DK166506B1 - Industriel fremgangsmaade til fremstilling af blandinger af erythritol, ribitol og glycerol - Google Patents

Description

i DK 166506 B1

Opfindelsen angår en industriel fremgangsmåde til fremstilling af blandinger af erythritol, ribitol og glycerol ved aerob forgæring af en sukkerart med Moniliella tomen-tosa var. pollinis.

5

Det er velkendt, at aerob forgæring af en passende sukkerart med den gærlignende svamp Moniliella tomentosa var. pollinis vil frembringe erythritol; dette rapporteredes først af G.J. Haj ny, J.H. Smith og J.C. Garver i 10 Applied Microbiology 12, pp. 240-246 (maj 1964), der betegnede mikroben Torula I^A. Senere klassificerede Antonie' van Leeuwenhoek 37, pp. 107-118 (1971"), L. Doomes, G.L. Hennebert og H. Verachtert svampen sbm Moniliella tomentosa var. pollinis og bekræftede dennes evne til at 15 frembringe erythritol; forfatterne angav også en fuldstændig morphologisk beskrivelse af svampen, som der herved henvises til. Herudover fandt forfatterne, at Moniliella kan eksistere i to former, gær- og skimmellignende former, i det væsentlige afhængigt af dyrkningsbetingel-20 serne; på side 110 angives således, at "begge former dannes på agarskråkulturer. I stationære flydende substrater udvikles den skimmellignende form med rigeligt mycelium og flere arthrosporer end biastosporer. Under omrystning i kolber dominerer den gærlignende form med afrundede, 25 ovale og rektangulære celler frembragt ved knopskydning og ved fission, medens der ikke dannes noget mycelium".

I et forsøg på at udvikle en fremgangsmåde til fremstilling i industriel målestok af erythritol under anvendelse 30 af i begyndelsen en toliters forgæringsbeholder og senere en 600 liters forgæringsbeholder, fik man problemer med fordeling af cellerne i forgæringssubstratet. Det viste sig, at cellerne havde en tendens til at samle sig på substratets overflade, således at signifikante tab fore-35 kommer på grund af det skum, der dannes ved de fleste forgæringsprocesser. Problemet var så alvorligt, at cellerne blev ført ud af forgæringsbeholderen med skummet, DK 166506 B1 2 og forgæringsbeholderen var fuldstændigt tømt for størstedelen af cellerne i løbet af kort tid. En almindelig metode til at løse dette problem på er at reducere skummet under anvendelse af kommercielt tilgængelige anti-5 skumdannende midler og under forsøgene anvendtes en hel række af disse produkter, bl.a. følgende: SAG® 471 fra Union Carbide (dimethylpolysiloxan plus siliconoxid), "Biospumex" 05 fra Sophos (polyoxyethylenderivat i fede alkoholer), "Struktol" SB 2020 fra Schill og Seilacher 10 (blanding af fede alkoholer og estere), "Silicon" M 30 fra Dow Corning Serva (30% vandig opløsning af dimethylpolysiloxan) og "Antifoam" C fra Sigma (siliconpolymer).

I intet tilfælde sås der nogen forbedring af problemet, skummet blev stabiliseret af bakteriecellerne i en sådan 15 grad, at antiskummidlet var ineffektivt.

Det har nu vist sig, at cellerne tilbageholdes i forgæringssubstratet på trods af at opskumning forekommer, når der til forgæringssubstratet tilsættes xanthangummi, der 20 er i besiddelse af visse egenskaber som nærmere beskrevet nedenfor.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringes således en industriel metode til fremstilling af blandinger 25 af erythritol, ribitol og glycerol ved aerob forgæring af en passende sukkerart med celler af Moniliella tomentosa var. pollinis, der er ejendommelig ved, at der i forgæringssubstratet forefindes xanthangummi, der er i stand til at tilbageholde cellerne i forgæringssubstratet.

30 Når man arbejder med xanthangummi, har det vist sig, at fortrinsvis mindst 100 ppm skal være til stede og udmærkede resultater opnås ved ca. 300 ppm. Mere xanthangummi kan eventuelt anvendes for at tilbageholde cellerne i 35 forgæringssubstratet (dvs. mere end ca. 500 ppm), men et sådant overskud er unødvendigt.

DK 166506 B1 3

Den totale proces forbedres også ved til substratet at sætte et almindeligt skumdæmpende middel. Syntetiske skumdæmpende midler (f.eks. af siliconetypen eller fede alkoholer) foretrækkes i forhold til naturlige f.eks.

5 fedtolieprodukter, fordi de kan anvendes i små mængder, og den endelige forgæringsbouillon ikke behøver at renses grundigt for at fjerne dem. For de fleste syntetiske kommercielle skumdæmpende midler er 200-300 eller 400 ppm tilstrækkeligt til at opnå optimal skumkontrol.

10

Forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er erythritol, ribitol og glycerol. Tidligere arbejder har angivet fremstilling af glycerol og arabitol udover erythritol ved forgæring af sukkerarter ved hjælp 15 af Moniliella tomentosa var. pollinis. Ved den foreliggende fremgangsmåde frembringes derimod ingen arabitol, men ribitol, der fås udover erythritol og glycerol, idet disse tre er de eneste polyoler, der dannes. Typisk fås ved forgæringen et produkt bestående af ribitol, glycerol 20 og erythritol i følgende forhold baseret på den totale mængde polyoler: Ribitol 1-20%; glycerol 5-40%, idet resten udgøres af erythritol.

Moniliella tomentosa var. pollinis fås fra Centraal Bu-25 reau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Holland som CBS 461,67 og er også deponeret og offentligt tilgængelig i Commonwealth Mycological Institute Culture Collection (CMI cc), Ferry Lane, Kew, Richmond, Surrey TW9 3AF, England, under nummeret (CMI cc) 271648.

30

De mikrobielle celler dyrkes på et fast substrat indeholdende maltekstrakt (4%), gærekstrakt (0,2%) og agar (2%).

Den således opnåede kultur udsåes herefter i et steriliseret substrat indeholdende sukker, (idet mængden beskri-35 ves nedenfor) og en nitrogenkilde. Xanthangummi i en mængde på ca. 300 ppm tilsættes og fortrinsvis også et almindeligt skumdæmpende middel (som f.eks. 200 ppm dime- DK 166506 B1 4 thylpolysiloxan skumdæmpende middel). I den foreliggende beskrivelse med krav er alle procenter og dele rumfangsprocenter og dele, med mindre andet er anført.

5 Luft tilføres forgæringsbeholderen i en hastighed, der afhænger af forgæringsbeholderens størrelse og omrøringen af beholderens indhold, men hastigheden er sædvanligvis 0,1-1,5 liter luft/liter forgæringssubstrat/minut. F.eks. var luftstrømshastigheden i en 2 liters beholder 1 li-10 ter/liter/minut under omrøring med 400-800 omdrejninger pr. minut, medens hastigheden i en 600 liters beholder var' 0,5-1,0 liter/liter/minut uden omrøring udover den, der blev frembragt ved luftgennemledningen’. Forgæringen udføres ved en temperatur på mellem 27 0C og 32 °C med et 15 begyndelses pH på mellem 3 og 6, fortrinsvis 4-5. Forgæringen afbrydes, når sukkeret er opbrugt. Mængden af sukker i substratet kan variere mellem 20 og 45%, fortrinsvis 30-35%. Velegnede sukkerarter til anvendelse under både dyrkning og forgæring er dextrose (glucose), saccha-20 rose, fructose eller maltose.

Ved den tidligere fremgangsmåde beskrevet af Hajny var nævnt forskellige nitrogenkilder til anvendelse under forgæringen som f.eks. gærekstrakt, urinstof, majsstøbe-25 væske, spiret byg, melasse, maltekstrakt og tørret bærme.

Ved den omhandlede fremgangsmåde opnås gode resultater med 0,5% gærekstrakt plus 0,1% urinstof eller med 2% majsstøbevæske plus 0,02% urinstof.

30 Udgangs-pH-værdien bør være mellem ca. 3,0 og 6,0, der falder til ca. 2,0 til 3,5 under forgæringen. Ifølge L.

Hans sens, A. Van Regenmor tel og H. Verachtert, Applied Microbiology, Vol. 24, No. 5, p. 831-833 (November 1972), bevirker forgæring i laboratoriemålestok ved forskellige 35 konstante pH-værdier i væsentlige forskelle i udbytter af den totale mængde af polyoler og erythritol. Det har vist sig, at når man arbejder med forgæring i stor målestok (2 DK 166506 B1 5 liters forgæringsbeholdere eller større) er de totale polyol og erythritoludbytter mindre følsomme overfor ud-gangs-pH indenfor 4,0-6,0 området. For at undgå eller formindske problemerne med kontamination foretrækkes et 5 udgangs-pH på 4-5. Forgæringen udføres, indtil alt sukkeret er opbrugt (forgæringstiden er normalt fra mellem 4 og 12 dage, afhængig af den anvendte mængde sukker), hvorefter dyrkning afbrydes, og cellerne fjernes fra dyrkningsbouillonen f.eks. ved centrifugering. Den celle-10 fri dyrkningsbouillon, der indeholder erythritol, ribitol og glycerol kan anvendes som sådan med eller uden rensning (f.eks. ved ultrafiltrering og afmineralisering) som f.eks. polyolkomponenten ved polyurethanfremstilling. Den rensede dyrkningsbouillon kan også koncentreres til 60-15 80% opløst fast materiale og erythritolen udkrystallise res herfra, f.eks. ved metoden beskrevet af J.M. Roxburg, J.F.T. Spencer og H.R. Sallens, Canadian Journal of Technology, Vol. 34 p. 248-253 (1956). Den væske, der bliver tilbage efter udvindingen af erythritolkrystaller-20 ne, der også er en blanding af (ikke-udkrystalliseret) erythritol, ribitol og glycerol kan også anvendes efter passende behandling som råmateriale ved polyurethanfrem-stilling.

25 Følgende eksempler illustrerer opfindelsen nærmere. Fremstilling af udsåningskulturen 500 ml Erlenmeyer-kolber indeholdende 50 ml dyrkningssub-30 strat bestående af 20% dextrose, 0,5% gærekstrakt, 0,1% urinstof og 300 ppm xanthangummi tilsåedes med én koloni fra et fast substrat, og dyrkningen udførtes 3-4 dage ved en udgangs-pH-værdi på 5, en temperatur på 30 °C og under frem og tilbagegående omrøring med 100 omdrejninger pr.

35 minut. Disse kulturer anvendes i de efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1 DK 166506 B1 6

To 2 liters forgæringsbeholdere indeholdende 1,5 liter dyrkningssubstrat bestående af 32% dextrose, 0,5% gæreks-5 trakt og 0,1% urinstof tilsåedes med podningskulturen.

Til den ene forgæringsbeholder sattes 300 ppm, kommercielt tilgængelig dimethylpolysiloxan skumdæmpende middel (SAG® 471 Union Carbide); til den anden sattes 300 ppm skumdæmpende middel plus 300 ppm xanthangummi. Dyrknings-10 substratet tilførtes luft med en hastighed på 1 liter luft/liter forgæringssubstrat/minut og en hastighed for omrøreren på 680 omdrejninger pr. minut. Temperaturen var 30 “C, og udgangs-pH-værdien var 5. Efter 2' dages forløb sås mikrobeceller på bouillonens overflade i forgærings-15 beholderen, hvor man ikke havde tilsat xanthangummi, og til slut forsvandt cellerne ud af forgæringsbeholderen med skummet. I den forgæringsbeholder, hvor der var tilsat xanthangummi, forblev cellerne i bouillonen. Efter 9 dages forløb var celletætheden i dyrkningssubstratet 30 x 6 6 20 10°/ml uden xanthangummi og på 250 x 10 /ml i nærværelse af xanthangummi. Dextrosekoncentrationerne var henholdsvis 4% og 18% med og uden xanthangummi, og de respektive erythritol (og totale polyol) koncentrationer var 9,2% (10,8%) og 1,5% (2,6%).

25

Forsøget gentoges under anvendelse af yderligere kommercielt tilgængelige skumdæmpende midler alle i en mængde på 300 ppm; "Biospumex" 05 (Sophos), "Struktol" SB 2020 (Schill og Seilacher), "Silicon" M 30 (Dow Corning Ser-30 va). Resultaterne var i hvert tilfælde de samme, idet skumdæmpende middel alene ikke var i stand til at forhindre at cellerne forsvandt.

35 EKSEMPEL 2 DK 166506 B1 7

Seks 2 liters forgæringsbeholdere indeholdende 1,5 liter dyrkningssubstrat med tilsat dextrose i forskellige mæng-5 der varierende fra 20-45%, 0,5% gærekstrakt og 0,1% urinstof plus 300 ppm SAG® 471 skumdæmpningsmiddel og 300 ppm xanthangummi tilsåedes som beskrevet i det tidligere eksempel. Omrøringshastigheden var 700 omdrejninger pr. minut, gennemluftningshastigheden 1 liter/liter forgæ-10 ringssubstrat/minut, udgangs-pH-værdien var 5, og dyrkningstemperaturen var 30 °C. Dextrose- og polyolkoncen-trationerne i dyrkningsbouillonen måltes hver dag, og man lod kulturerne forgære, indtil dextrosen var opbrugt, men maksimalt i 9 dage. Resultaterne er angivet i tabel 1 ne-15 denfor: TABEL 1

Udgangs- Erythritol Total mængde 20 dextrose kone. % polyol (1) Erythritol % (g/100 ml) % (g/100 ml) udbytte (2) % 20 7,8 8,0 38 25 10,5 11,0 42 25 30 11,2 12,2 37 35 11,5 13,0 33 40 8,2 9,2 27 45 7,5 9,2 26 30 (1) Den totale mængde er erythritol, glycerol og ribitol.

(2) Vægten af produceret polyoler eller erythritol udtrykt som % af vægten af forbrugt dextrose.

Som det fremgår af tabellen, opnåedes de højeste erythri-tolkoncentrationer med 35% dextrose, medens de højeste 35 DK 166506 B1 8 erythritoludbytter baseret på den anvendte dextrose opnåedes med 25% dextrose.

EKSEMPEL 3 5

Virkningen af forskellige udgangs-pH

2 liters forgæringsbeholdere indeholdende 1,5 liter dyrkningssubstrat bestående af 32% dextrose plus gærekstrakt, 10 urinstof, skumdæmpende middel og xanthangummi som i det foranstående eksempel tilsåedes. Omrøringshastigheden var 680' omdrejninger pr. minut, gennemluftningen 1 liter/li-ter forgæringssubstrat/minut, og dyrkningstemperaturen var 30 °C. Dyrkningsbouillonernes udgangs-pH-værdier ind-15 stilledes med 1 N HC1 eller 1 N NaOH til henholdsvis værdierne 2, 3, 3,5, 4 og 6. Koncentrationerne af erythritol og de totale polyolkoncentrationer måltes efter 9 dage. Resultaterne er angivet i tabel 2: 20 TABEL 2

Erythritol Totale poly-Udgangs- Slut- kone. % ol-konc. % pH pH (g/100 ml) (g/100 ml) 25 6 2,9 11,1 14,7 4 2,6 11,7 13,8 3,5 2,2 9,7 11,4 3 2,0 7,6 10,0 30 2 1,9 0,02 0,02

Af resultaterne fremgår det, at der ikke er nogen signifikante forskelle i erythritolproduktion eller total po-35 lyolproduktion som følge af de forskellige udgangs-pH-værdier inden for området 4-6.

DK 166506 Bl 9 EKSEMPEL 4

Virkning af forskellige oxygenoverførselshastigheder 5 Seks 2 liters forgæringsbeholdere med dyrkningssubstrat, xanthangummi og skumdæmpende middel som angivet i ovenstående eksempel tilsåedes. Beluftningen var 1 liter/li-ter forgæringssubstrat/minut, omrørerens hastighed varierede mellem 400 og 790 omdrejninger pr. minut, pH var 4, 10 og dyrkningstemperaturen 30 °C. Erythritolkoncentratio- nerne og de totale polyolkoncentrationer måltes efter 11 dage i dyrkningsbouillonerne.

Resultaterne er angivet i tabel 3.

15 TABEL 3

Hastig- Erythritol Total polyol hed af kone. % kone. % 20 omrører (g/100 ml) (g/100 ml) 400 8,1 9,3 460 8,1 9,1 585 8,9 10,1 25 680 10,7 13,1 740 11,2 15,9 790 9,2 16,2 30 Som det fremgår af resultaterne steg både erythritolkon-centrationen og de totale polyolkoncentrationer med stigende gennemluftning.

35 EKSEMPEL 5 DK 166506 B1 10

Anvendelse af majsstøbevæske 5 En 2 liters forgæringsbeholder indeholdende 1,5 liter dyrkningssubstrat indeholdende 32% dextrose, 2% majsstøbevæske (50% opløste faste stoffer), 0,02% urinstof, 300 ppm SAG® 471 skumdæmpende middel og 300 ppm xanthangummi tilsåedes med podekulturen. Beluftningen var 1 liter 10 luft/liter forgæringssubstrat/minut, omrørerens hastighed 740 omdrejninger pr. minut, pH var 4, og dyrkningstemperaturen 30 °C. Forgæringen stod på i 11 dage, hvorefter erythritolindholdet i forgæringssubstratet 'viste sig at være 11% og indholdet af total polyoler 15%. Det gennem-15 snitlige daglige forbrug af dextrose var 30 g/liter/dag.

EKSEMPEL 6

En 600 liters tårn-forgæringsbeholder indeholdende 450 20 liter dyrkningssubstrat bestående af 32% dextrose, 0,5% gærekstrakt, 0,1% urinstof, 300 ppm xanthangummi og 300 ppm skumdæmpende middel SAG® 471 tilsåedes med 5% af en podekultur. Udgangs-pH-værdien var 5, beluftningen af tårnet var 225 liter pr. minut og dyrkningstemperaturen 25 var 30 °C. Efter 13 dages forløb indeholdt dyrknings bouillonen 10,8% erythritol, 5,6% glycerol, 1,7% ribitol og 0,8% dextrose. Erythritoludbyttet var 34 vægt-% og udbyttet af totale polyoler 56 vægt-% baseret på den forbrugte dextrose.

30

Ved typisk genudvindelse fjernedes cellerne ved centrifugering, og substratet klaredes ved ultrafiltrering og rensedes med ionbyttere. Den farveløse bouillon koncentreredes til 70% opløst fast materiale, og erythritol ud-35 krystalliseredes fra væsken på følgende måde. Temperaturen hævedes til 65 °C, hvorefter der afkøledes med en hastighed på 2 °C pr. time til omkring stuetemperatur.

11 DK 166506 B1

Krystallerne frafiltreredes og vaskedes en gang med ethanol. Et typisk krystallisationsudbytte var 74%, og sammensætningen af den tilbageblevne væske var erythritol 132 g/liter; glycerol 152 g/liter og ribitol 79 g/liter.

5 Sammensætningen af den tilbageblevne væske efter krystallisation af erythritol kan være ribitol, glycerol og erythritol i følgende forhold baseret på total mængde polyo-ler: Ribitol 5-30 vægt-%; glycerol 30-60 vægt-% og resten erythritol.

10 15 20 25 30 35

Claims (7)

1. Industriel fremgangsmåde til fremstilling af en blan-5 ding af erythritol, ribitol og glycerol ved aerob forgæring af en passende sukkerart med Moniliella tomentosa var. pollinis, kendetegnet ved, at der i forgæringssubstratet forefindes xanthangummi, der er i stand til at tilbageholde cellerne i forgæringssubstratet. 10

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved*, at xanthangummien forefindes i en mængde på mellem 100 ppm og 500 ppm af forgæringssubstratet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at der også er tilsat forgæringen et almindeligt skumdæmpende middel.

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående 20 krav, kendetegnet ved, at luftstrømmen er mellem 0,1 og 1,5 liter/liter forgæringssubstrat/minut.

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at sukker arten er dex- 25 trose.

6. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at sukkerarten ved forgæringens begyndelse forefindes i forgæringsbouillonen i 30 en mængde på mellem 20 og 45%.

7. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at pH-værdien ved forgæringens begyndelse indstilles til mellem 3 og 6, for- 35 trinsvis mellem 4 og 5.