CN114230502B - 一种虾青素提取方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及天然产物提取的领域，具体公开了一种虾青素提取方法。一种虾青素提取方法，包括如下步骤：将经过灭菌处理的废弃虾壳经过破碎、酶解、过滤后得到营养液；将雨生红球藻培养液接入至营养液中，在光强为2000‑4000lux，光暗比为12:12的条件下培养5‑7天后，在光强7000‑10000lux的条件下胁迫生长8‑10天，分离得到虾青素制备原料；将虾青素制备原料投入至离子液体‑低共熔溶剂双水相体系中进行提取，得到虾青素粗提液；虾青素粗提液纯化、沉淀后得到虾青素产品。本申请的制备方法充分利用了废弃虾壳的营养成分，绿色环保；并且使用的提取体系为离子液体‑低共熔溶剂双水相体系，安全无毒，提取高效；得到高纯度高提取率的虾青素产品。

Description

一种虾青素提取方法
技术领域
本申请涉及天然产物提取的领域，更具体地说，它涉及一种虾青素提取方法。
背景技术
虾青素是一种脂溶性色素，呈橙红色，广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物体内。虾青素是一种类胡萝卜素的含氧衍生物，具有多种生理活性，能够有效地清除体内自由基、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病、保护肝脏等，对改善中枢神经系统和脑功能有积极作用。随着虾青素在医药、美容方面的药用价值逐步得到开发，虾青素的生产提取方法日益丰富。
现阶段市场上的虾青素主要是以化学合成手段和生物提取手段得到。生物提取是目前具有较高潜力的提取手段，主要是以藻类或水产加工废弃物作为原料进行提取。由于水产加工废弃物中虾青素的含量远低于藻类原料，因此现阶段主要以藻类作为虾青素的提取来源。
藻类原料中，目前公认的高潜力的藻类为雨生红球藻，雨生红球藻提取虾青素的方法中均需要对雨生红球藻进行破壁处理后再提取，提取方法有以下几种：
第一，有机溶剂萃取法。大量研究表明，丙酮含有与虾青素高度相似的羰基，因此丙酮对虾青素的提取效果较好，虾青素回收率达到150μg/g；然而丙酮虽然沸点较低，但是毒性中等，在加工过程中难以完全除去，存在食品安全隐患。
第二，油提法。使用葵花籽油和椰子油对虾青素进行提取，提取率可达到26.3μg/g。60-90℃下油提取法可以获得较高的虾青素回收率，但虾青素的稳定性差，易发生降解，导致虾青素的品质降低。
本申请人认为上述相关技术中至少存在如下缺陷：首先，虾青素的提取率存在瓶颈，即使以雨生红球藻作为提取原料，提取率最高仅为150μg/g；其次，现阶段的虾青素提取方法中需要使用大量的有机溶剂或是酸、碱、盐溶液，易造成环境污染；因此，亟需开发一种高提取率、环保型的虾青素提取方法。
发明内容
为了提高虾青素的产率，本申请提供一种虾青素提取方法。
本申请提供一种虾青素提取方法，采用如下的技术方案：
一种虾青素提取方法，包括如下步骤：
S1、营养液的制备：将经过灭菌处理的废弃虾壳经过破碎、酶解、过滤后得到富含虾青素的营养液，备用；
S2、雨生红球藻的培育：将雨生红球藻培养液接入至营养液中，雨生红球藻培养液与营养液的体积比为1:（40-80），在光强2000-4000lux，光暗比为12:12的条件下培养5-7天，在光强7000-10000lux的条件下胁迫生长8-10天，分离得到虾青素制备原料；
S3、虾青素的提取：将虾青素制备原料投入至离子液体-低共熔溶剂双水相体系中进行提取，得到虾青素粗提液；虾青素粗提液纯化、沉淀后得到虾青素产品。
通过采用上述技术方案，废弃虾壳中主要含有大量的甲壳素、蛋白质和虾青素，经过酶解处理后，蛋白质降解为小分子肽、甲壳素降解为壳聚糖、并伴有虾青素溶出，制成营养液，营养液能够为雨生红球藻处理的繁殖提供充足的氮源和碳源；壳聚糖能够抑制一些植物病原菌的繁殖，有利于后续雨生红球藻的培育增殖，解决了传统的雨生红球藻两步式培养法中存在的雨生红球藻抗逆性差的问题，雨生红球藻在培育期间能够得到充足的营养，其培育进程加快；
雨生红球藻繁育5-7天后由于营养液中氮源和碳源消耗较多，增殖速率降低，可以进入虾青素积累阶段，在高光、缺氮环境中胁迫生长，得到高虾青素含量的制备原料；
虾青素制备原料中使用离子液体-低共熔溶剂双水相体系进行处理，雨生红球藻的细胞壁通透性强，局部破裂，雨生红球藻内部的虾青素溶出，低共熔溶剂促进虾青素向离子液体富集，离子液体-低共熔溶剂双水相体系发生相分离，离子液体相为虾青素粗提液，继而进行提纯，得到高产率高纯度的虾青素，虾青素提取率可达到14.6mg/g；
本申请中利用废弃虾壳中的营养物质作为雨生红球藻的营养来源，并对废弃虾壳中的虾青素进行回收，在提高虾青素的含量的同时，雨生红球藻培养过程中无需加入富含氮、磷元素的有机质，不易造成水体污染；并且离子液体-低共熔溶剂双水相体系作为提取溶剂，可多次回收利用，绿色环保。
可选的，所述步骤S1中酶解具体操作为：
经过破碎得到虾壳粉加水混合，调节pH为6-7，再加入木瓜蛋白酶液，废弃虾壳粉与木瓜蛋白酶的重量比为(500-1500):1，升温至40-50℃，保温反应5-7h，得到酶解液。
通过采用上述技术方案，使用木瓜蛋白酶对进行高效水解，使得酶解液中富含小分子肽，提供充足的氮源；甲壳素降解为低分子量壳聚糖，提供碳源；酶解液中富含雨生红球藻生长所需营养。
优选的，所述步骤S1中富含虾青素的营养液中加入甘蔗糖蜜，甘蔗糖蜜的添加量为营养液重量的1-5wt%。
通过采用上述技术方案，首先，甘蔗糖蜜中富含蔗糖，可以进一步提高营养液中碳源含量，缩短雨生红球藻的培养时间，提高雨生红球藻的产率，从而提高后续虾青素的产量；其次，甘蔗糖蜜中的蔗糖在后续提取过程中由于具有较多的氢键结合位点，可以作为氢键供体，有利于与离子液体竞争水分子，进一步促进虾青素进入离子液体中，提高虾青素的提取率；最后，甘蔗糖蜜是以甘蔗为原料糖厂的一种副产物，来源稳定廉价，降低生产成本。
优选的，所述步骤S2中胁迫生长的光强为8000lux。
通过采用上述技术方案，在此光强时，光照对虾青素对雨生红球藻中虾青素的诱导作用较好，雨生红球藻中虾青素的含量较高；并且雨生红球藻不易凋亡。
可选的，所述步骤S3中离子液体-低共熔溶剂双水相体系的组成如下：离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐，低共熔溶剂为氯化胆碱与甘油按照摩尔比1:1复配而成，离子液体、低共熔溶剂和水的重量比为0.3:0.5:0.2。
通过采用上述技术方案，离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐能改善雨生红球藻包囊细胞的渗透性，加速虾青素的溶出，但存在黏度较高的问题；而氯化胆碱与甘油组成的低共熔溶剂的黏度较低，从而使得离子液体-低共熔溶剂双水相体系的整体黏度较低，弥补1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐的缺陷，进一步提高虾青素的提取率。
可选的，所述步骤S3中，离子液体-低共熔溶剂双水相体系的提取温度为35-45℃。
优选的，所述步骤S3中，离子液体-低共熔溶剂双水相体系的提取时间为0.5-2h。
优选的，所述步骤S3中，离子液体-低共熔溶剂双水相体系的pH值为6-7。
通过采用上述技术方案，优化提取时间、提取温度、pH值，使得虾青素在提取过程中保持稳定，在提高虾青素提取率的同时，降低虾青素氧化降解的可能性，使得虾青素的提取率与纯度进一步提高。
可选的，所述步骤S3中虾青素粗提液纯化、沉淀的具体操作为：向所述虾青素粗提液中加水，静置，过滤。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请中对废弃虾壳进行酶解处理，雨生红球藻的培育提供充足的碳源和氮源，加速雨生红球藻的生长，再使用离子液体-低共熔溶剂双水相体系中进行提取，提取液安全无毒，提取高效，能够得到提取率为14.6mg/g的虾青素。
2、本申请中在营养液中加入甘蔗糖蜜，一方面，使得雨生红球藻中的碳源充足，有利于提高雨生红球藻的产量，另一方面，在虾青素提取步骤中，有利于促进虾青素向离子液体中富集，进一步提高虾青素提取率。
具体实施方式
若无特殊说明，以下实施例以及对比例的原料来源如下所示。
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)FACHB-712, 来源于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库；
木瓜蛋白酶(Papain)：货号P3250-1，比活≥15 units/mg，采购于北京兰博利德生物科技有限公司；
废弃虾壳为废弃克氏原螯虾壳体，回收自小龙虾加工厂；
甘蔗糖蜜：回收自蔗糖加工厂，蔗糖含量75wt%；
BBM培养基：NaNO3 250mg、KH2PO4 175mg、K2HPO4 75mg、MgSO4·7H2O 75mg、CaCl2·2H2O 25mg、NaCl 25m、EDTA 50mg、KOH 31mg、FeSO4·7H2O 4.98mg、H3BO3 11.42mg、ZnSO4·7H2O 8.82mg、MnCl2 1.44mg、MoO3 0.71mg、CuSO4·5H2O 1.57 mg、Co（NO3)2·6H2O 0.49mg，加蒸馏水补足1000ml，可以在以上组份中加入15-20g琼脂，并蒸馏水补足1L制成固体培养基；
1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、氯化胆碱、甘油、D-葡萄糖均为市售分析纯。
实施例
实施例1
一种虾青素提取方法，按照如下制备步骤制得：
S1、营养液的制备：
废弃虾壳在清水中浸泡1天后，再次使用清水冲洗，晾干后使用功率为5W的紫外线灯消杀30min，得到无菌废弃虾壳；
将无菌废弃虾壳投入至破碎研磨机中进行破碎研磨，过滤，得到粒径为200目的虾壳粉；
称取5kg虾壳粉中加入水，搅拌混合，配制成浓度为70wt%虾壳粉悬浊液；向虾壳粉悬浊液中加入柠檬酸或碳酸氢钠溶液调节pH值为7；向虾壳粉悬浊液中加入100mL浓度为0.1g/mL的木瓜蛋白酶液，其中虾壳粉和木瓜蛋白酶的重量比为500:1；虾壳粉悬浊液升温至40℃，保温反应7h后得到酶解液；酶解液过滤，滤液即为营养液；
S2、雨生红球藻的培育：
取3L营养液和75mL雨生红球藻培养液，将雨生红球藻培养液接入至营养液中搅拌混匀，光强在4000lux，光暗比为12:12，23±2℃培养5天；
后续调整光强至7000 lux胁迫生长10天，过滤，40℃烘干得到虾青素制备原料；
S3、虾青素的提取：
将氯化胆碱与甘油按照摩尔比1:1计算、称量，搅拌混合成低共熔溶剂；将1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、低共熔溶剂以及去离子水按照重量比0.3:0.5:0.2称取，搅拌混匀得到离子液体-低共熔溶剂双水相体系；
取100g虾青素制备原料，加入柠檬酸或碳酸氢钠溶液调节pH值为7；在避光条件下，将虾青素制备原料投入至离子液体-低共熔溶剂双水相体系中进行提取，固液比1:10g/mL，升温至35℃，以150rpm的转速恒温水浴震荡，萃取0.5h后得到虾青素粗提液；
向虾青素粗提液纯化中加入水，静置12h，使得虾青素基本上完全沉淀，再进行过滤，收集得到虾青素产品。
实施例2-8
一种虾青素提取方法，与实施例1的区别在于：S1步骤中营养液的制备步骤中工艺参数不同，具体参数如下表1所示。
表1. 营养液的制备步骤中的工艺参数
实施例 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7 实施例8
虾壳粉与木瓜蛋白酶的重量比 500:1 1000:1 1500:1 1000:1 1000:1 1000:1 1000:1 1000:1
酶解温度/℃ 40 40 40 50 50 50 50 50
酶解时间/h 5 5 5 5 7 7 7 7
pH值 7 7 7 7 7 7 7 6
甘蔗糖蜜添加量/wt% / / / / / 1 5 5
注释：甘蔗糖蜜在酶解液过滤后加入，根据酶解液的重量称量甘蔗糖蜜的重量，再议100rpm的转速搅拌混匀。
实施例9-14
一种虾青素提取方法，与实施例8的区别在于：S2步骤中雨生红球藻的培育步骤中工艺参数不同，具体参数如下表2所示。
表2.雨生红球藻的培育步骤的工艺参数
实施例 实施例8 实施例9 实施例10 实施例11 实施例12 实施例13 实施例14
雨生红球藻培养液与营养液的体积比 1: 40 1: 80 1: 80 1: 80 1: 80 1: 80 1: 80
光强/ lux 2000 2000 4000 4000 4000 4000 4000
培养时间/天 5 5 5 7 7 7 7
胁迫生长的光强/ lux / / / / 10000 8000 8000
胁迫生长的时间/天 8 8 8 8 8 8 10
实施例15-17
一种虾青素提取方法，与实施例14的区别在于：S3步骤中离子液体-低共熔溶剂双水相体系的提取参数不同，具体参数如下表3所示。
表3.雨生红球藻的培育步骤的工艺参数
实施例 实施例14 实施例15 实施例16 实施例17
离子液体-低共熔溶剂双水相体系的提取温度/℃ 35 45 45 45
提取时间/h 0.5 0.5 2 2
提取pH值 7 7 7 6
实施例18
一种虾青素提取方法，与实施例1的区别在于：使用三丁基辛基氯化膦等质量替换1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐，并使用氯化胆碱与D-葡萄糖按照摩尔比1:1复配而成的低共熔溶剂等质量替换氯化胆碱与甘油按照摩尔比1:1复配而成的低共熔溶剂。
对比例
对比例1
一种虾青素提取方法，与实施例1的区别点在于，使用BBM培养基等质量替换营养液。
对比例2
一种虾青素提取方法，与实施例1的区别点在1、18于，使用甘蔗糖蜜等质量替换营养液。
对比例3
一种虾青素提取方法，与实施例1的区别点在于，使用丙酮作为萃取液等质量替换离子液体-低共熔溶剂双水相体系。
对比例4
一种虾青素提取方法，与实施例1的区别点在于，使用1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐作为萃取液等质量替换离子液体-低共熔溶剂双水相体系。
对比例5
一种虾青素提取方法，与实施例1的区别点在于，使用氯化胆碱与甘油按照摩尔比1:1复配而成的低共熔溶剂作为萃取液等质量替换离子液体-低共熔溶剂双水相体系。
性能检测试验
检测结果
表4.实施例1-18以及对比例1-5的虾青素提取率和纯度
检测对象 提取率mg/g 纯度/% 检测对象 提取率mg/g 纯度/%
实施例1 14.60 95.6 实施例13 28.47 97.6
实施例2 17.64 96.8 实施例14 29.55 97.6
实施例3 18.86 96.9 实施例15 29.64 97.6
实施例4 19.63 96.9 实施例16 29.74 97.6
实施例5 20.42 97.0 实施例17 29.83 97.6
实施例6 21.24 97.1 实施例18 11.43 95.3
实施例7 22.09 97.1 对比例1 2.80 95.8
实施例8 22.27 97.1 对比例2 0.30 95.7
实施例9 23.14 97.2 对比例3 9.92 96.4
实施例10 25.92 97.4 对比例4 8.90 96.5
实施例11 26.91 97.4 对比例5 7.59 96.3
实施例12 26.40 97.4
结合实施例1和对比例1-2并结合表4可以看出，使用市面上常规的培养基对雨生红球藻进行培养，虾青素的提取率仅为2.8mg/g；使用甘蔗糖蜜对雨生红球藻进行培养，虾青素的提取率仅为0.30mg/g；均远低于本申请实施例1中虾青素的提取率；表明使用废弃虾壳的酶解处理液作为培养基可以显著增加雨生红球藻的产量，从而提高虾青素的提取率。
结合实施例1、对比例3-5并结合表4可以看出：使用丙酮、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、氯化胆碱与甘油按照摩尔比1:1复配而成的低共熔溶剂对雨生红球藻进行提取，其提取效果均远不及本申请实施例1使用的离子液体-低共熔溶剂双水相体系，表明：本申请中离子液体-低共熔溶剂双水相体系与营养液联用，能够在短短5天的时间内得到极高的虾青素提取率；其原因可能在于：1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐的黏度过大，氯化胆碱与甘油按照摩尔比1:1复配而成的低共熔溶剂的提取效率低，效果不佳，两者互相弥补缺陷，提高虾青素的提取率。
结合实施例1和18并结合表4可以看出：更换不同的离子液体-低共熔溶剂双水相体系，虾青素的提取率保持在11.43mg/g，虽然略低于实施例1使用的离子液体-低共熔溶剂双水相体系，但虾青素提取率仍然高于单独使用离子液体或单独使用低共熔溶剂。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种虾青素提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、营养液的制备：废弃虾壳在清水中浸泡1天后，再次使用清水冲洗，晾干后使用功率为5W的紫外线灯消杀30min，得到无菌废弃虾壳；
将无菌废弃虾壳投入至破碎研磨机中进行破碎研磨，过滤，得到粒径为200目的虾壳粉；
称取5kg虾壳粉中加入水，搅拌混合，配制成浓度为70wt%虾壳粉悬浊液；向虾壳粉悬浊液中加入柠檬酸或碳酸氢钠溶液调节pH值为7；向虾壳粉悬浊液中加入100mL浓度为0.1g/mL的木瓜蛋白酶液，其中虾壳粉和木瓜蛋白酶的重量比为500:1；虾壳粉悬浊液升温至40℃，保温反应7h后得到酶解液；酶解液过滤，滤液即为营养液，备用；
S2、雨生红球藻的培育：将雨生红球藻培养液接入至营养液中，采用雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)FACHB-712，雨生红球藻培养液与营养液的体积比为1:（40-80），在光强2000-4000lux，光暗比为12:12的条件下培养5-7天，在光强7000-10000lux的条件下胁迫生长8-10天，分离得到虾青素制备原料；
S3、虾青素的提取：将虾青素制备原料投入至离子液体-低共熔溶剂双水相体系中进行提取，得到虾青素粗提液；虾青素粗提液纯化、沉淀后得到虾青素产品。
2.根据权利要求1所述的一种虾青素提取方法，其特征在于：所述步骤S1中酶解具体操作为：
经过破碎得到虾壳粉加水混合，调节pH为6-7，再加入木瓜蛋白酶液，废弃虾壳粉与木瓜蛋白酶的重量比为(500-1500):1，升温至40-50℃，保温反应5-7h，得到酶解液。
3.根据权利要求2所述的一种虾青素提取方法，其特征在于：所述步骤S1中富含虾青素的营养液中加入甘蔗糖蜜，甘蔗糖蜜的添加量为营养液重量的1-5wt%。
4.根据权利要求1所述的一种虾青素提取方法，其特征在于：所述步骤S2中胁迫生长的光强为8000lux。
5.根据权利要求1所述的一种虾青素提取方法，其特征在于：所述步骤S3中离子液体-低共熔溶剂双水相体系的组成如下：离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐，低共熔溶剂为氯化胆碱与甘油按照摩尔比1:1复配而成，离子液体、低共熔溶剂和水的重量比为0.3:0.5:0.2。
6.根据权利要求5所述的一种虾青素提取方法，其特征在于：所述步骤S3中，离子液体-低共熔溶剂双水相体系的提取温度为35-45℃。
7.根据权利要求6所述的一种虾青素提取方法，其特征在于：所述步骤S3中，离子液体-低共熔溶剂双水相体系的提取时间为0.5-2h。
8.根据权利要求1所述的一种虾青素提取方法，其特征在于：所述步骤S3中，离子液体-低共熔溶剂双水相体系的pH值为6-7。
9.根据权利要求1所述的一种虾青素提取方法，其特征在于，所述步骤S3中虾青素粗提液纯化、沉淀的具体操作为：向所述虾青素粗提液中加水，静置，过滤。
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