CN103320331B - 一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株 - Google Patents
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Abstract
一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，属于生物工程技术领域。本发明菌株分类命名为畸雌腐霉（Pythiumirregulare）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012421。该菌株由通过对江苏省无锡市惠山树林中的土壤进行分离筛选，得到了性状稳定，产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，可通过液态发酵生产二十碳五烯酸EPA，EPA产量可以5.5g/L以上，同时EPA占总油脂的30%以上。
Description
技术领域
一株产二十碳五烯酸（EPA）的畸雌腐霉菌株，属于生物工程技术领域。本发明涉及一种高产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，该菌株生长速度快、产量高，对于二十碳五烯酸的工业化生产有着重要意义。
背景技术
二十碳五烯酸(5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid EPA)是一种具有5个非共扼双键的20个碳原子直链不饱和脂肪酸（PUFA），因分子中的第一个双键起始于甲基端的第三个碳原子，属Ω-3系列不饱和脂肪酸。采用n、Ω，速记命名法命名为20: 5n-3，采用IUPAC系统命名法命名为5, 8, 11, 14, 17一顺一二十碳五烯酸，分子式为C20H30O2，相对分子量为302.6。常温下，呈淡黄色油状液体，易溶于乙醚、正己烷、石油醚等非极性溶剂中。参与的化学反应与羧基和双键相关，如与氧反应、与卤素反应、酯化作用、氢化物形成等。Ω-3 多元不饱和脂肪酸在自然界分配很不均衡，陆地动植物和人体中含量极微，因此人体所需的Ω-3 多元不饱和脂肪酸必须从食物中摄取。EPA等多不饱和脂肪酸的一突出重要性在于，它是人体器官和组织生物膜的绝对必需成分，对于机体调节、动力学、相转移、膜的渗透性以及控制与膜相关的过程起到了关键作用，如果膜上磷脂分子中缺少相当数量的不饱和脂肪酸，细胞的生理功能就会失常。其在医学上可以治疗心血管疾病、癌症、精神分裂症以及老年痴呆症等。基于二十碳五烯酸的这些重要作用，生产EPA就有着极其重要的意义。在目前的工业上，EPA的生产主要来源于鱼油中。然而，在鱼油中含有胆固醇等对人体不健康的物质，此外鱼捕获量和种类会受捕获季节、地点及海洋中食物链变化影响，导致所含的多元不饱和脂肪酸量与质不稳定。并且由鱼油精炼的脂肪酸常带有一种令人难以忍受的鱼腥味，降低消费者的接受程度。所以，就需要其他富含EPA的微生物资源来代替鱼油。这些生产EPA的微生物主要是真核的微生物、真菌和藻类，在原核微生物中基本上是不产不饱和脂肪酸的。然而，Yasawa等人分离得到了88株产EPA的菌株，其中产EPA最高的菌株属于交替假单胞菌属。对于海洋藻类，无论是微藻还是肉眼可见的藻类，都有很高的EPA含量，其中大部分属于金藻纲。
目前，可以产EPA的真菌主要来自被孢霉属和腐霉属。在被孢霉属中Mortierella alpina 被认为是可以作为大批商业化生产EPA的潜力菌株（Shimizu, S., Kawashima, H., Akimoto, K., Shinmen, Y. and Yamada, H. Fungal mycelia as novel source of eicosapentaenoic acid. Biochem. Biophys. Res. Commun.1988 150：335-341.）。但是，同样作为产EPA的潜力菌种，畸雌腐霉（Pythium irregulare）近些年来在国内外被研究的较多。例如，Edgar E. Stinson等人，利用该菌经优化培养条件后，EPA的产量可以达到76.5mg/L (Edgar E. Stinson, Raymond Kwoczak and Michael J. Kurantz.Effect of cultural conditions on production of eicosapentaenoic acid by Pythium irregulare[J].Journal of Industrial Microbiology,1991 (8): 171-178)；并且该菌可以利用许多工业上的副产品来作为自身的碳源或氮源，例如该菌利用生物柴油副产物粗甘油来代替葡萄糖进行发酵，EPA产量可以达到105mg/L(孔秀梅，吴蕾.利用生物柴油副产物粗甘油发酵生产EPA[J]，食品科技，2012 37(7):180-184)。专利CN101434908A介绍了一种产二十碳五烯酸油脂的腐霉(Pythium sp.)HUST-RBB12 菌种，EPA产量约为2.1g/L。综上所述，当前EPA的相关生产菌株产量都很低，筛选EPA的高产菌株具有重要的工业应用价值。
本发明从江苏省无锡市惠山树林的土壤中筛选得到了性状稳定、发酵周期短、二十碳五烯酸产量可达5.5g/L以上的畸雌腐霉菌株Pythium irregulare JN168，同时该菌的EPA含量占总油脂的30%以上，具有很好的工业应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，得到了性状稳定，产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，可通过固态或液态发酵生产二十碳五烯酸。
本发明的技术方案：一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，命名为畸雌腐霉（Pythium irregulare）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012421。
所述的畸雌腐霉菌株，其18S rDNA序列为 SEQ ID NO：1。
该菌株代谢产物中二十碳五烯酸（EPA）的含量较高。
该菌株可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、玉米粉或马铃薯淀粉。
该菌株可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。
于江苏省无锡市惠山树林，选取落叶覆盖较密的土地，去除表层土，用取样铲垂直铲取10厘米深处土壤装入取样盒。称取1g左右土样于50mL离心管中加入9mL去离子水溶解，取1mL溶解液加入到装有9mL去离子水的离心管中，依次类推制成10-1，10-2，10-3，10-4各种梯度的菌悬液，取10-2，10-3，10-4三个梯度进行平板涂布，放置在25℃的生化培养箱中倒置培养。分离用培养基为：蔗糖20g、MgSO4·7H2O 10mg、ZnCl2 1mg、FeSO4·7H2O 0.02mg、MoO3 0.02mg、CuSO4·5H2O 0.02mg、盐酸硫胺素100μg、琼脂23g、蒸馏水1000mL、万古霉素75mg、五氯硝基苯100mg、青霉素 5000单位、匹马霉素5mg，pH自然。待单菌落长出后，挑取单菌落用苏丹黑B染色，脂肪颗粒被染成蓝紫色，挑选脂肪颗粒多且染色较深的菌株进行摇瓶复筛。收获摇瓶培养的菌丝体抽滤，冷冻干燥至恒重，研磨菌丝体，用索式提取法提取油脂，对提得的油脂进行GS-MS联用分析脂肪酸组成。反复采用以上的方法，经过多次筛选得到二十碳五烯酸高产菌株Pythium irregulare JN168。
本发明涉及到的菌种有如下特征
1.畸雌腐霉Pythium irregulare JN168培养条件
该菌种的培养常规条件是好气培养。用于培养菌种的糖质原料可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、玉米粉或马铃薯淀粉。培养用的氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。该菌株的生长温度范围为5℃-35℃，最适生长温度为25℃，二十碳五烯酸最佳积累温度为12℃，菌株在pH为2-9范围内能生长且代谢产二十碳五烯酸，二十碳五烯酸最佳积累pH为6.5。在菌种的培养过程中添加醋酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸镁、磷酸二氢钾等无机盐以及亚麻油对二十碳五烯酸的产量有促进作用。
2. Pythium irregulare JN168的形态描述
平板培养形态：Pythium irregulare JN168培养1天后，平板上出现质地较薄的白色菌落，菌落呈圆形。4天后，可看到大量棉花糖状的白色气生菌丝。用苏丹黑B染色后，在显微镜下可见菌丝体内蓝紫色脂肪颗粒。
3.Pythium irregulare JN168的发酵特征
可采用常规的液态发酵方法，利用上述菌种生产二十碳五烯酸。培养基可用含不同碳源、氮源、无机离子等普通培养基。
培养基中也可添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物，一般情况，这些营养物存在于上述的天然营养源中。
该菌株液态发酵过程中，24小时后开始产生二十碳五烯酸，96小时后二十碳五烯酸产量达到最大。
该菌株液态发酵产二十碳五烯酸的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉。用该培养基在25℃下二十碳五烯酸的产量可达5.5g/L以上。
4. Pythium irregulare JN168的18S、5.8S分子生物学特征见序列表SEQ ID NO：1。
本发明的有益效果：该菌株由通过对江苏省无锡市惠山树林中的土壤进行分离筛选，得到了性状稳定，产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，可通过液态发酵生产二十碳五烯酸EPA，EPA产量可以5.5g/L以上，同时EPA占总油脂的30%以上。
生物材料样品保藏
一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉（Pythium irregulare）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012421，保藏日期为2012年10月22日。
具体实施方式
实施例1
畸雌腐霉脂肪酸组成分析
发酵菌株为畸雌腐霉Pythium irregulare JN168，采用液态发酵，采用标准PDA培养基。发酵温度25℃，4天后发酵结束。抽滤收集菌丝体，冷冻干燥至恒重，用研钵将菌丝体磨碎。取0.1g左右烘干的菌丝体，加入到有盖的试管中。向其中加入0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液5mL，在50℃水浴中保持1h，再向其中加入5mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在50℃水浴中保持1h，加入5mL正己烷抽提，最后加入2mL饱和氯化钠溶液水洗，移取上层溶液采用GC-MS联用检测。
色谱条件：Finnigan Trace MS（美国）气相色谱-质谱仪。采用DB-MAX毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。起始柱温180℃，保持1min，以5℃/min升高到230℃，保持8min。进样口温度260℃，载气为氦气，流速为0.8mL/min，分流比为10︰1。
质谱检测条件：EI+（70Ev），发射电流200μA，离子源温度350℃，接口温度260℃。由表1可以看出该菌种EPA(C20:5)的含量占总脂肪酸的31.5%，远高于当前已经报道的其它菌株。
表1脂肪酸组成
实施例2
最佳碳源的确定
将保存在斜面上的畸雌腐霉Pythium irregulare JN168菌株接种到平板上，然后在25℃的培养箱中培养。平板培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、琼脂20%。3天后，刮取平板上的菌丝于无菌水中，震荡打碎菌丝，并以10%接种量接种到种子培养基中，25℃摇床培养48小时，再以10%接种量接种到发酵培养基中，25℃摇床培养96小时。使用单因素考察积累二十碳五烯酸的最佳碳源，分别使用果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、玉米粉、或马铃薯淀粉替代基本发酵培养基中的葡萄糖进行液态发酵，测量干重和二十碳五烯酸的产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min。从表2可以看出菌株发酵产二十碳五烯酸的最佳碳源为葡萄糖。
表2 不同碳源下的二十碳五烯酸生产情况
实施例3
最佳氮源的确定
将保存在斜面上的畸雌腐霉Pythium irregulare JN168菌株接种到平板上，然后在25℃的培养箱中培养。平板培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、琼脂20%。3天后，刮取平板上的菌丝于无菌水中，震荡打碎菌丝，并以10%接种量接种到种子培养基中，25℃摇床培养48小时，再以10%接种量接种到发酵培养基中，25℃摇床培养96小时。使用单因素考察积累二十碳五烯酸的最佳氮源，分别使用硝酸铵、硫酸铵、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉替代基本发酵培养基中的酵母粉进行液态发酵，测量干重和二十碳五烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min。从表3可以看出菌株发酵产二十碳五烯酸的最佳氮源为酵母粉。
表3 不同氮源下的二十碳五烯酸生产情况
实施例4
最佳温度的确定
将保存在斜面上的畸雌腐霉Pythium irregulare JN168菌株接种到平板上，然后在25℃的培养箱中培养。平板培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、琼脂20%。3天后，刮取平板上的菌丝于无菌水中，震荡打碎菌丝，并以10%接种量接种到种子培养基中，25℃摇床培养48小时，再以10%接种量接种到发酵培养基中，25℃摇床培养96小时。使用单因素考察二十碳五烯酸积累的最佳温度，分别将发酵温度调整到15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，测量干重和二十碳五烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min。从表4可以看出菌株发酵产二十碳五烯酸的最佳温度为25℃。
表4 不同温度下的二十碳五烯酸生产情况
实施例5
最佳pH的确定
将保存在斜面上的畸雌腐霉Pythium irregulare JN168菌株接种到平板上，然后在25℃的培养箱中培养。平板培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、琼脂20%。3天后，刮取平板上的菌丝于无菌水中，震荡打碎菌丝，并以10%接种量接种到种子培养基中，25℃摇床培养48小时，再以10%接种量接种到发酵培养基中，25℃摇床培养96小时。使用单因素考察积累二十碳五烯酸的最佳pH，分别将发酵pH调整到4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5测量干重和二十碳五烯酸产量。发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min。从表5可以看出菌株发酵产二十碳五烯酸的最佳pH为6.0。
表5 不同pH值下的二十碳五烯酸生产情况
SEQ ID NO: 1
ccacacctaa aaactttcmc gtgaactgtc gttaatggtt gtgtgtgtgc stgttggtag 60
catgcgtgtt tgcttacgct ttggtgtttg cgagtgcgcg trytgtcggt gcgcagactg 120
aacgaaggtc gtgtgttgct gtgtgcctgc tgcactgctg actttgcatt gatttgcatg 180
gtgttggcgg agcggcgggt gctgttgcgt gcgcggctga cctatttttt tcaaacccca 240
tacctaaatg actgattata ggccgttctt gcttttaact agataacaac acggcttcca 300
tttcagcagt ggatgtctag gctcgcacat cgatgaagaa cgctgcgaac tgcgatacgt 360
aatgcgaatt gcagaattca gtgagtcatc gaaattttga acgcatattg cacttccggg 420
ttatgcctgg aagtttgtct gtatcagtgt ccgtaaatca aacttgcgtt tcttccttcc 480
gtgtagtcgg tggaggagag tttgcagatg tgaagtgtct cgctggggtt ggtgtttgtt 540
gtttgcaatg aatgcacagc ttgcgagtcc ctgttaaatg gacacgactt tctctttttt 600
gtatgtacgc ggtgatgtgc gtgaacgcgg tggttttcgg atcgctcgcg gctgtcggcg 660
acttcggtga atgcataatg gagtggacct cgattcgcgg tatgttgttc ttcggctgga 720
caatgttgct tattgtgtgt ctgttccgtg ttcgccttga ggtgtactgg tggctgtggg 780
attgaactgg ttactgttgt tagtagtgtg tgtrgcacgt tgtcgtggat gcatctgtgt 840
ttttgcatac ttgtgtgtgt gcaattgtac agaagaggag tctcaatttg ggaaaagttt 900
tgtatacttc 910
Claims (5)
1.一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，其分类命名为畸雌腐霉（Pythium irregulare）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012421。
2.根据权利要求1所述的畸雌腐霉菌株，其18S rDNA序列为 SEQ ID NO：1。
3.根据权利要求1所述的畸雌腐霉菌株，其特征在于能代谢产生二十碳五烯酸。
4.根据权利要求1所述的畸雌腐霉菌株，其特征在于可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、玉米粉或马铃薯淀粉。
5.根据权利要求1所述的畸雌腐霉菌株，其特征在于可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。
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