CN1186452C - 微生物同步发酵正十四烷生产十四碳二羧酸的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种利用微生物同步发酵正十四烷(nC14)高产十四碳二羧酸(DC14)的新方法。所用微生物为一株热带假丝酵母(Candida Tropicalis)高产突变株H-12-112。其特点是:在微生物菌种接入含有C11-C18各种正烷烃为基质的培养基后,48小时内,pH控制在7.5以下,以菌体生长为主,产生一定数量的二元酸;48-120小时,pH控制在8.0以下,120小时以后,pH控制在8.5以下,迅速产生各种二元酸。当本方法用于发酵nC14生产DC14时,在25吨罐内,发酵6天多,发酵清液中DC14产量最高达242.8g/L,后处理收率82%,DC14的纯度达到98.2%。

Description

微生物同步发酵正十四烷生产十四碳二羧酸的方法
本发明涉及微生物同步发酵正烷烃生产α,ω-二元酸的方法,尤其是发酵正十四烷(nC14)高产十四碳二羧酸(DC14)的方法。
C10以上的长链二元酸是化工合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、润滑油添加剂、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药的重要原料。尤其是十二碳二元酸(DC12)和十四碳二元酸(DC14),它们分别是合成具有特殊性能和广泛用途的高级尼龙工程塑料尼龙1212和尼龙1414等的重要原料。
如果说DC12还可以丁二烯为原料,在高温高压催化剂条件下,经过九个步骤进行合成,那么,DC14化工上至今还没有经济可行的合成方法。微生物学家应用生物工程技术,利用微生物特异的氧化能力,在常温常压下,发酵石油中的正十四烷一步加上四个氧原子,生成十四碳二元酸,弥补了化工上的不足,开辟了DC14的新来源。
在二十世纪七十年代以前,各国科学家对微生物发酵生产长链二元酸的研究,只处于理论研究阶段;从七十年代开始,进入应用研究阶段;八十年代进入小规模工业生产阶段,1984年日本建成年产200吨二元酸的生产工厂;九十年代以来,中国科学院微生物研究所培育出一批新的高产突变株,通过代谢调控研究,使DC12发酵产酸水平达到170-200g/L,1999年在山东淄博建成年产1000吨二元酸的生产工厂,成为一种新兴的绿色化学产业,为香料和尼龙工程塑料及其助剂行业提供了丰富的物美价廉的原料。
九十年代以来,出现了几个有实际生产价值的专利文献:中国专利87105445.0,用一株热带假丝酵母突变株UH-3-9,高产DC16,在16升自控罐中发酵5天,DC16为123g/L;CN1046757A,用一株热带假丝酵母突变株NP-260,高产DC17,在16升自控罐中,发酵6天,DC17为133g/L;CN1092108A,用一株热带假丝酵母突变株,NP-6-126,高产DC15,在2.5m3通用式发酵罐中,发酵6天,DC15为178g/L;CN1130685A,用一株热带假丝酵母突变株UH-2-48突变株,生产DC12,在3m3发酵罐中,发酵5天,DC12为145g/L;中国专利ZL97103876.7,用一株热带假丝酵母突变株P-12-242,高产DC13,在2.5m3发酵罐中,发酵161小时,DC13为205g/L。中科院微生物所陈远童等以UH-2-48突变株为出发株,经过反复筛选,培育出一株高产DC12的新的优良生产突变株HP-12,在20m3发酵罐中,发酵160小时,DC12达到200g/L,最高为208g/L。
对DC14的研究,报道的不多,专利申请号98121084,公开号1257126的文献,报道一株热带假丝酵母突变株PF-UV-56,发酵生产DC14,120小时,DC14为148g/L。另外,在CN1369564A中陈远童等用一株热带假丝酵母突变株NP-6-5发酵生产DC14,在10L自控罐中,发酵6天,DC14产量最高达201g/L。
本发明所用的菌株为热带假丝酵母(candida tropicalis)H-12-112,是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1):88-93,1980)为出发突变株,通过紫外线和亚硝酸的多次反复诱变筛选培育出来的,能从C11-C18的各种单一正烷烃和混合正烷烃,尤其是从正十四烷(nC14),高产出地生产相应链长的二羧酸。热带假丝酵母突变株H-12-112(以下简称H-12-112)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC NO.0900。
H-12-112的生理特征如下:
一.糖类的发酵:葡萄糖+,半乳糖+,蔗糖+,麦芽糖+,乳糖-。
二.同化:葡萄糖+,半乳糖+,山梨糖+,蔗糖+,麦芽糖+,纤维二糖+,海藻糖+,乳糖-,密二糖-,棉子糖-,松三糖+,菊芋糖-,可容性淀粉+,木糖+,L—阿戊糖+,D—阿戊糖-,核糖-,鼠李糖-,a-甲基葡萄糖苷+,甘油+,乙醇+,赤鲜醇-,甘露醇+,肌醇-,核糠醇+,半乳糖醇-,葡萄糖醇+,柠檬酸钠-,丁二酸钠+,乳酸钙-。
三.生长素的需要:生物素++,维生素B1++,维生素B2+,维生素B6+,维生素B12+,叶酸+,烟酸+,泛酸+,肌醇+,对氨基苯甲酸+。
四.其它:硝酸盐-,冻化牛奶-,雄果酸分解-,凝固牛奶-,油脂酶-。
形态特征:奶白色,皱褶型,菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征:在麦芽汁液体培养基中培养时,假菌丝多而长;在烷烃种子培养基中培养时,有一定数量的短假菌丝;而在发酵培养基中发酵时,大部分是单个椭圆细胞。
本发明的种子培养基:
(1)10个巴林糖度的麦芽汁加2%琼脂制成的固体斜面;
(2)10个巴林糖度麦芽汁液体培养基;
(3)烷烃种子培养基包含:KH2PO46-12g/L,玉米浆3-8g/L,酵母膏3-8g/L,蔗糖3-8g/L,尿素3-6g/L,重蜡40-70mL/L,自来水配置,自然PH。
培养种子的过程为:取一接种环H-12-112酵母菌体,涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管,每支装6-7mL培养基,放成斜面),于28-30℃,培养40小时。各取一支上述培养好的H-12-112菌体分别刮入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中,于28-30℃,220转/分的旋转摇床上培养40-48小时,作为摇瓶发酵种子或种母罐种子。
用本发明的H-12-112菌株生产长链二羧酸,特别是生产十四碳二羧酸的具体方法是:把发酵的种子接入PH5.5-9.0,最好为6.5-7.5的含有15-45%(V/V)的C11-C18的正烷烃和85-55%(V/V)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为:碱金属磷酸盐6-14g/L,最好为7-10g/L,氯化钠0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L,最好为3-5g/L,玉米浆0.5-3g/L,尿素0.5-2.5g/L,最好为1.0-2.0g/L,硝酸盐1-9g/L,最好2-5g/L,蔗糖10-30g/L,最好为15-25g/L,VB2为30-300ug/L,最好为100-200ug/L,青霉素为60-240单位/ml,最好为100-200单位/ml,消泡剂为
0.4-1.2g/L以及一些其它公知的营养源,在PH5.8-7.5之间将上述混合物在25-32℃,最好在27-31℃通气发酵48-170小时。48小时内,PH控制在7.5以下,以菌体生长为主,产酸为付,此时菌株生长光密度OD达到0.5以上,在48-120小时,PH控制在8.0以下,迅速产酸,从120小时以后,PH控制在8.5以下,产酸量继续迅速增长,然后将产生的二羧酸从发酵液中分离出来。在发酵开始时,混合液中正烷烃含量为10-20%(VV),以后在适当时间补加正烷烃,使发酵液中正烷烃浓度始终>5%(VV)为准。碱金属磷酸盐可从KH2PO4,NaH2PO4,K2HPO4和Na2HPO4中选一种。硝酸盐可从钾或钠盐中选一种。
发酵结束后,加入适量的水,加碱加热进行破乳分层,上层为残油,回收再用,放出中间清液,下层菌体层再处理一次或压滤或离心,合并清液,加入适量活性碳,在85-90℃,脱色30分钟,除去活性炭,脱色液加热至60-70℃,进行酸化结晶,冷却至30℃后,压滤,用空气吹干,60℃烘干,得白色十四碳二羧酸结晶。
用本发明的H-12-112菌株和发酵方法,可以生产C11-C18的各种单一和混合二羧酸。其中在25吨罐中,从十四烷发酵生产十四碳二羧酸,发酵6天多,产酸量可达225-245g/L,后处理总收率达到80%以上,纯度达到97.5-98.5%。
                        实例一
(1)取一接种环H-12-112菌种,涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上,30℃培养两天。
(2)取上述菌种一支,接入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中于30℃在220转/分的旋转摇床上培养48小时。烷烃种子培养基中KH2PO48g/L,酵母膏5g/L,玉米浆3g/L,蔗糖10g/L,尿素3g/L,重蜡50g/L,自来水配制,PH5.0。
(3)在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中,接入3.5ml上述种子液,在220转/分旋转摇床上发酵4天,每24小时用NaOH调一次PH至7.5-8.0。发酵培养基含KH2PO48g/L,酵母膏2g/L,玉米浆3g/L,氯化钠140g/L,尿素1.3g/L,VB2140mg/L,正十四烷200ml/L,泡敌0.5g/L,KNO33g/L,自来水配制,PH7.5,在110℃下灭菌30分钟。发酵结束后用HCl调PH至3,用100ml乙醚提取收集乙醚层,除去乙醚,得白色结晶,用标准NaOH溶液滴定,计算二羧酸含量。结果DC14产量为102g/L,经气相色谱分析,DC14纯度为97.4%。
                    实例二
按照实例1的方法,只是正烷烃用nC12,结果DC12的产量为90.5g/L,纯度为98.1%。
                    实例三
按照实例1的方法,只是正烷烃用nC17结果DC17的产量为75.5g/L,纯度为97.6%。
                    实例四
按照实例1的方法,只是正烷烃用nC16,结果DC16的产量为纯度95.5%。
                        实例五
种子培养基和培养方法同实例一,发酵培养基同实例一。把培养两天,经镜检无杂菌的2.5升H-12-112种液,接入经121℃灭菌40分钟,装有300升烷烃种子培养基的500升一级种母罐中,在29±1℃,350转/分,罐压1Kg/cm2,通气量1∶0.8,培养40-46小时,经镜检无杂菌之后,把全部一级种母罐中的种液,接入经同样灭菌消毒过,装有3吨烷烃种子培养基的5吨二级种母罐中,29±1℃,250转/分,,罐压1Kg/cm2,通气量1∶1,培养48小时,经镜检无杂菌之后,全部接入已灭菌消毒装有16吨发酵培养基的25吨发酵罐中,在29±1℃,180转/分,罐压0.8Kg/cm2,气压量1∶0.6条件下进行DC14发酵,在48小时之内,PH控制在7.5以下,主要生长菌体,也产生40g/L的DC14,从48-120小时,PH控制在8.0以下,在75和100小时,各补加8%正十四烷(nC14),这段时间为产酸高峰期,迅速产酸,并出现大量浅兰色晶体,到120小时产酸量达到170g/L,120小时后,PH控制在8.5以下,再补加一次nC14,到165小时发酵清液中DC14含量达到242.8g/L。发酵结束后,加水加碱加热,破乳分层,上层残油回收再用,下层菌体通过压滤,除去菌体,滤清液与中层清液合并,加入活性碳脱色15分钟,压滤除去活性炭,脱色液加水到一定浓度,加热加浓H2SO4,酸化结晶,冷却降温至30℃左右,压滤、水洗,吹干,固形物烘干,得白色DC14,后处理收率82%,纯度为98.2%。

Claims (2)

1.一种利用微生物同步发酵正十四烷生产十四碳二羧酸的方法,其特点在于以正十四烷为基质的培养基中,用热带假丝酵母(CandidaTropicalis)H-12-112即CGMCC NO.0900发酵,然后回收所形成的二元酸。
2.热带假丝酵母(Candida tropicalis)H-12-112,即CGMCCNO.0900菌株。
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