N‑乙酰‑D‑葡糖胺的水溶液，加入一定量的产油酵母种子液，酵母能够将原料中的乙酰基团和糖骨架主要导向微生物油脂生产，发酵液固液分离后，沉淀物用于提取油脂，上清液中继续加入磷酸镁盐与铵根离子反应，合成磷酸镁铵。本方法可以有效避免N‑乙酰‑D‑葡糖胺常规油脂发酵过程中，由于氮源丰富导致的油脂产量低、油脂得率低、高含氮废水排放的突出问题，显著提高油脂产量和得率，充分利用甲壳素资源，从产油微生物菌体提取的微生物油脂可作为制备生物柴油和油脂化工产品的原料，合成的磷酸镁铵可作为高品质缓释肥。

Description

一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法
技术领域
本发明属于甲壳素转化利用技术领域，尤其涉及一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用高效生产微生物油脂和高品质磷酸镁铵缓释肥的方法。
背景技术
甲壳素(Chitin)又名几丁质，是自然界中含量仅次于纤维素的第二大生物质，也是资源总量最大的含氮有机高分子化合物，广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物外骨骼、软体动物、环节动物、原生动物、海藻和真菌中。目前甲壳素资源仍然是海产品加工的废弃物，在海洋资源丰富的地区导致严重的环境污染。甲壳素是一类由基本结构单元N-乙酰-D-葡糖胺以β-1,4-糖苷键链接而形成的多糖类高聚物。甲壳素通过酸或者酶水解可得到N-乙酰-D-葡糖胺，这种单糖资源极其丰富，原则上既能提供微生物生长的碳源，又能提供氮源，对工业微生物发酵生产具有重要价值。
自然界中某些酵母菌、霉菌、细菌和藻类在特定条件下，能够以碳水化合物、碳氢化合物、二氧化碳等为碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内积累油脂并超过细胞干重20％w/w(这里w/w表示质量比，下同)的微生物称为产油微生物。微生物油脂，尤其是产油酵母产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，可作为生物柴油的替代原料。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。利用丰富的甲壳素资源中的N-乙酰-D-葡糖胺制备微生物油脂，作为生物柴油和功能性油脂的替代原料，具有很好的应用前景。
目前利用产油微生物转化N-乙酰-D-葡糖胺制备微生物油脂已有相关专利和文献报道(赵宗保,吴思国.一种微生物油脂的制备方法,专利号ZL200810010348.3；Wu,S.,Hu,C.,Zhao,X.,et al.(2010).Production of lipid from N‐acetylglucosamine byCryptococcus curvatus.Eur J Lipid Sci Tech.2010,112,727-733；Zhang,G.,French,W.T.,Hernandez,R.,et al.Microbial lipid production as biodiesel feedstockfrom N‐acetylglucosamine by oleaginous microorganisms.J Chem TechnolBiot.2011,86,642-650)。然而，N-乙酰-D-葡糖胺中富含氮源营养，当前利用单一、传统的油脂发酵技术存在着油脂产量低、油脂得率低和高含氮废水排放的突出问题。诱导产油酵母油脂的过量积累通常需要营养限制，其中氮限制是当前诱导油脂过量积累最有效的策略。然而，N-乙酰-D-葡糖胺，除可提供乙酰基团和糖骨架外，还可大量提供微生物生长繁殖必需的氮源营养，特别不利于诱发微生物过量积累油脂，导致油脂产量和油脂得率都较低。此外，原料中的氮源以铵根离子的形式不断释放到培养液中，造成废水中氮源含量非常高。例如，每100g N-乙酰-D-葡糖胺理论上可释放8.1g铵根离子，废水直接排放会造成非常严重的环境污染。为了更高效彻底地利用甲壳素资源，尤其需要实现N-乙酰-D-葡糖胺的综合利用，实现其营养元素的高值化定向转化，使得其中的乙酰基团和糖骨架定向转化为微生物油脂，显著提高油脂产量和得率；而铵根离子能够定向转化为高品质磷酸镁铵缓释肥，将铵根离子变废为宝，这对甲壳素资源的高值资源化利用具有重要意义。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种N-乙酰-D-葡糖胺乃至甲壳素资源综合利用高效生产微生物油脂和高品质磷酸镁铵缓释肥的方法，旨在解决当前N-乙酰-D-葡糖胺油脂发酵过程中油脂含量和油脂得率低、高含氮废水排放的突出问题，本方法能够显著降低油脂生产成本，提高油脂产量和油脂得率，并将废水中高浓度的铵根离子转化为高品质的磷酸镁铵缓释肥。
本发明提出一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，具体包括如下步骤：
步骤1：配制含40～160g/L的N-乙酰-D-葡糖胺的水溶液，溶液无需灭菌，无需添加任何其它营养成分。
步骤2：挑取产油酵母，接种于营养丰富的N-乙酰-D-葡糖胺液体种子培养基中制备种子液，接种温度为25℃～37℃，然后通气培养12～48h，得到产油酵母种子液。
步骤3：将种子液固液分离，湿菌体水洗后，接种至N-乙酰-D-葡糖胺的水溶液中，接种量为4-20g/L干重对应的湿菌体，于25℃～37℃通气培养，直至培养基中底物浓度低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物和上清液。
步骤4：沉淀物采用有机溶剂抽提法提取油脂，油脂是一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂。
步骤5：往上清液中加入磷酸镁盐或可以通过反应生成磷酸镁的无机盐组合，与铵根离子发生反应，反应条件为常温常压，pH 7.0～9.5，反应时间10～200min，合成磷酸镁铵缓释肥，固液分离获得磷酸镁铵缓释肥产品。
本发明中产油酵母为具有代谢N-乙酰-D-葡糖胺能力的产油酵母，如弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus，白色隐球酵母Cryptococcus albidus，皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum，发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans，解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica。N-乙酰-D-葡糖胺可以是成品，也可直接由水产养殖业废弃物蟹壳、虾壳、鱼鳞等或其它含有甲壳素的资源水解制备。
本发明的有益效果是：
(1)N-乙酰-D-葡糖胺水溶液中C、H、O、N元素丰富，但仍然缺乏产油酵母菌体增殖所需的许多其它营养元素，因此产油酵母菌体增殖受限。原料中的乙酰基团和糖骨架能够被很好地被酵母转化为微生物油脂储存在胞内，油脂产量和油脂得率均比常规发酵显著提高；(2)由于产油酵母种子接种量较大，培养基营养不均衡不利于微生物增长繁殖，以及具备代谢N-乙酰-D-葡糖胺能力的微生物较少，使得N-乙酰-D-葡糖胺水溶液无需灭菌，可省去灭菌成本，大大降低过程成本；(3)发酵过程中释放的大量铵根离子，能够很简单、温和、快速地与磷酸镁盐反应，合成高品质磷酸镁铵缓释肥，将废水中的高浓度的铵根离子资源化利用，变废为宝，避免高浓度含氮废水的排放。综上所述，本发明能够显著提高油脂产量、油脂含量和得率，并充分高值化利用高含氮废水中的氮源，有效避免高含氮废水的排放，为N-乙酰-D-葡糖胺及大量存在的廉价几丁质资源的清洁、高值化综合利用提供的新的方法，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的方法流程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所述实施例，本发明提供了一种N-乙酰-D-葡糖胺乃至甲壳素资源清洁、高值化综合利用制备微生物油脂和高品质磷酸镁铵缓释肥的方法，方法操作简单高效，很好地解决了当前N-乙酰-D-葡糖胺常规油脂发酵过程中油脂含量和油脂得率低、高含氮废水排放的突出问题，显著降低了油脂生产成本，提高了油脂产量和油脂得率，并将废水中高浓度的铵根离子转化成了高品质的磷酸镁铵缓释肥，具有明显的技术优势。
本发明方法具体包括如下步骤：
步骤1：配制含40～160g/L N-乙酰-D-葡糖胺的水溶液，无需再添加任何其它营养成分，调节pH至4.0～6.0，溶液无需灭菌，作为油脂发酵培养基。
本步骤所采用的原料可为N-乙酰-D-葡糖胺纯品，也可直接由水产养殖业废弃物蟹壳、虾壳、鱼鳞等或其它含有甲壳素的资源水解制备。可采用酸法或者酶法进行水解。
本步骤无需添加或添加少量的营养成分，培养基无需经过高温灭菌。
步骤2：产油酵母种子液的制备。于无菌操作环境中，挑取产油酵母，接种于营养丰富的N-乙酰-D-葡糖胺液体种子培养基，于25℃～37℃通气培养12～48h，得到产油酵母种子液。
本步骤产油酵母所用的液体种子培养基可为营养丰富的培养基。培养基以N-乙酰-D-葡糖胺为主要碳源和氮源，添加适量的其它营养成分如酵母粉，蛋白胨，玉米浆等。
本步骤所用产油酵母为具有代谢N-乙酰-D-葡糖胺能力的产油酵母，如弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus，白色隐球酵母Cryptococcus albidus，皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum，发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans。以上菌株可以直接从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、英国国家菌株保藏中心(UKNCC)或德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。
步骤3：微生物油脂合成。将酵母种子液固液分离，湿菌体水洗1～2遍后，接种至N-乙酰-D-葡糖胺的水溶液中，接种量为4-20g/L干重对应的湿菌体，于25℃～37℃通气培养，直至培养基中底物浓度低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物。本步骤固液分离的方法可采用离心或者过滤。
步骤4：所得沉淀物使用酸热-有机溶剂法提取油脂。
这里收集得到的沉淀物为微生物菌体，然后从收集的菌体中抽提获得油脂，计算菌体油脂产量。所述微生物油脂主要为长链脂肪酸及其衍生物的甘油酯，经转酯化后，可制成生物柴油，比如在酸催化条件下转酯化制备生物柴油；或参照文献(里伟，等.过程工程学报,2007,7(1):137–140)的方法，提取微生物油脂，在酶催化条件下转酯化制备生物柴油。另外，微生物油脂含有的不饱和脂肪酸还可用于制备其他高附加值产品。
步骤5：磷酸镁铵缓释肥的合成。按化学反应计量关系往发酵上清液中加入磷酸镁盐或加入可以通过反应生成磷酸镁的无机盐组合，与上清液中大量存在的铵根离子发生化学反应，合成磷酸镁铵，固液分离得到沉淀物，沉淀物水洗2遍后，获得磷酸镁铵缓释肥产品。
本步骤所用反应条件为常温常压，磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1～1.2:1，搅拌反应，反应pH 7.0～9.5，反应时间10～200min。
下面通过多个对比实施例来对本发明的创造性进行说明。以下实施例选取了典型的含N-乙酰-D-葡糖胺的水溶液综合利用制备微生物油脂和高品质磷酸镁铵缓释肥的例子，有助于了解本发明，但不以任何形式限制将本发明应用于其他材料或产油酵母菌株。
对比例1
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺70，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O0.2，酵母粉1.0，CaCl2 0.04，FeSO4·7H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.001，MnSO40.0007，调节pH 5.5。121℃灭菌20min后备用；
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；
3)按10％(v/v)的接种量接入弯曲隐球酵母种子液至步骤1)培养基，于30℃通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约9.2g/L，上清液中NH4 +为4.0g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体21.5g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量8.8g/L，油脂得率为0.15g/g。
实施例1
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺70，pH 5.5。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗2遍后，按照干重5g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约5.4g/L，上清液中NH4 +为4.7g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体22.5g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量14.2g/L，油脂得率为0.22g/g。
5)在发酵上清液中加入五水磷酸镁，其中磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1.2:1，加碱调节pH至7.5，搅拌反应120min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥，沉淀水洗3遍后得到较高纯度的磷酸镁铵产品。上清液中残留的NH4 +为50mg/L，清除率达到99％。
实施例2
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺40，pH 5.0。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养12h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重4g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养48h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约2.4g/L，上清液中NH4 +为2.8g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体15.5g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量8.7g/L，油脂得率为0.23g/g。
5)在发酵上清液中加入五水磷酸镁，其中磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1.1:1，加碱调节pH至8.0，搅拌反应60min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥，沉淀水洗2遍后得到较高纯度的磷酸镁铵产品。上清液中残留的NH4 +为50mg/L，清除率达到98％。
实施例3
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺100，pH 5.0。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养36h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重10g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养144h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约19.4g/L，上清液中NH4 +为6.0g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体33.2g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量17.7g/L，油脂得率为0.22g/g。
5)在发酵上清液中加入磷酸镁，其中磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1.2:1，加碱调节pH至9.5，搅拌反应180min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥。上清液中残留的NH4 +为200mg/L，清除率达到97％。
实施例4
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺50，pH 4.0。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养48h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重4g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约3.4g/L，上清液中NH4 +为3.4g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体18.5g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量10.4g/L，油脂得率为0.22g/g。
5)在发酵上清液中加入五水磷酸镁，其中磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1:1，加碱调节pH至7.0，搅拌反应120min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥，沉淀水洗2遍后得到较高纯度的磷酸镁铵产品。上清液中残留的NH4 +为40mg/L，清除率达到99％。
实施例5
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺40，pH 6.5。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入白色隐球酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自美国典型培养物保藏中心)，于25℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重4g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于25℃通气培养100h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺0.1g/L，上清液中NH4 +为3.0g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体17.5g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量9.7g/L，油脂得率为0.24g/g。
5)在发酵上清液中加入五水磷酸镁，其中磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1.2:1，加碱调节pH至9.0，搅拌反应10min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥，沉淀水洗2遍后得到较高纯度的磷酸镁铵产品。上清液中残留的NH4 +为20mg/L，清除率达到99％。
实施例6
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺160，pH 6.0。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入白色隐球酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自美国典型培养物保藏中心)，于25℃，200rpm振荡培养36h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重20g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于25℃通气培养192h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约4.4g/L，上清液中NH4 +为11.8g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体59.4g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量28.8g/L，油脂得率为0.19g/g。
5)在发酵上清液中加入五水磷酸镁，其中磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1.2:1，加碱调节pH至9.5，搅拌反应200min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥，沉淀水洗2遍后得到较高纯度的磷酸镁铵产品。上清液中残留的NH4 +为0.48g/L，清除率达到96％。
实施例7
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺60，pH 5.0。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans CICC 1368(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重7g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养120h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约4.7g/L，上清液中NH4 +为4.0g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体19.8g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量11.1g/L，油脂得率为0.20g/g。
5)在发酵上清液中加入磷酸镁，其中磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1.05:1，调节pH至7.5，搅拌反应90min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥，沉淀水洗2遍后得到较高纯度的磷酸镁铵产品。上清液中残留的NH4 +为70mg/L，清除率达到98％。
实施例8
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺40，pH 5.0。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans CICC 1368(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养48h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重5g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养72h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约0.1g/L，上清液中NH4 +为2.9g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体15.8g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量8.4g/L，油脂得率为0.21g/g。
5)在发酵上清液中加入七水硫酸镁和磷酸氢二钠，其中硫酸镁、磷酸氢二钠和铵根离子的摩尔比为1.1:1.1:1，加碱调节pH至8.0，搅拌反应30min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥。上清液中残留的NH4 +为55mg/L，清除率达到98％。
实施例9
1)培养基组成(g/L)：N-乙酰-D-葡糖胺40，pH 4.0。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica AS 2.1398(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重4g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约0.5g/L，上清液中NH4 +为2.8g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体18.5g/L，采用酸热法提取油脂，油脂产量7.8g/L，油脂得率为0.19g/g。
5)在发酵上清液中加入相同摩尔浓度的硫酸镁和磷酸，加氢氧化钠调节pH至9.0，其中硫酸镁、磷酸和铵根离子的摩尔比为1.1:1.1:1，搅拌反应60min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥。上清液中残留的NH4 +为50mg/L，清除率达到98％。
实施例10
1)培养基组成(g/L)：以蟹壳为原料，参照文献方法(夏文水,陈洁.甲壳索和壳聚糖的化学改性及其应用.无锡轻工业学院学报,1994,13(2),162-171)处理，得到水解液，调整总还原糖浓度为40g/L，pH 5.5。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重4g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养88h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺约2.7g/L，上清液中NH4 +为2.6g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体19.4g/L，采用酸热法提取油脂，油脂量6.7g/L，油脂得率为0.18g/g。
5)在发酵上清液中加入等摩尔浓度的氯化镁和磷酸氢二钠，使氯化镁、磷酸氢二钠和铵根离子的摩尔比为1.05:1.05:1，加氢氧化钠调节pH至9.0，搅拌反应60min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥。上清液中残留的NH4 +为10mg/L，清除率达到99.6％。
实施例11
1)培养基组成(g/L)：以虾壳为原料，参照文献方法(李南,李继衍.D-氨基葡萄糖盐酸盐的制备研究.中国药科大学学报,1997,28(1),56-58)处理，得到水解液，调整总还原糖浓度为80g/L，pH 6.0。培养基不灭菌。
2)在液体种子培养基(N-乙酰-D-葡糖胺20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5)中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；
3)种子液6000g离心5min，所得沉淀水洗1遍后，按照干重8g/L对应的湿菌体接入步骤1)培养基中，于30℃通气培养120h；
4)终止发酵，此时发酵液中残留N-乙酰-D-葡糖胺3.5g/L，上清液中NH4 +为5.7g/L；固液分离收集沉淀，得干菌体31.5g/L，采用酸热法提取油脂，油脂量14.4g/L，油脂得率为0.19g/g。
5)在发酵上清液中加入磷酸镁，其中磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1.1:1，加碱调节pH至8.5，搅拌反应120min，使沉淀反应完全，固液分离所得沉淀即为磷酸镁铵缓释肥。上清液中残留的NH4 +为70mg/L，清除率达到99％。
实施例12
参照文献(Li YH,et al.Enzyme Microb Technol,2007,41:312–317)的方法，从实施例11获得菌体中提取微生物油脂，得到1.0g。参照文献(里伟，等.过程工程学报，2007,7(1),137–140)的方法，取0.50g油脂在酶催化条件下转酯化制备和纯化生物柴油，得到0.47g，生物柴油收率94％，所得生物柴油的辛烷值为58，适合作为柴油的替代品。
通过比较对比例1和实施例1的实验结果发现，产油酵母在较大的接种量下，可直接将N-乙酰-D-葡糖胺转化为微生物油脂，培养基无需灭菌，无需添加任何其它营养成分，油脂产量和油脂得率均得到显著提高。发酵上清液中残留的高浓度NH4 +能够彻底清除并高效地转化为磷酸镁铵缓释肥。实施例2-11表明，采用本发明方案N-乙酰-D-葡糖胺中的碳源和氮源营养均能得到很好地利用，生产微生物油脂以及高品质磷酸镁铵缓释肥，通过原料的综合利用，可以明显降低成本，具有很好的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
配制含40～160g/L的N-乙酰-D-葡糖胺的水溶液；
将产油酵母接种于液体种子培养基中制备种子液；
将种子液固液分离，湿菌体水洗后，接种至所述配制的N-乙酰-D-葡糖胺的水溶液中培养，直至培养基中底物浓度低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物和上清液；
提取沉淀物中的油脂；
往上清液中加入磷酸镁盐，与铵根离子发生反应，合成磷酸镁铵，固液分离获得磷酸镁铵缓释肥。
2.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述N-乙酰-D-葡糖胺由含甲壳素的物质水解制取；含甲壳素的物质为蟹壳、虾壳、鱼鳞中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述液体种子培养基为含N-乙酰-D-葡糖胺的培养基。
4.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述产油酵母接种于液体种子培养基中，于25℃～37℃温度下通气培养12～48h制备种子液。
5.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述湿菌体的接种量为干重4～20g/L，。
6.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述湿菌体接种至所述配制的N-乙酰-D-葡糖胺的水溶液中于25℃～37℃温度下通气培养。
7.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述产油酵母为具有代谢N-乙酰-D-葡糖胺能力的产油酵母，为弯曲隐球酵母Cryptococcuscurvatus、白色隐球酵母Cryptococcus albidus、皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum、发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans、解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica中的任意一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述上清液中加入的磷酸镁盐为加入多种无机盐反应生成磷酸镁盐。
9.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，磷酸镁铵合成反应条件为，常温常压，磷酸镁与铵根离子的摩尔比为1～1.2:1，pH 7.0～9.5，反应时间10～200min。
10.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-D-葡糖胺综合利用的方法，其特征在于，所述沉淀物中的油脂采用有机溶剂抽提法提取。
CN201710953786.2A 2017-10-13 2017-10-13 一种n-乙酰-d-葡糖胺综合利用的方法 Active CN107937448B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710953786.2A CN107937448B (zh) 2017-10-13 2017-10-13 一种n-乙酰-d-葡糖胺综合利用的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710953786.2A CN107937448B (zh) 2017-10-13 2017-10-13 一种n-乙酰-d-葡糖胺综合利用的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107937448A true CN107937448A (zh) 2018-04-20
CN107937448B CN107937448B (zh) 2021-08-31

Family

ID=61935300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710953786.2A Active CN107937448B (zh) 2017-10-13 2017-10-13 一种n-乙酰-d-葡糖胺综合利用的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107937448B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101497902A (zh) * 2008-02-03 2009-08-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种微生物油脂的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101497902A (zh) * 2008-02-03 2009-08-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种微生物油脂的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
任义等: "氨氮废水处理技术进展综述", 《西安文理学院学报:自然科学版》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107937448B (zh) 2021-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Litchfield Single-cell proteins
CN101144097B (zh) 一种制备甲壳素及其壳聚糖和壳寡糖的方法
CN101575584B (zh) 一种裂殖弧菌及利用其生产dha油脂的方法
CN105695524B (zh) 一种利用木质纤维素原料生产生物柴油的方法
CN101608192B (zh) 一种利用玉米芯生产丁二酸的方法
CN103224884B (zh) 一种产油微生物的培养方法
Lamb et al. Fermentative bioethanol production using enzymatically hydrolysed Saccharina latissima
CN101343644A (zh) 一种以玉米秸秆为原料制备微生物油脂的方法
CN101933439A (zh) 一种利用植物油提高桑黄液体培养菌丝量的方法
CN104846024A (zh) 一种利用玉米秸秆为原料发酵生产微生物油脂及酯化的方法
CN103352016B (zh) 利用Alteromonas colwelliana A321发酵浒苔制备生物肥
CN101007957A (zh) 用植物废弃物生产生物柴油和土壤调节剂的方法
CN105543301B (zh) 粗甘油与木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂的方法
CN104116000A (zh) 一种果寡糖饲料添加剂的制备方法
CN101497902B (zh) 一种微生物油脂的制备方法
CN100558887C (zh) 一种利用宇佐美曲霉产业化生产木聚糖酶的方法
Setyaningsih et al. Acid hydrolysis technique and yeast adaptation to increase red macroalgae bioethanol production
CN103343118A (zh) 一种应用于有机富硒农业的生物硒产品及其生产方法
CN104263771B (zh) 一种利用不脱毒纤维素水解液产微生物油脂的方法
CN106755148B (zh) 一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法
CN103160550A (zh) 一种裂褶菌胞外多糖与燕麦多糖组成的复合多糖的制备方法
CN107937448A (zh) 一种n‑乙酰‑d‑葡糖胺综合利用的方法
CN108949725A (zh) 复合酶制剂的生产和纯化工艺
CN112143770B (zh) 一种海洋红酵母及其在以秸秆为原料生产β-胡萝卜素中的应用
CN112941120A (zh) 一种利用VFAs和木质纤维素原料生产微生物油脂的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant