FI85502B - Foerfarande foer framstaellning av polyoler genom pao industriell skala baserad fermentation av socker. - Google Patents

Description

1 85502

Teollista mittakaavaa oleva sokerien fermentointiin perustuva polyolien valmistusmenetelmä

Keksintö koskee teollista mittakaavaa olevaa poly-5 olien, erityisesti erytritolin valmistusprosessia, jossa aerobisesti fermentoidaan sokeria sietävän sienen, Moni-liella tomentosa var. pollinisrn kanssa.

Tiedetään, että aerobisesti fermentoimalla sopivaa sokeria hiivamaisen sienen Moniliella tomentosa var. polio linisrn kanssa, saadaan erytritolia: tämän esittivät ensimmäisinä G.J. Hajny, J.H. Smith ja J.C. Garver Applied Microbiology 12, sivut 240 - 246 (toukokuu 1964), jotka nimesivät mikrobin Torula I2A:ksi. Myöhemmin Antonie van Leeuwenhoek:ssa sivulla 107 - 118 (1971), L.Dooms, G.L. 15 Hennebert ja H. Verachtert luokittelivat sienen Moniliella tomentosa var. pollinis:ksi ja varmistivat sen kyvyn tuottaa erytritolia; kirjoittajat esittävät myös mikrobin täydellisen morfologisen kuvauksen, johon tässä viitataan. Lisäksi he havaitsivat, että Moniliella voi esiintyä kah-20 dessa eri muodossa hiivamaisena ja homemaisena muotona riippuen pääasiassa käytetyistä kasvatusolosuhteista; sivulla 10 he esittävät: "Agar-vinopinnoilla tuotetaan molempia muotoja. Stationaarisessa nestealustassa syntyy homemaista muotoa, jolla on runsaasti rihmastoa ja enemmän 25 artrosporeja kuin blastosporeja. Ravistuspulloissa kasvatetuissa kasvustoissa on vallitsevana hiivamainen muoto, jossa on pyöreitä, soikeita Ja suorakulmaisia soluja, jotka ovat muodostuneet kuroutumalla ja jakautumalla, samalla kun rihmastoa ei muodostu.

30 Moniliella tomentosa var. pollinis:ta toimittaa

Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Hol-lanti merkinnällä CBS 461 67, ja sitä oli myös tallennet-tuna ja yleisesti saatavissa Commonwealth Mycological Institute Culture Collection:lta (CMI cc), Ferry Lane, Kew, 35 Richmond, Surrey TW9 3AF, Yhdistynyt Kuningaskunta, numerolla (CMI cc) 271 648.

2 85502

Tutkittaessa polyolien, erityisesti erytritolin ja ribitolin teollisen prosessin suunnittelua, prosessin perustuessa sokereiden fermentointiin käyttäen Moniliella tomentosa var. pollinis:a, olemme havainneet, että toinen 5 organismin muodoista on erityisen sopiva teolliseen käyttöön ja me olemme keksineet menetelmän, jonka avulla saadaan tätä muotoa.

Keksinnön kohteena on teollinen menetelmä polyolien erityisesti erytritolin valmistamiseksi fermentoimalla 10 sokeria, muita ravinteita ja mahdollisesti vaahdonestoai-netta sisältävää fermentointialustaa Moniliella tomentosa var. pollinis-viljelmän avulla samalla ilmastaen happea sisältävällä kaasulla. Menetelmälle on tunnusomaista, että käytetään Moniliella-organismin alalajia, jolla on suuri 15 kyky tuottaa itiöitä. Me olemme havainneet, että kasvatettaessa Moniliella tomentosa var. pollinis:n itiöitä sta-tionaarisella alustalla esim. agarilla on näin tuotetuilla kasvustoilla erilaiset kyvyt tuottaa itiöitä ja olemme myös havainneet, että erilaiset kasvustotyypit voidaan 20 havaita niiden värin perusteella. Vähän itiöitä tuottavat kasvustot ovat väriltään valkoisia, kun taas paljon itiöitä tuottavat kasvustot ovat mustia.

Me olemme myös havainneet, että käytettäessä fer-mentolnnissa vähän itiöitä tuottavaa Moniliella tomento-25 sa:n pesäkkeitä (valkoiset pesäkkeet) tuotetaan fermen-tointialustassa viskoosia polysakkaridia. Lisäksi alustan viskositeetin kasvaessa pienenee hapen siirtonopeus. Hajny on osoittanut, että liian matalilla ilmastusolosuhteilla Moniliella tomentosa muuttaa osan sokerista etanoliksi, : : : 30 siten pienentäen polyolisaantoa. Suuri viskositeettiset kasvatusolosuhteet eivät siten ole edullisia polyolituo-tannolle. Lisäksi Moniliella tomentosa solut on valkea poistaa viskoosista alustasta ja polyolin talteenottaminen on myös hyvin vaikeaa. Kun pesäkkeet valmistetaan paljon 35 itiöitä tuottavista pesäkkeistä (mustat pesäkkeet) tuote- • · 3 8 5 5 Q 2 taan hyvin pieniä määriä polysakkaridia ja saadaan suurempia polyolisaantoja ja niin muodoin alhaisempi etanolin tuotanto. Keksinnön prosessin lisäetuna on se, että mustat itiöt voidaan helposti pakastekuivata ja säilyttää pitkiä 5 aikoja.

Jotta saadaan optimaalinen itiöitä tuottava orga nismi käytettäväksi keksinnön mukaisessa prosessissa, kasvatetaan Moniliella tomentosa var. pollinis:n itiöitä sopivalla alustalla ja käytetään "mustista pesäkkeistä" va-10 littuja itiöitä siirrostettaessa tuoretta alustaa, sopi van kasvatusajan kuluttua, joka voi olla korkeintaan 15 päivää lämpötilassa 28 - 32 °C, muodostuu uusia mustia pesäkkeitä ja uusi valinta suoritetaan toisen tuoreen kasvatusalustan siirrostamista varten. Edullisesti vähintään 15 neljän valinta- ja kasvatusvaiheen jälkeen (maljaus), määritetään organismin itiönmuodostamiskyky.

Organismin kasvatusalusta on edullisesti seos, jossa on mallasuutetta 4 %, hiivauutetta 2 %, agaria 2 %, veden ollessa tasapainottajana.

20 Sen jälkeen, kun Moniliella tomentosa var. polli- nis:n paljon itiöitä tuottava laji on valittu, kasvatetaan esikasvusto 2-4 päivää kasvattamalla mikro-organismia liuoksessa, jossa on korkeintaan 20 % (kuiva aine) sopivaa sokeria, kuten dekstroosia, typpilähdettä (kuten 0,5 % : 25 hiivauutetta ja 1 % ureaa tai 2 % maissin liotusvettä) ja 300 ppm ksantaanikumia (katso eteenpäin), (selityksessä ja patenttivaatimuksissa on kaikki prosentit ja osat annettu tilavuutta kohti, ellei toisin ole määritelty).

Tämän siirrostus- ja kasvatusjakson jälkeen on kas-30 vusto valmista käytettäväksi fermentointiprosessissa, jossa sitä käytetään siirrostettaessa alustaa, jossa on sokeria ja typpilähdettä.

Kyseisen keksinnön mukaisen prosessin toivottuja —: tuotteita ovat erytritoli ja ribitoli. Aikaisemmat tut- : 35 kijat ovat esittäneet glyserolin ja arabi tolin tuottamisen 4 85502 erytritolin lisäksi fermentoimalla sokereita Moniliella tomentosa var. pollinis:n kanssa. Meidän prosessimme mukaisesti ei tuoteta arabitolia, mutta saadaan ribitolia erytritolin ja glyserolin lisäksi, näiden kolmen ollessa 5 ainoita muodostuneita polyoleja. Tyypillisesti fermentoimalla saadaan liuos, jossa on ribitolia, glyserolia ja erytritolia seuraavina osuuksina kokonaispolyoleihin perustuen: ribitolia 1 - 20 %, glyserolia 5 - 40 %, erytritolin toimiessa tasapainottajana.

10 Ilmaa syötetään fermenttoriin nopeudella, joka riippuu fermentointiastian koosta ja astian sisällön se-koitusasteesta, mutta se on tavallisesti alueella 0,1 - 1,5 litraa ilmaa/litra fermentointialustaa/minuutti. Esimerkiksi 2-litran astiassa ilman syöttönopeus oli 15 1 litra/litra/minuutti sekoittimen nopeuden ollessa 400 - 800 kierrosta minuutissa, samalla, kun 600-litran astiassa nopeus oli 0,5 - 1,0 litraa/litra/minuutti ilman muuta sekoitusta kuin ilman virtauksen synnyttämä. Fermentointi suoritetaan lämpötilassa 27 - 32 °C aloitus-pH:n ollessa 20 3-6, edullisesti 4-5. Fermentointi lopetetaan, kun kaikki sokeri on käytetty. Alustan sisältämä sokerimäärä voi olla 20 - 45 %, edullisesti 30 - 35 %. Sopivia sekä kasvatuksessa että fermentoinnissa käytettäviä sokereita ovat dekstroosi (glykoosi), sakkaroosi, fruktoosi tai mal-: : 25 tOOSi.

Hajnyn esittämässä aikaisemmassa prosessissa esitetään fermentoinnissa käytettäväksi erilaisia typpiläh-teitä esimerkiksi hiivauutetta, ureaa, maissin liotusvet-tä, mallasituja, sokeriruokomelassia, massauutetta ja tis-30 leiden kuivia liukoisia aineita. Kyseisen keksinnön prosessissa saadaan hyviä tuloksia 0,5 %:lla hiivauutetta ja 0,1 % ureaa tai 2 %:lla maissin liotusvettä ja 0,02 % ureaa.

Aloitus-pH:n tulisi olla noin 3,0 - 6,0 ja se las-35 kee noin 2,0 - 3,5:een fermentoinnin aikana. L. Hanssens, 5 85502 A. Van Regenmortel ja H. Verachtert, Applied Microbiology, Vol. 24, nro 5, sivut 831 - 833 (marraskuu 1972) esittävät, että laboratoriofermentoinneissa, jotka on pidetty erilaisissa vakio pH:n arvoissa, saadaan pääosin erilaisia 5 kokonaispolyoli- erytritolisaantoja. Me olemme havainneet, että työskenneltäessä suuremman mittakaavan fermenttoreilla (2-litran fermenttorit tai suuremmat) ovat kokonaispolyoli- ja erytritolisaannot vähemmän herkkiä aloitus-pHrlle alueella 4,0 - 6,0. Kontamisnoitumisongelmien mini-10 moimiseksi tai niiden poistamiseksi on edullinen aloitus-pH 4 - 5. Fermentiota jatketaan, kunnes kaikki sokeri on käytetty (fermentoimisaika on tavallisesti 4-12 päivää riippuen käytetyn sokerin määrästä), jonka jälkeen kasvatus lopetetaan ja solut poistetaan kasvatusliuoksesta 15 esim. sentrifugoimalla. Soluista vapaa kasvatusliuos, joka sisältää erytritolia, ribitolia ja glyserolia, voidaan käyttää sellaisenaan, joko puhdistettuna tai ilman sitä (esim. ultrasuodatus ja demineralisointi), tiettyihin sovellutuksiin esimerkiksi polymeeriteollisuudessa. Puhdis-20 tettu kasvatusliuos voidaan myös konsentroida 60 - 80 %:iin liuenneita kiintoaineita ja erytritoli kiteytyy siitä esim. menetelmällä, jonka ovat esittäneet J.M. Roxburg, J.F.T. Spencer ja H.R. Sallens, Canadian Journal of Technology, Voi. 34 sivut 248 - 253 (1956). Erytritolikitei-25 den talteenoton jälkeen jäänyt liuos, joka on siis (kitey-tymättömän) erytritolin, ribitolin ja glyserolin seos, voidaan myös käyttää sopivan käsittelyn jälkeen.

Keksinnön mukainen prosessi suoritetaan edullises-ti siten, että läsnä on polysakkaridi ksantaanikumi, jolla 30 on kyky pitää Moniliella tomentosa var. pollinisrn solut fermentointialustassa ja pienentää niiden häviötä vaahdon ’ ‘ muodostuksen välityksellä, jota tapahtuu fermentoinnin ‘ aikana. Läsnä on edullisesti 100 - 500 ppm ksantaanikumia ·:**; ja erinomaisia tuloksia saavutetaan noin 300 ppm: 11a. Läs- 35 nä voi olla enemmän kumia kuin olisi tarpeellista solujen 6 85502 pitämiseksi fermentointialustassa (siis enemmän kuin noin 500 ppm), mutta tällainen ylimäärä on epätaloudellista.)

Kokonaisprosessia on myös parannettu liittämällä fermentointialustaan konventionaalista vaahtoamisenestoai-5 netta. Edullisempia ovat synteettiset vaahtoamisenestoai-neet (esim. silikonityyppi tai rasva-alkoholit) kuin luonnon tuotteet (esim. sianihraöljy), koska niitä voidaan käyttää pienempinä pitoisuuksina ja lopullista fermentoin-tiliuosta ei tarvitse tehokkaasti puhdistaa niiden poista-10 mistä varten. Useimmilla synteettisillä kaupallisilla vaahtoamisenestoaineilla on 200 - 300 tai 400 ppm riittävä optimivaahtoamiskontrollille.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu valaisemaan keksinnön käytännöllistä puolta.

15 Esimerkit a) Itiöiden valinta

Moniliella tomentosa var. pollinis:n itiöt levitettiin Petri-maljoille, joissa oli seuraavaa alustaa:

Mallasuutetta 4 % 20 Hiivauutetta 2 %

Agaria 2 %

Maljat inkuboitiin 30 °C:ssa 7 päivää. Pesäkkeet, joilla oli erilaiset kyvyt tuottaa itiöitä, havaittiin niiden värien perusteella. Vähän itiöitä tuottavat pesäkkeet oli-25 vat väriltään valkoisia samalla, kun paljon itiöitä tuottavat pesäkkeet olivat mustia. Mustan pesäkkeen itiöt käytettiin siirrostettaessa uusia Petri-maljoja, joissa oli samaa alustaa. 7 päivän kuluttua valittiin uudet mustat pesäkkeet ja käytettiin uutta siirrostusta varten. Neljän 30 peräkkäisen "maljauksen" jälkeen määritettiin itiönmuodos-tuskyky.

b) Siirrosviljelmän valmistaminen 500-ml:n Erlenmeyereihin, joissa oli 50 ml kasva-·:**· tusalustaa, jossa oli 20 % dekstroosia, 0,5 % hiivauutet- 35 ta, 0,1 % ureaa ja 300 ppm ksantaanikumia, siirrostettiin 7 85502 pesäkkeellä, joka saatiin edellä kohdassa (a) ja kasvatusta jatkettiin 3-4 päivää aloitus-pH:n ollessa 5, lämpötilassa 30 °C ja edestakaisella sekoituksella 100 heilah-dusta/minuutti.

5 Esimerkki 1

Alalajien vertailu

Valittiin edellä esitetyn (a)-kohdan mukaisesti musta alalaji, jolla on kyky tuottaa runsaasti itiöitä. Samalla tavalla valittiin myös valkoinen alalaji, jolla 10 oli taipumus tuottaa vähän itiöitä ja sitä kasvatettiin samanlaisilla menetelmillä, kunnes saatiin stabiili alalaji. Molempia alalajeja verrattiin ravistettavissa erlen-meyerpulloissa alustassa, jossa oli 32 % dekstroosia, 0,5 % hiivauutetta ja 0,1 % ureaa kahdella koesarjalla 15 (4 mustaa ja 4 valkoista). Pulloja inkuboitiin seitsemän päivää ja kukin sarjojen jäsenistä analysoitiin ja käytettiin myös siirrostettaessa uutta fermentointialustaa. Tämä menettelytapa toistettiin kuusi kertaa, jolloin saatiin kuusi peräkkäistä joukkoa tuloksia. Kunkin peräkkäisen 20 joukon neljästä tuloksesta otettiin keskiarvo ja tulokset annetaan seuraavassa taulukossa:

Paljon itiöitä tuottava Vähän itiöitä tuottava alalaji_ _alalaji_ 25 Sarja Erytri- Etanoli Polysak- Erytri- Etanoli Polysakka-toli karidi toli ridi _g/i g/1 g/l g/i a/i_g/i 1 98 1,5 3,4 53 25 11 30 2 116 1,4 3,2 36 15 7,0 3 114 0,2 2,6 56 6,3 9,2 4 106 2,4 2,8 61 26 14 5 102 3,0 2,6 52 23 13 ·:··: 6 81 1,4 2,7 54 17 12 8 85502

Fermentointiprosessi

Esimerkki 2 2-litran fermenttoriin, jossa oli 1,5 litraa kasva-5 tusalustaa, jossa oli 32 % dekstroosia, 2 % maissin lio-tusvettä (50 % liuenneita aineita), 0,02 % ureaa, 300 ppm SAG 471 vaahtoamisenestoainetta (dimetyylipolysiloksaani Union Carbidilta) ja 300 ppm ksantaanikumia, siirrostet-tiin siirrosviljelmällä. Ilman virtausnopeus oli 1 litra 10 ilmaa/litra fermentointialustaa/minuutti ja sekoitettimen nopeus oli 740 kierrosta minuutissa. Fermentoinnin annettiin jatkua 11 päivää, jonka jälkeen £ermentointialustan erytritolipitoisuuden havaittiin olevan 11 % ja kokonais-polyolipitoisuuden 15 %. Keskimääräinen päivittäinen soke-15 rin kulutus oli 30 g/litra/päivä.

Esimerkki 3 600-ml:n tornifermenttoriin, jossa oli 450 litraa kasvatusalustaa, jossa oli 32 % dekstroosia, 0,5 % hiiva-uutetta, 0,1 % ureaa, 300 ppm ksantaanikumia ja 300 ppm 20 vaahtoamisenestoainetta SAG 471®, siirrostettiin 5 %:lla siirrosviljelmää. Aloitus-pH oli 5 ja ilman virtausnopeus tornin läpi oli 225 litraa minuutissa. 13 päivän kuluttua sisälsi lopullinen kasvatusliuos 10,8 % erytritolia, 5,6 % glyserolia, 1,7 % ribitolia ja 0,8 % dekstroosia. Erytri-25 tolisaanto oli 34 % ja kokonaispolyolisaanto oli 56 % käytetystä sokerista.

Tyypillisessä talteenottomenetelmässä solut erotettiin sentrifugoimalla ja alusta kirkastettiin ultrasuo-datuksella ja puhdistettiin ionivaihtimilla. Väritön liuos 30 konsentroitiin 70 %:iin liuenneita kiintoaineita ja ery-tritoli kiteytettiin nesteestä seuraavalla tavalla. Lämpötila nostettiin 65 °C:een ja sitten jäähdytettiin nopeudella 2 °C tunnissa noin huoneenlämpötilaan asti. Kiteet otet-tiin talteen suodattamalla ja pestiin kerran etanolilla. 35 Tyypillinen kiteytyksen saanto oli 74 % ja jäljelle jäävän 9 85502 nesteen koostumus oli erytritolia 132 g/1; glyserolia 152 g/1; ribitolia 79 g/1. Yleisesti erytritolin kiteytyksen jälkeen jäljelle jäävässä nesteessä voi olla ribitolia, glyserolia ja erytritolia seuraavina osuuksina perustuen 5 kokonaispolyoleihin; ribitolia 5 - 30 %, glyserolia 30 - 60 %, erytritolin toimiessa tasapainottajana. (Nämä prosenttimäärät ovat paino/paino).

. - . . ' j

Claims (12)

1, Teollinen menetelmä polyolien erityisesti eryt-ritolin valmistamiseksi fermentoimalla sokeria, muita ra-5 vinteita ja mahdollisesti vaahdonestoainetta sisältävää fermentointialustaa Moniliella tomentosa var. pollinis-viljelmän avulla samalla ilmastaen happea sisältävällä kaasulla, tunnettu siitä, että käytetään Monili-i ella-organismin alalajia, jolla on suuri kyky tuottaa 10 itiöitä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- S n e t t u siitä, että alalaji valitaan kasvattamalla Mo niliella tomentosa var.pollinis-sienen itiöitä kiinteällä alustalla ja valitsemalla siitä ne pesäkkeet, jotka ovat 15 mustia, koska niillä on suuri kyky tuottaa itiöitä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään valittua mustaa pesäkettä uuden alustan siirrostamiseksi ja näin kasvavista pesäkkeistä valitaan uudelleen musta pesäke.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valinta ja kasvatus toistetaan vähintään neljä kertaa.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ilmaa syötetään fer- 25 mentointiin virtausnopeudella 0,1-1,5 litraa/litra fermen-tointialustaa/minuutti.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sokeri on dekstroosi.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen mene-30 telmä, tunnettu siitä, että sokeria on fermentoin- tialustassa fermentoinnin alkaessa määrässä 20-45 %.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH fermentoinnin alussa säädetään arvoon 3-6, edullisesti arvoon 4-5. j i j 11 85502

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksantaanikumia on läsnä määrässä 100-500 ppm fermentointialustasta.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen mene-5 telmä, tunnettu siitä, että fermentointiin lisätään myös tavanomaista vaahdonestoainetta.

10 β 5 5 O 2

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi-so-lut poistetaan fermentointiliemestä, joka valinnaisesti 10 puhdistetaan ja jonka sisältämät polyolit ovat ainoastaan ribitoli, glyseroli ja erytritoli seuraavina osuuksina perustuen kokonaispolyoleihin: ribitolia 1-20 %, glyse rolia 5-40 %, ja loput erytritolia.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen me-15 netelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi-so- lut poistetaan fermentointiliemestä, tämä puhdistetaan ja konsentroidaan ja erytritoli kiteytetään ja poistetaan siitä, jolloin liuos kiteytyksen jälkeen sisältää polyolit ribitoli, glyseroli ja erytritoli seuraavina osuuksina ko-20 konaispolyoleihin perustuen: ribitolia 5-30 %, glyserolia 30-60 %, ja loput erytritolia. i2 8 5 502