CN117247849B - 一种微藻的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种微藻的提取方法，属于微藻提取技术领域。将裂殖壶藻经诱导培养后，酶助发酵，超声波辅助高压均浆得到匀浆液，加入高极性离子液体，静置分层，收集离子液体层，离子液体层加入水和石油醚，振荡、加热，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；通过透析分离蛋白质和多糖，蛋白质经过螯合金属离子得到活性蛋白质，多糖经过硫酸改性得到改性多糖。将裂殖壶藻中大部分的DHA油脂、蛋白质、多糖提取出来，并经过改性、螯合修饰获得了高生理活性的活性蛋白和改性多糖，方法简单，条件温和，成本较低，能够将裂殖壶藻进行资源化利用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微藻提取技术领域，具体涉及一种微藻的提取方法。
背景技术
裂殖壶藻（Schizochytrium）是一种单细胞海洋真菌，又称裂殖壶菌，属于网粘菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科，单细胞、球形。作为单细胞海洋真菌类异养型生物，其生长过程中可积累大量营养物质，如多糖（含量为20-55%）、脂质、蛋白质（含量为15-40%）等。作为一种异养生物，裂殖壶藻可通过改变培养条件的方式，控制其体内营养成分的积累。裂殖壶藻的蛋白质含量相对较高，在蛋白质饲料资源匮乏的情况下，可作为新型的蛋白质饲料资源利用；另外，通过调整培养条件，可使裂殖壶藻油脂含量达到细胞干重的40%以上，其中二十二碳六烯酸（DHA）的含量可达总脂肪酸含量的50%以上，可作为一种功能性添加剂使用。裂殖壶藻除了高DHA含量，还含有虾青素、角鲨烯等活性成分，具有提高动物机体抗氧化、抗炎症等功能。裂殖壶藻的可溶性多糖的单糖主要为半乳糖，其次为甘露糖和鼠李糖，以及少量的木糖和葡萄糖。裂殖壶藻中的多糖主要为硫酸半乳聚糖，其硫酸酯基主要在半乳糖残基的C6位。
微藻多糖的提取方法主要有：醇提取法、热水浸提法、碱浸提法、酶解提取法等。相对比而言，热水浸提法采用的温度为70-80℃，耗能多、提取时间长且容易破坏多糖结构；酶解提取法在工业生产中用量大，不经济；碱提取法会造成多糖生物活性的降低，提取率高的超临界流体提取，其费用高并且对仪器设备要求严格，也不符合经济性。
中国发明专利CN103880971B公开了一种小球藻水不溶性多糖提取的方法。用40℃-90℃的热水提取，再加入糖苷水解酶进行水解，用简单工艺进行有效提取，但该方法只是进行了提取，没有对多糖的纯化活性进行深一步的研究。
中国发明专利CN108821965B公开了一种复合酶法提取微拟球藻中EPA的方法。通过复合酶对微藻细胞壁结构和脂多糖等复合体进行降解。此方法虽具能耗低、绿色环保等优点。但是方法结构单一，单一方法的处理结果比复合协同技术的效率低，不能进行更快速、更高效的提取有效功能的活性多糖成分。
中国发明专利申请CN106832030A公开了从海藻中提取活性多糖的方法。用丙酮-石油醚混合液回流脱脂，用乙醇回流脱苷类和生物碱，进行除杂；复合酶制剂酶解纤维素和果胶的效率高，并且酶解充分，对细胞壁的破坏率高；酶解将纤维素与果胶水解，破坏细胞壁结构，并且辅以超声波提取，焦磷酸钾和聚磷酸铵通过硫酸镁醋精产生意想不到的效果，促进活性多糖从海藻细胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；用Sevage试剂使蛋白质变性，去除蛋白；采用超滤、凝胶层析和透析对粗制海藻活性多糖粉末进行分离纯化，得到的海藻活性多糖，然而且缺陷在于，得到的海藻活性多糖抗氧化功能比较局限。
此外，经传统方法制备的海藻多糖，常混有较多的蛋白质，无法得到纯度、活性较高的多糖或蛋白质产物。一般选择使蛋白质沉淀而使多糖不沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等，但处理过程中多糖极易降解。
因此，如果开发一种能够有效分离微藻油脂（DHA、EPA等）、多糖、蛋白质，并且能够得到活性多糖和活性蛋白质的方法，将具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提出一种微藻的提取方法，将裂殖壶藻中大部分的DHA油脂、蛋白质、多糖提取出来，并经过改性、螯合修饰获得了高生理活性的活性蛋白和改性多糖，方法简单，条件温和，成本较低，能够将裂殖壶藻进行资源化利用，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种微藻的提取方法，将裂殖壶藻经诱导培养后，在酶的助力下，通过白参菌发酵，超声波辅助高压均浆得到匀浆液，加入高极性离子液体，静置分层，收集离子液体层，固体层用于动物饲料；离子液体层加入水和石油醚，振荡、加热，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；通过透析分离蛋白质和多糖，蛋白质经过螯合金属离子得到活性蛋白质，多糖经过硫酸改性得到改性多糖。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.诱导培养：将葡萄糖、鱼骨粉、豆粕、柠檬酸、洛伐他汀、生物素、硬脂酸钠、EDTA加入水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，光照条件下培养，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉；
S2.酶助发酵：将步骤S1制得的藻粉加入水中，加入复合酶，酶解，接种白参菌菌种种子液，酶助发酵培养，粗孔过滤，收集滤过物，得到酶助发酵混合物；
S3.超声波辅助高压均浆：将步骤S2制得的酶助发酵混合物在超声波辅助的条件下，进行高压匀浆，得到匀浆液；
S4.离子液体分离：向步骤S3中制得的匀浆液中加入离子液体，振荡，通入CO2气体，得到高极性离子液体，停止通气，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料；
S5.三相分离：向水中加入步骤S4中的离子液体层，加热使得高极性离子液体返回普通离子液体，冷却至室温，加入石油醚，振荡，静置分层，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层减压除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；离子液体层回收重复使用；
S6.蛋白质的螯合：将步骤S5中水层采用第一透析膜透析，收集透过液和第一未透过液，透过液中加入锌盐和铁盐，搅拌反应，采用第二透析膜透析，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质；
S7.多糖的改性：向步骤S6中第一未透过液中加入乙醇沉淀，干燥，制得多糖；在冰水浴条件下，将浓硫酸和正丁醇混合，加入硫酸铵和多糖，搅拌反应，调节溶液pH值为中性，加入乙醇沉淀，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得改性多糖。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述葡萄糖、鱼骨粉、豆粕、柠檬酸、洛伐他汀、生物素、硬脂酸钠、EDTA和水的质量比为12-15:5-7:3-5:1-2:0.1-0.2:0.15-0.3:0.5-1:1-2: 200-300，所述裂殖壶藻菌种种子液的接种量为7-10v/v%，所述光照的强度为2500-3000lx，所述培养的条件为O2通气量为2-4L/min，22-24℃，100-200r/min，培养3-5d。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述藻粉、复合酶的质量比为100:3-5，所述复合酶包括溶菌酶和纤维素酶，质量比为7-10:3-5，所述酶解的温度为40-45℃，时间为1-3h，所述白参菌菌种种子液的接种量为3-5v/v%，所述酶助发酵培养的条件为23-26℃，100-120r/min，培养48-72h，所述粗孔过滤的过滤筛网的孔径为150-200μm。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述超声波的功率为1500-2000W，所述高压匀浆的压力为1200-1400bar，时间为15-30min。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述离子液体选自1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟锑酸盐、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-己基-3-甲基咪唑六氟锑酸盐、1-己基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐中的至少一种，所述CO2气体的通气量为2-3L/min，通气时间为15-20min。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述离子液体层、水、石油醚的质量比为20-30:30-35:15-20，所述加热的温度为40-45℃，时间为15-20min。
作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述第一透析膜的孔径为40-50kDa，所述透过液、锌盐和铁盐的质量比为100-150:1-2:1.5-3，所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌、柠檬酸锌、硝酸锌中的至少一种，所述铁盐选自氯化铁、硫酸铁、硝酸铁中的至少一种，所述搅拌反应的时间为20-30min，所述第二透析膜的孔径为2-4kDa。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述加入乙醇至体系乙醇含量为80-85wt%，所述浓硫酸、正丁醇、硫酸铵和多糖的质量比为20-30：8-12：0.2-0.5：2-3，所述搅拌反应的时间为30-45min。
本发明进一步保护一种上述微藻的提取方法制得的活性蛋白质和改性多糖。
本发明具有如下有益效果：
裂殖壶藻的诱导培养基中，通过加入EDTA，使得能够络合裂殖壶藻中含量丰富的金属离子，减少金属离子对步骤S2中发酵白参菌产生的水解酶的抑制作用，从而有助于裂殖壶藻的细胞破壁。通过加入鱼骨粉、豆粕为氮源，总蛋白含量明显提高，且蛋氨酸、谷氨酸和精氨酸含量提高；通过加入葡萄糖为碳源，明显提高了裂殖壶藻活性物质（多糖、油脂等）的含量；通过加入生物素、柠檬酸、洛伐他汀，使得裂殖壶藻的DHA含量明显提高；通过加入消泡剂硬脂酸钠，可以使得培养液与氧气的接触更充分，使得裂殖壶藻的生长更旺盛，产量明显提高。在经过本发明培养基诱导培养下，大大提高了裂殖壶藻中多糖、DHA、蛋白质等活性组分的含量。
裂殖壶藻的细胞壁能够保持细胞完整性以及抵御入侵者和在恶劣环境下的主要保护屏障，通常是由多糖(如纤维素)、果胶、甘露糖、木聚糖、矿物质(钙、镁或硅酸盐)、蛋白质(如糖蛋白)等组成，具有机械强度高且化学耐性强等特点。因此，如何有效破除裂殖壶藻细胞壁对于提高裂殖壶藻的有效成分提取有着重要的意义。
本发明采用酶助发酵+超声波辅助高压均质的方法进行破除裂殖壶藻细胞壁，其中，发酵酶包括溶菌酶和纤维素酶，两者协同作用下，能够很好的吸附以及破裂细胞壁，进一步在白参菌的发酵作用下，白参菌产生大量的蛋白酶、糖酶、半纤维素酶等，不仅能够促进细胞壁的破裂，还能够将裂殖壶藻中大部分高分子蛋白质等酶解成小分子的蛋白质，便于后续与多糖的分离。在超声波辅助高压均质的过程中，微藻细胞平均直径明显降低，该处理使微藻细胞发生解体，获得更高的蛋白、多糖以及油脂的回收率。
离子液体具有环保性高、熔点低、挥发性极低、不可燃、热稳定性和化学稳定性高的特点，经过离子液体的提取，不会使蛋白质发生不可逆变性，从而使得提取得到的产物仍能保持高活性；本发明通过通入二氧化碳气体，能够提高离子液体的极性，从而使得大部分极性物质得以溶解进入离子液体层，使得杂质和固渣与活性物质分离，分离得到的固渣进行资源化利用，可以作为动物饲料等提高裂殖壶藻提取的经济价值。
将离子液体层经过加热，高极性离子液体返回为普通离子液体，对许多活性物质的溶解性下降，从而在石油醚和水的协同萃取作用，具有提取率高、提取时间短、环境友好、操作简便、易于规模化放大等优点，含DHA的油脂因为相似相溶原理进入石油醚层，而主要的蛋白质和多糖则进入水层；石油醚经过减压除去后，从而获得了富DHA的藻油脂；可有效地联产提取油脂、蛋白质和多糖；
水层中，蛋白质的分子量小于大分子多糖，通过选择合适孔径的透析膜，将多糖和蛋白质分离，大部分蛋白质透过透析膜进入透过液中，加入锌离子和铁离子螯合作用下，得到了Zn-Fe-螯合藻蛋白，是一种高活性蛋白质，具有很好的抗氧化、抗炎作用，能明显提高机体免疫力，促进血红蛋白的合成，缓解疲劳，补充微量元素Zn和Fe，具有更好的生理活性。未透过液中含有大量的多糖，经过醇沉后，硫酸化改性，制得改性多糖，经过改性不仅使得多糖更加稳定，还能增强功能活性，具有更好的抗氧化、保湿、降血糖、降血脂等效果，具有更广泛的应用。
本发明微藻的提取将裂殖壶藻中大部分的DHA油脂、蛋白质、多糖提取出来，并经过改性、螯合修饰获得了高生理活性的活性蛋白和改性多糖，方法简单，条件温和，成本较低，能够将裂殖壶藻进行资源化利用，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
裂殖壶藻，购于西安昌宏生物科技有限公司；裂殖壶藻菌种种子液：将裂殖壶藻经过EMMG培养基(含谷氨酸钠)（购于西安齐岳生物科技有限公司）活化，30℃摇瓶培养3d，获得裂殖壶藻菌种种子液，含菌量为107-108cfu/mL。
白参菌，购于云南裕菌隆商贸有限公司；白参菌菌种种子液：将白参菌经过斜面培养基（购于广州环微生物科技有限公司）活化，26℃，100r/min培养3的，获得白参菌菌种种子液，含菌量为106-107cfu/mL。
1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，结构如下：，购于默克生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种微藻的提取方法，包括以下步骤：
S1.诱导培养：将12重量份葡萄糖、5重量份鱼骨粉、3重量份豆粕、1重量份柠檬酸、0.1重量份洛伐他汀、0.15重量份生物素、0.5重量份硬脂酸钠、1重量份EDTA加入200重量份水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，接种量为7v/v%，光照条件下，光照的强度为2500lx，O2通气量为2L/min，22℃，100r/min，培养3d，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉；
S2.酶助发酵：将100重量份步骤S1制得的藻粉加入500重量份水中，加入3重量份复合酶，40℃酶解1h，接种白参菌菌种种子液，接种量为3v/v%，23℃，100r/min，培养48h，过滤，过滤筛网的孔径为150μm，收集滤过物，得到酶助发酵混合物；
所述复合酶包括溶菌酶和纤维素酶，质量比为7:3；
S3.超声波辅助高压均浆：将步骤S2制得的酶助发酵混合物，在1500W超声波辅助的条件下，1200bar压力条件下，10000r/min匀浆15min，得到匀浆液；
S4.离子液体分离：向步骤S3中制得的匀浆液中加入等体积1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，振荡，通入CO2气体，通气量为2L/min，通气时间为15min，得到高极性离子液体，停止通气，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料；
S5.三相分离：向30重量份水中加入20重量份步骤S4中的离子液体层，加热至40℃，时间为15min，使得高极性离子液体返回普通离子液体，冷却至室温，加入15重量份石油醚，振荡，静置分层，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层减压除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；离子液体层回收重复使用；
S6.蛋白质的螯合：将步骤S5中水层采用孔径为40kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，向100重量份透过液中加入1重量份氯化锌和1.5重量份氯化铁，搅拌反应20min，采用孔径为2kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质；
S7.多糖的改性：向步骤S6中第一未透过液中加入乙醇至体系乙醇含量为80wt%，沉淀4h，干燥，制得多糖；在冰水浴条件下，将20重量份浓度大于98wt%的浓硫酸和8重量份正丁醇混合，加入0.2重量份硫酸铵和2重量份多糖，搅拌反应30min，调节溶液pH值为中性，加入乙醇至体系乙醇含量为80wt%，沉淀4h，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得改性多糖。
实施例2
本实施例提供一种微藻的提取方法，包括以下步骤：
S1.诱导培养：将15重量份葡萄糖、7重量份鱼骨粉、5重量份豆粕、2重量份柠檬酸、0.2重量份洛伐他汀、0.3重量份生物素、1重量份硬脂酸钠、2重量份EDTA加入300重量份水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，接种量为10v/v%，光照条件下，光照的强度为3000lx，O2通气量为4L/min，24℃，200r/min，培养5d，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉；
S2.酶助发酵：将100重量份步骤S1制得的藻粉加入500重量份水中，加入5重量份复合酶，45℃酶解3h，接种白参菌菌种种子液，接种量为5v/v%，26℃，120r/min，培养72h，过滤，过滤筛网的孔径为200μm，收集滤过物，得到酶助发酵混合物；
所述复合酶包括溶菌酶和纤维素酶，质量比为10:5；
S3.超声波辅助高压均浆：将步骤S2制得的酶助发酵混合物，在2000W超声波辅助的条件下，1400bar压力条件下，10000r/min匀浆30min，得到匀浆液；
S4.离子液体分离：向步骤S3中制得的匀浆液中加入等体积1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，振荡，通入CO2气体，通气量为3L/min，通气时间为20min，得到高极性离子液体，停止通气，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料；
S5.三相分离：向35重量份水中加入30重量份步骤S4中的离子液体层，加热至45℃，时间为20min，使得高极性离子液体返回普通离子液体，冷却至室温，加入20重量份石油醚，振荡，静置分层，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层减压除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；离子液体层回收重复使用；
S6.蛋白质的螯合：将步骤S5中水层采用孔径为50kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，向150重量份透过液中加入2重量份硫酸锌和3重量份硫酸铁，搅拌反应30min，采用孔径为4kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质；
S7.多糖的改性：向步骤S6中第一未透过液中加入乙醇至体系乙醇含量为85wt%，沉淀4h，干燥，制得多糖；在冰水浴条件下，将30重量份浓度大于98wt%的浓硫酸和12重量份正丁醇混合，加入0.5重量份硫酸铵和3重量份多糖，搅拌反应45min，调节溶液pH值为中性，加入乙醇至体系乙醇含量为85wt%，沉淀4h，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得改性多糖。
实施例3
本实施例提供一种微藻的提取方法，包括以下步骤：
S1.诱导培养：将13.5重量份葡萄糖、6重量份鱼骨粉、4重量份豆粕、1.5重量份柠檬酸、0.15重量份洛伐他汀、0.22重量份生物素、0.7重量份硬脂酸钠、1.5重量份EDTA加入250重量份水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，接种量为8.5v/v%，光照条件下，光照的强度为2700lx，O2通气量为3L/min，23℃，150r/min，培养4d，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉；
S2.酶助发酵：将100重量份步骤S1制得的藻粉加入500重量份水中，加入4重量份复合酶，42℃酶解2h，接种白参菌菌种种子液，接种量为4v/v%，25℃，110r/min，培养56h，过滤，过滤筛网的孔径为200μm，收集滤过物，得到酶助发酵混合物；
所述复合酶包括溶菌酶和纤维素酶，质量比为8:4；
S3.超声波辅助高压均浆：将步骤S2制得的酶助发酵混合物，在1700W超声波辅助的条件下，1300bar压力条件下，10000r/min匀浆22min，得到匀浆液；
S4.离子液体分离：向步骤S3中制得的匀浆液中加入等体积1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，振荡，通入CO2气体，通气量为2.5L/min，通气时间为17min，得到高极性离子液体，停止通气，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料；
S5.三相分离：向32重量份水中加入25重量份步骤S4中的离子液体层，加热至42℃，时间为17min，使得高极性离子液体返回普通离子液体，冷却至室温，加入17重量份石油醚，振荡，静置分层，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层减压除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；离子液体层回收重复使用；
S6.蛋白质的螯合：将步骤S5中水层采用孔径为45kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，向125重量份透过液中加入1.5重量份硝酸锌和2重量份硝酸铁，搅拌反应25min，采用孔径为3kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质；
S7.多糖的改性：向步骤S6中第一未透过液中加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，干燥，制得多糖；在冰水浴条件下，将25重量份浓度大于98wt%的浓硫酸和10重量份正丁醇混合，加入0.35重量份硫酸铵和2.5重量份多糖，搅拌反应40min，调节溶液pH值为中性，加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得改性多糖。
实施例4
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的溶菌酶。
实施例5
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的纤维素酶。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加柠檬酸、洛伐他汀和生物素。
具体如下：
S1.诱导培养：将13.5重量份葡萄糖、6重量份鱼骨粉、4重量份豆粕、0.7重量份硬脂酸钠、1.5重量份EDTA加入250重量份水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，接种量为8.5v/v%，光照条件下，光照的强度为2700lx，O2通气量为3L/min，23℃，150r/min，培养4d，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加鱼骨粉、豆粕。
具体如下：
S1.诱导培养：将13.5重量份葡萄糖、1.5重量份柠檬酸、0.15重量份洛伐他汀、0.22重量份生物素、0.7重量份硬脂酸钠、1.5重量份EDTA加入250重量份水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，接种量为8.5v/v%，光照条件下，光照的强度为2700lx，O2通气量为3L/min，23℃，150r/min，培养4d，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加消泡剂硬脂酸钠。
具体如下：
S1.诱导培养：将13.5重量份葡萄糖、6重量份鱼骨粉、4重量份豆粕、1.5重量份柠檬酸、0.15重量份洛伐他汀、0.22重量份生物素、1.5重量份EDTA加入250重量份水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，接种量为8.5v/v%，光照条件下，光照的强度为2700lx，O2通气量为3L/min，23℃，150r/min，培养4d，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S1。
具体如下：
S1.酶助发酵：将100重量份藻粉（裂殖壶藻菌种种子液冷冻干燥获得的藻粉）加入500重量份水中，加入4重量份复合酶，42℃酶解2h，接种白参菌菌种种子液，接种量为4v/v%，25℃，110r/min，培养56h，过滤，过滤筛网的孔径为200μm，收集滤过物，得到酶助发酵混合物；
所述复合酶包括溶菌酶和纤维素酶，质量比为8:4；
S2.超声波辅助高压均浆：将步骤S1制得的酶助发酵混合物，在1700W超声波辅助的条件下，1300bar压力条件下，10000r/min匀浆22min，得到匀浆液；
S3.离子液体分离：向步骤S2中制得的匀浆液中加入等体积1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，振荡，通入CO2气体，通气量为2.5L/min，通气时间为17min，得到高极性离子液体，停止通气，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料；
S4.三相分离：向32重量份水中加入25重量份步骤S3中的离子液体层，加热至42℃，时间为17min，使得高极性离子液体返回普通离子液体，冷却至室温，加入17重量份石油醚，振荡，静置分层，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层减压除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；离子液体层回收重复使用；
S5.蛋白质的螯合：将步骤S4中水层采用孔径为45kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，向125重量份透过液中加入1.5重量份硝酸锌和2重量份硝酸铁，搅拌反应25min，采用孔径为3kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质；
S6.多糖的改性：向步骤S5中第一未透过液中加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，干燥，制得多糖；在冰水浴条件下，将25重量份浓度大于98wt%的浓硫酸和10重量份正丁醇混合，加入0.35重量份硫酸铵和2.5重量份多糖，搅拌反应40min，调节溶液pH值为中性，加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得改性多糖。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中未添加复合酶。
具体如下：
S2.发酵：将100重量份步骤S1制得的藻粉加入500重量份水中，接种白参菌菌种种子液，接种量为4v/v%，25℃，110r/min，培养56h，过滤，过滤筛网的孔径为200μm，收集滤过物，得到发酵混合物。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2。
具体如下：
S1.诱导培养：将13.5重量份葡萄糖、6重量份鱼骨粉、4重量份豆粕、1.5重量份柠檬酸、0.15重量份洛伐他汀、0.22重量份生物素、0.7重量份硬脂酸钠、1.5重量份EDTA加入250重量份水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，接种量为8.5v/v%，光照条件下，光照的强度为2700lx，O2通气量为3L/min，23℃，150r/min，培养4d，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉；
S2.超声波辅助高压均浆：将100重量份步骤S1制得的藻粉加入500重量份水中，在1700W超声波辅助的条件下，1300bar压力条件下，10000r/min匀浆22min，得到匀浆液；
S3.离子液体分离：向步骤S2中制得的匀浆液中加入等体积1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，振荡，通入CO2气体，通气量为2.5L/min，通气时间为17min，得到高极性离子液体，停止通气，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料；
S4.三相分离：向32重量份水中加入25重量份步骤S3中的离子液体层，加热至42℃，时间为17min，使得高极性离子液体返回普通离子液体，冷却至室温，加入17重量份石油醚，振荡，静置分层，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层减压除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；离子液体层回收重复使用；
S5.蛋白质的螯合：将步骤S4中水层采用孔径为45kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，向125重量份透过液中加入1.5重量份硝酸锌和2重量份硝酸铁，搅拌反应25min，采用孔径为3kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质；
S6.多糖的改性：向步骤S5中第一未透过液中加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，干燥，制得多糖；在冰水浴条件下，将25重量份浓度大于98wt%的浓硫酸和10重量份正丁醇混合，加入0.35重量份硫酸铵和2.5重量份多糖，搅拌反应40min，调节溶液pH值为中性，加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得改性多糖。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未进行超声波辅助。
具体如下：
S3.高压均浆：将步骤S2制得的酶助发酵混合物，1300bar压力条件下，10000r/min匀浆22min，得到匀浆液。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S3。
具体如下：
S1.诱导培养：将13.5重量份葡萄糖、6重量份鱼骨粉、4重量份豆粕、1.5重量份柠檬酸、0.15重量份洛伐他汀、0.22重量份生物素、0.7重量份硬脂酸钠、1.5重量份EDTA加入250重量份水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，接种量为8.5v/v%，光照条件下，光照的强度为2700lx，O2通气量为3L/min，23℃，150r/min，培养4d，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉；
S2.酶助发酵：将100重量份步骤S1制得的藻粉加入500重量份水中，加入4重量份复合酶，42℃酶解2h，接种白参菌菌种种子液，接种量为4v/v%，25℃，110r/min，培养56h，过滤，过滤筛网的孔径为200μm，收集滤过物，得到酶助发酵混合物；
所述复合酶包括溶菌酶和纤维素酶，质量比为8:4；
S3.离子液体分离：向步骤S2中制得的酶助发酵混合物中加入等体积1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，振荡，通入CO2气体，通气量为2.5L/min，通气时间为17min，得到高极性离子液体，停止通气，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料；
S4.三相分离：向32重量份水中加入25重量份步骤S3中的离子液体层，加热至42℃，时间为17min，使得高极性离子液体返回普通离子液体，冷却至室温，加入17重量份石油醚，振荡，静置分层，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层减压除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；离子液体层回收重复使用；
S5.蛋白质的螯合：将步骤S4中水层采用孔径为45kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，向125重量份透过液中加入1.5重量份硝酸锌和2重量份硝酸铁，搅拌反应25min，采用孔径为3kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质；
S6.多糖的改性：向步骤S5中第一未透过液中加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，干燥，制得多糖；在冰水浴条件下，将25重量份浓度大于98wt%的浓硫酸和10重量份正丁醇混合，加入0.35重量份硫酸铵和2.5重量份多糖，搅拌反应40min，调节溶液pH值为中性，加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得改性多糖。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未通入CO2。
具体如下：
S4.离子液体分离：向步骤S3中制得的匀浆液中加入等体积1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体，振荡，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加硝酸锌。
具体如下：
S6.蛋白质的螯合：将步骤S5中水层采用孔径为45kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，向125重量份透过液中加入3.5重量份硝酸铁，搅拌反应25min，采用孔径为3kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质。
对比例11
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加硝酸铁。
具体如下：
S6.蛋白质的螯合：将步骤S5中水层采用孔径为45kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，向125重量份透过液中加入3.5重量份硝酸锌，搅拌反应25min，采用孔径为3kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质。
对比例12
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加硝酸锌和硝酸铁。
具体如下：
S6.蛋白质的螯合：将步骤S5中水层采用孔径为45kDa的透析膜透析6h，收集透过液和第一未透过液，将透过液采用孔径为3kDa的透析膜透析5h，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质。
对比例13
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未进行硫酸化改性。
具体如下：
S7.多糖的提取：向步骤S6中第一未透过液中加入乙醇至体系乙醇含量为82wt%，沉淀4h，干燥，制得多糖。
测试例1
将100g步骤S1中获得的藻粉经过本发明实施例和对比例的方法进行提取，各组成分的产量结果见表1。
表1
由上表可知，本发明实施例1-3中的方法能够获得更多的活性蛋白质、改性多糖以及富DHA的藻油脂，且富DHA的藻油脂中DHA含量更高。
测试例2抗氧化实验
将本发明实施例1-5、对比例1-6、对比例10-13中的活性蛋白质以及改性多糖分别配制成浓度为1mg/mL的样品溶液。
反应在96孔板中进行，样品组为100mL样品溶液与100mL的DPPH（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，2,2-联苯基-1-苦基肼基）乙醇溶液的混合液，DPPH的终浓度为0.1mmol/L；空白组为100mL样品溶液和100mL无水乙醇的混合液；对照组为100mL蒸馏水和100mLDPPH乙醇溶液的混合液，DPPH的终浓度为0.1mmol/L。避光孵育30min，测波长517nm处的吸收值。每组重复3次。
DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%
式中，Ai为样品组的吸光度；Aj为空白组的吸光度；A0为对照组的吸光度。
结果见表2。
表2
由上表可知，本发明实施例1-3中的方法制得的活性蛋白质以及改性多糖的抗氧化性能较好。
测试例3抗衰老实验
将本发明实施例1-5、对比例1-6、对比例10-13中的活性蛋白质以及改性多糖分别配制成样品溶液。
将L4期的秀丽隐杆线虫加入96孔板中，包含终浓度75mmol/L的5-氟尿嘧啶，终浓度为1mg/mL的样品溶液，对照组用等量的水代替)，每孔终体积100μL，每组线虫100条左右，20℃培养24h后，加入终浓度50mmol/L的百草枯，以加入百草枯的时刻记为0h，每隔12h统计一次线虫存活情况，直至所有线虫死亡。统计前，将96孔板轻微震荡，以线虫僵直不动认定为死亡。
结果见表3。
表3
注释：*为与对照组相比，P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3中的方法制得的活性蛋白质以及改性多糖能明显提高对秀丽线虫的抗氧化保护作用，延长氧化胁迫下线虫寿命，有很好的抗衰老效果。
实施例4、5与实施例3相比，复合酶为单一的溶菌酶或纤维素酶。对比例5与实施例3相比，步骤S2中未添加复合酶。对比例6与实施例3相比，未进行步骤S2。活性蛋白质、改性多糖、富DHA的藻油脂的量下降。本发明发酵酶包括溶菌酶和纤维素酶，两者协同作用下，能够很好的吸附以及破裂细胞壁。进一步在白参菌的发酵作用下，白参菌产生大量的蛋白酶、糖酶、半纤维素酶等，不仅能够促进细胞壁的破裂，还能够将裂殖壶藻中大部分高分子蛋白质等酶解成小分子的蛋白质，便于后续与多糖的分离。
对比例1与实施例3相比，步骤S1中未添加柠檬酸、洛伐他汀和生物素。DHA含量下降，富DHA的藻油脂的量下降。对比例2与实施例3相比，步骤S1中未添加鱼骨粉、豆粕。活性蛋白质的量下降，活性蛋白质的抗氧化活性、抗衰老活性下降。对比例3与实施例3相比，步骤S1中未添加消泡剂硬脂酸钠。活性蛋白质、改性多糖、富DHA的藻油脂的量下降。对比例4与实施例3相比，未进行步骤S1。活性蛋白质、改性多糖、富DHA的藻油脂的量下降，活性蛋白质、改性多糖的抗氧化活性、抗衰老活性下降。通过加入鱼骨粉、豆粕为氮源，总蛋白含量明显提高，且蛋氨酸、谷氨酸和精氨酸含量提高；通过加入葡萄糖为碳源，明显提高了裂殖壶藻活性物质（多糖、油脂等）的含量；通过加入生物素、柠檬酸、洛伐他汀，使得裂殖壶藻的DHA含量明显提高；通过加入消泡剂硬脂酸钠，可以使得培养液与氧气的接触更充分，使得裂殖壶藻的生长更旺盛，产量明显提高。在经过本发明培养基诱导培养下，大大提高了裂殖壶藻中多糖、DHA、蛋白质等活性组分的含量。
对比例7与实施例3相比，步骤S3中未进行超声波辅助。对比例8与实施例3相比，未进行步骤S3。活性蛋白质、改性多糖、富DHA的藻油脂的量下降。在超声波辅助高压均质的过程中，微藻细胞平均直径明显降低，该处理使微藻细胞发生解体，获得更高的蛋白、多糖以及油脂的回收率。
对比例9与实施例3相比，步骤S4中未通入CO2。活性蛋白质、改性多糖、富DHA的藻油脂的量下降。本发明通过通入二氧化碳气体，能够提高离子液体的极性，从而使得大部分极性物质得以溶解进入离子液体层，然后，将离子液体层经过加热，高极性离子液体返回为普通离子液体，对许多活性物质的溶解性下降，从而在石油醚和水的协同萃取作用，具有提取率高、提取时间短、环境友好、操作简便、易于规模化放大等优点，含DHA的油脂因为相似相溶原理进入石油醚层，而主要的蛋白质和多糖则进入水层；石油醚经过减压除去后，从而获得了富DHA的藻油脂；可有效地联产提取油脂、蛋白质和多糖。
对比例10、11与实施例3相比，步骤S6中未添加硝酸锌或硝酸铁。对比例12与实施例3相比，步骤S6中未添加硝酸锌和硝酸铁。活性蛋白质的抗衰老、抗氧化活性下降。本发明在水层中，由于蛋白质的分子量小于大分子多糖，通过选择合适孔径的透析膜，将多糖和蛋白质分离，大部分蛋白质透过透析膜进入透过液中，加入锌离子和铁离子螯合作用下，得到了Zn-Fe-螯合藻蛋白，是一种高活性蛋白质，具有很好的抗氧化、抗炎作用，能明显提高机体免疫力，促进血红蛋白的合成，缓解疲劳，补充微量元素Zn和Fe，具有更好的生理活性。
对比例13与实施例3相比，步骤S7中未进行硫酸化改性。改性多糖的抗氧化、抗衰老活性下降。本发明中，未透过液中含有大量的多糖，经过醇沉后，硫酸化改性，制得改性多糖，经过改性不仅使得多糖更加稳定，还能增强功能活性，具有更好的抗氧化、保湿、降血糖、降血脂等效果，具有更广泛的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种微藻的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.诱导培养：将葡萄糖、鱼骨粉、豆粕、柠檬酸、洛伐他汀、生物素、硬脂酸钠、EDTA加入水中，灭菌，接种裂殖壶藻菌种种子液，光照条件下培养，过滤，洗涤，收集藻细胞，冷冻干燥，制得藻粉；
S2.酶助发酵：将步骤S1制得的藻粉加入水中，加入复合酶，酶解，接种白参菌菌种种子液，酶助发酵培养，粗孔过滤，收集滤过物，得到酶助发酵混合物，所述复合酶包括溶菌酶和纤维素酶，质量比为7-10:3-5；
S3.超声波辅助高压均浆：将步骤S2制得的酶助发酵混合物在超声波辅助的条件下，进行高压匀浆，得到匀浆液；
S4.离子液体分离：向步骤S3中制得的匀浆液中加入离子液体，振荡，通入CO2气体，得到高极性离子液体，停止通气，静置分层，收集离子液体层，分离固体层，洗涤，干燥，用于动物饲料，所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐；
S5.三相分离：向水中加入步骤S4中的离子液体层，加热使得高极性离子液体返回普通离子液体，冷却至室温，加入石油醚，振荡，静置分层，收集石油醚层、离子液体层和水层，石油醚层减压除去溶剂，得到富DHA的藻油脂；离子液体层回收重复使用；
S6.蛋白质的螯合：将步骤S5中水层采用第一透析膜透析，收集透过液和第一未透过液，透过液中加入锌盐和铁盐，搅拌反应，采用第二透析膜透析，收集第二未透过液，冷冻干燥，得到活性蛋白质；
S7.多糖的改性：向步骤S6中第一未透过液中加入乙醇沉淀，干燥，制得多糖；在冰水浴条件下，将浓硫酸和正丁醇混合，加入硫酸铵和多糖，搅拌反应，调节溶液pH值为中性，加入乙醇沉淀，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得改性多糖。
2. 根据权利要求1所述微藻的提取方法，其特征在于，步骤S1中所述葡萄糖、鱼骨粉、豆粕、柠檬酸、洛伐他汀、生物素、硬脂酸钠、EDTA和水的质量比为12-15:5-7:3-5:1-2:0.1-0.2:0.15-0.3:0.5-1:1-2: 200-300，所述裂殖壶藻菌种种子液的接种量为7-10v/v%，所述光照的强度为2500-3000lx，所述培养的条件为O2通气量为2-4L/min，22-24℃，100-200r/min，培养3-5d。
3.根据权利要求1所述微藻的提取方法，其特征在于，步骤S2中所述藻粉、复合酶的质量比为100:3-5，所述酶解的温度为40-45℃，时间为1-3h，所述白参菌菌种种子液的接种量为3-5v/v%，所述酶助发酵培养的条件为23-26℃，100-120r/min，培养48-72h，所述粗孔过滤的过滤筛网的孔径为150-200μm。
4.根据权利要求1所述微藻的提取方法，其特征在于，步骤S3中所述超声波的功率为1500-2000W，所述高压匀浆的压力为1200-1400bar，时间为15-30min。
5.根据权利要求1所述微藻的提取方法，其特征在于，步骤S4中所述CO2气体的通气量为2-3L/min，通气时间为15-20min。
6.根据权利要求1所述微藻的提取方法，其特征在于，步骤S5中所述离子液体层、水、石油醚的质量比为20-30:30-35:15-20，所述加热的温度为40-45℃，时间为15-20min。
7.根据权利要求1所述微藻的提取方法，其特征在于，步骤S6中所述第一透析膜的孔径为40-50kDa，所述透过液、锌盐和铁盐的质量比为100-150:1-2:1.5-3，所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌、柠檬酸锌、硝酸锌中的至少一种，所述铁盐选自氯化铁、硫酸铁、硝酸铁中的至少一种，所述搅拌反应的时间为20-30min，所述第二透析膜的孔径为2-4kDa。
8.根据权利要求1所述微藻的提取方法，其特征在于，步骤S7中所述加入乙醇至体系乙醇含量为80-85wt%，所述浓硫酸、正丁醇、硫酸铵和多糖的质量比为20-30：8-12：0.2-0.5：2-3，所述搅拌反应的时间为30-45min。
9.一种如权利要求1-8任一项所述微藻的提取方法制得的活性蛋白质和改性多糖。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103070293A (zh) * | 2013-01-22 | 2013-05-01 | 青岛琅琊台集团股份有限公司 | 从裂壶藻藻渣中提取生物蛋白质的方法 |
| CN105670771A (zh) * | 2016-02-26 | 2016-06-15 | 深圳市荣格保健品有限公司 | 一种藻油dha提取制备方法 |
| CN106832030A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-13 | 嵊州市派特普科技开发有限公司 | 从海藻中提取活性多糖的方法 |
| CN108822226A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-11-16 | 福州大学 | 一种从微藻藻渣中提取多糖的方法 |
| CN111303988A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-06-19 | 珀莱雅化妆品股份有限公司 | 一种富含甾醇的藻油的制备方法及其应用 |
| CN116686991A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-05 | 润科生物工程（福建）有限公司 | 微胶囊粉蛋白壁材糖基化和限制性酶解方法及其产物在dha微胶囊粉中的应用 |
| CN116789477A (zh) * | 2023-05-30 | 2023-09-22 | 陈华友 | 一种活性肥水剂的生产方法及在贝藻体系中的应用 |
Family Cites Families (1)
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103070293A (zh) * | 2013-01-22 | 2013-05-01 | 青岛琅琊台集团股份有限公司 | 从裂壶藻藻渣中提取生物蛋白质的方法 |
| CN105670771A (zh) * | 2016-02-26 | 2016-06-15 | 深圳市荣格保健品有限公司 | 一种藻油dha提取制备方法 |
| CN106832030A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-13 | 嵊州市派特普科技开发有限公司 | 从海藻中提取活性多糖的方法 |
| CN108822226A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-11-16 | 福州大学 | 一种从微藻藻渣中提取多糖的方法 |
| CN111303988A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-06-19 | 珀莱雅化妆品股份有限公司 | 一种富含甾醇的藻油的制备方法及其应用 |
| CN116789477A (zh) * | 2023-05-30 | 2023-09-22 | 陈华友 | 一种活性肥水剂的生产方法及在贝藻体系中的应用 |
| CN116686991A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-05 | 润科生物工程（福建）有限公司 | 微胶囊粉蛋白壁材糖基化和限制性酶解方法及其产物在dha微胶囊粉中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Extraction and fractionation of polysaccharides and B-phycoerythrin from the microalga Porphyridium cruentum by membrane technology";Alain Marcati 等;《Algal Research》;第第5卷卷;第258-263页 * |
| "三相分离法提取裂殖壶藻中油脂、蛋白质和多糖的工艺优化";魏登枭 等;《中国油脂》;第1-10页 * |
| "超临界CO2夹带乙醇萃取裂殖壶藻油脂的工艺研究";李佩雷 等;《中国粮油学报》;第58-64页 * |
| "野生糙皮侧耳多糖的提取、分离纯化和组分分析";樊小英 等;《氨基酸和生物资源》;第33卷(第1期);第10-13页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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