FI85500C - Foerfarande foer framstaellning av polyoler genom pao industriell skala baserad fermentation av socker. - Google Patents

Description

1 85500

Teollista mittakaavaa oleva sokerien fermentointiin perustuva polyolien valmistusprosessi

Kyseinen keksintö koskee teollista mittakaavaa ole-5 vaa polyolien erityisesti erytritolin ja ribitolin valmistusprosessia, joka perustuu sokerin aerobiseen fermentointiin sokeri-tolerantin sienen Moniliella tomentosa var. pollinis kanssa.

Tiedetään, että aerobisesti fermentoimalla sopivaa 10 sokeria hiivamaisen sienen Moniella tomentosa var. pollinis kanssa, tuotetaan erytritolia; tämän esittivät ensimmäiseksi 6.J. Hajny, J.H. Smith ja J.C. Garver Applied Microbiology 12, sivut 240-246 (toukokuu 1964), jotka ni-mesivät mikrobin Torula I2A:ksi. Myöhemmin, Antonie van 15 Leeuwenhoek 37, s. 107-118, L.Dooms, G.L. Hennebert ja H. Verachtert luokittelivat sienen Moniliella tomentosa var. pollinis:ksi ja vahvistivat sen käyttökelpoisuuden tuotettaessa erytritolia; kirjoittajat esittivät myös mikrobin täydellisen morfologisen kuvauksen, johon tässä viita-20 taan. Lisäksi he havaitsivat, että Moniliella voi esiintyä kahdessa muodossa, hiivamaisena ja homemaisena pääasiassa käytettyjen kasvatusolosuhteiden mukaisesti; sivulla 110 he esittävät: "Agar-vino-pinnalla tuotetaan molempia muo-*:**: toja. Stationäärisessä nestemäisessä alustassa kehittyy 25 homemaista muotoa, jossa on runsaasti rihmastoa ja enemmän :'·1· artrosporeja kuin blastosporeja. Ravistuspullokasvustois- sa on vallitsevana hiivamainen muoto, jossa on pyöreitä, soikeita ja suorakulmaisia soluja, jotka ovat muodostuneet kuroutumalla tai jakautumalla eikä rihmastoa ole muodostu-. 30 nut".

Pyrittäessä suunnittelemaan erytritolin valmista- • « · ’·1 mistä varten teollisessa mittakaavassa oleva prosessi *:··· käyttäen työn alussa 2-litran fermenttoria ja lopuksi 600- ....: litran fermenttoria, havaittiin ongelmia solujen jakaumas- ·. 35 sa fermentointialustassa. Havaittiin, että solut pyrkivät • · · * 1 · »»» · 2 85500 liittymään yhteen alustan pinnassa siten, että syntyi merkittäviä menetyksiä vaahdon muodostumisen välityksellä, jota tapahtuu useimmissa fermentointiprosesseissa. Ongelma oli niin suuri, että solut poistuivat fermenttorista vaah-5 don mukana ja fermenttorista menetettiin suurin osa soluista lyhyessä ajassa. Eräs tavanomainen ongelman ratkaisutapa oli estää vaahtoaminen käyttämällä kaupallisesti saatavissa olevaa vaahdonestoainetta ja kokeiden aikana kokeiltiin seuraavia tällaisia aineita: SAG 471® Union 10 Carbidilta (dimetyylipolysiloksaani ja piioksidi), Biospu-mex 05 Sophosilta (polyoksietyleeni johdannainen rasva-alkoholeissa) Struktol SB 2020® Schill and Seilacherilta (rasva-alkoholien ja estereiden seos), Silicon M 30®, Dow Corning Serva (dimetyylipolysiloksaanin 30 % vesiliuos) ja 15 Antifoam C® Sigmalta (silikonipolymeeri). Mikään näistä ei ratkaissut ongelmaa, sillä mikrobisolut stabiloivat vaahdon sellaisessa määrin, että ne tekivät vaahdoneston tehottomaksi .

Me olemme nyt havainneet, että solut säilyvät fer-20 mentointialustassa vaahdon muodostumisesta huolimatta lisäämällä fermentointialustaan polymeeriä, jolla on tietyt ominaisuudet, jotka esitetään tämän jälkeen.

Keksinnön mukaisesti teolliselle polyolien erityi- sesti erytritolin ja ribitolin valmistusprosessille, joka I. I 25 perustuu sopivan sokerin aerobiseen fermentointiin Moni-• · ’ ; Hella tomentosa var. pollinis solujen kanssa, on tunnus- • · 1 omaista, että fermentointialustaassa on ksantaanikumia.

• · 9 • · ·

Polymeerin tulisi olla myrkytön Moniliella tomentosa var. pollinis:lie ja sillä ei tulisi olla haitallista 30 vaikutusta fermentointiprosessille. Haluamatta sitoutua «·· ‘ : mihinkään teoreettisiin selityksiin, me uskomme, että or- ganismin solut muodostavat vapaan liittymän polymeerin « 1 kanssa, joka pitää solut fermentoinnissa vaikuttamatta . niiden kykyyn edistää fermentiota.

* · · • » · · • · · • · · • · 3 85500

Me olemme havainneet, että erityisen sopiva polymeeri on polysakkaridi ksantaanikumi, vaikkakin analogisia polymeerejä voidaan valita suorittamalla yksinkertainen testi fermentointialustassa. On mahdollista, että polymee-5 rin ja organismin solujen välinen liittyminen tapahtuu happamien ryhmien läsnäollessa polymeerissä, sillä ksantaanikumi on hapan nolysakkaridi.

Työskenneltäessä ksantaanikumin kanssa olemme havainneet, että sitä tulisi olla läsnä edullisesti vähin-10 tään 100 ppm ja erinomaisia tuloksia on saatu noin 300 ppm:llä. Voidaan käyttää enemmän polymeeriä kuin on tarpeellista solujen pitämiseksi fermentointialustassa (siis enemmän kuin noin 500 ppm), mutta tällainen ylimäärä on epätaloudellista.

15 Kokonaisprosessia on parannettu myös liittämällä fermentointialustaan tavanomaista vaahdonestoainetta. Synteettiset vaahdonestoaineet (esim. silikonityyppi tai rasva-alkoholit) ovat edullisempia kuin luonnon tuotteet (esim. silavaöljy), koska niitä voidaan käyttää pienempinä 20 määrinä ja lopullista fermentointiliuosta ei tarvitse tehokkaasti puhdistaa niiden poistamiseksi. Useimmille kaupallisille synteettisille vaahdonestoaineille on 200-300 tai 400 ppm riittävä määrä optimaaliselle vaahtoamiskont-rollille.

: 25 Tämän prosessin toivottuja tuotteita ovat keksinnön mukaisesti erytritoli ja ribitoli. Aikaisemmat alan työs-kentelijät ovat esittäneet glyserolin ja arabi tolin tuot-tamisen erytritolin lisäksi fermentoimalla sokereita Moni-liella tomentosa var. pollinisrn kanssa. Meidän menetel-, 30 mämme mukaisesti ei tuoteta arabitolia, mutta ribitolia saadaan erytritolin ja glyserolin lisäksi, näiden kolmen • · · ' ollessa ainoita muodostuneita polyoleja. Tyypillisesti ·:··· fermentiolla saadaan tuote, joka sisältää ribitolia, gly- >;··· serolia ja erytritolia seuraavina osuuksina perustuen ko- ·. 35 konaispolyoleihin: ribitoli 1-20 %? glyseroli 5-40 %; • · · *;·** erytritolin toimiessa tasapainottajana.

• · · « · * 85500

Moniliella tometosa var. pollinis:ta on saatavissa kantakokoelmasta Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Hollanti, numerolla CBS 461.67 ja sitä oli myös tallennettuna ja on yleisesti saatavissa Commonwealth 5 Mycological Institute Culture Collection:sta (CMI cc) Ferry Lane, Kew, Richmond, Surrey TW9 3AF, Yhdistyneet Kuningaskunnat numerolla (CMI cc) 271648.

Mikrobisolut kasvatetaan kiinteällä alustalla, jossa on mallasuutetta (4 %), hiivauutetta (0,2 %) ja agaria 10 (2 %). Näin muodostunut kasvusto siirrostetaan sitten ste riloituun alustaan, jossa on sokeria (määrästä puhutaan myöhemmin) ja typpilähdettä. Aikaisemmin esitettyä polymeeriä (ksantaanikumia määränä noin 300 ppm) lisätään ja edullisesti lisätään myös tavanomaista vaahdonestoainetta 15 (kuten 200 ppm dimetyylipolysiloksaani -vaahdonestoainetta). Tekstissä ja patenttivaatimuksissa ovat kaikki prosentit ja osat tilavuutta kohti, ellei toisin ole mainittu.

Ilmaa syötetään fermenttoriin määränä, jonka suu- 20 ruus riippuu fermentointiastian koosta ja astian sisällön sekoitusasteesta, mutta se on tavallisesti alueella 0,1 - 1,5 ilmalitraa/fermentointialustalitra/minuutti. Esimer- kiksi 2-litran astiassa oli ilman virtausnopeus 1 litra/ litra/minuutti sekoittimen nopeuden ollessa 400-800 kier- : 25 rosta minuutissa, nopeus oli 0,5 - 1,0 litraa/litra/mi- nuutti ilman muuta sekoitusta kuin ilman lisäyksen aiheut- ··· tama sekoitus. Fermentointi suoritetaan lämpötilassa 27- .·.*. 32°C, aloitus-pH:n ollessa 3-6, edullisesti 4-5. Fermen- • » · • m tointi lopetetaan, kun sokeri on käytetty. Alustan sisäl- . 30 tämä sokerimäärä voi olla 20-45 %, edullisesti se on 30- ... 35 %. Sopivia sokereita käytettäviksi sekä kasvatukseen • · · ‘ että fermentointiin ovat dekstroosi (glukoosi), sakkaroo- *:**: si, fruktoosi tai maltoosi.

*:**: Aikaisemmissa Hajnyn esittämissä prosesseissa esi- 35 tettiin erilaisia typpilähteitä käytettäväksi fermentoin-nissa esimerkiksi hiivauute, urea, maissin liotusnesteet, • · ♦ * · · • « 5 85500 mallasidut, sokeriruokomelassit, mallasuutteet ja tislain-ten kuivat liukenevat aineet. Kyseisen keksinnön prosessissa hyviä tuloksia saadaan käyttämällä 0,5 % hiivauutet-ta ja 0,1 % ureaa tai 2 % maissin liotusnestettä ja 0,02 % 5 ureaa.

Aloitus-pH:n tulisi olla 3,0 - 6,0, ja pH laskee arvoon noin 2,0 - 3,5 fermentoinnin aikana. L. Hanssens, A. Van Regenmortel ja H. Verachtert, Applied Microbiology, Voi. 24, No. 5 s. 831-833 (marraskuu 1972) esittävät, että 10 pitämällä laboratoriofermenttorit erilaisissa vakio pH-ar-voissa, saadaan huomattavat erot polyolien ja erytritolin kokonaissaannoissa. Me olemme havainneet, että työskenneltäessä suuremman mittakaavan fermenttoreilla (2 litran fermenttorit tai suuremmat), ovat kokonais polyoli- ja 15 erytritolisaannot vähemmän herkkiä lähtö-pH:lle alueella 4,0 - 6,0. Kontaminoitumisongelmien välttämiseksi tai niiden tekemiseksi mahdollisimman pieniksi on edullinen läh-tö-pH 4-5. Fermentointia jatketaan kunnes kaikki sokeri on käytetty (fermentointiaika on tavallisesti 4-12 päivää 20 riippuen käytetyn sokerin määrästä), jonka jälkeen kasvatus lopetetaan ja solut poistetaan kasvatusliemestä esim. sentrifugoimalla. Kasvatusliemi, josta on poistettu solut ja joka sisältää erytritolia, ribitolia ja glyserolia, voidaan käyttää sellaisenaan, joko puhdistettuna tai puh-V 25 distamatta (esim. ultrasuodatus ja demineralisointi), tiettyihin sovellutuksiin esim. polymeeriteollisuudessa. Puhdistettu kasvatusliemi voidaan myös konsentroida, siten että se sisältää 60-80 % liuenneita kiintoaineita ja kiteyttää siitä erytritoli esim. menetelmällä, jonka esittä-; 30 vät J.M. Roxburg, J.F.T. Spencer ja H.R. Sallens, Canadian Journal of Technology, Voi. 34 sivut 248-253 (1956). Liuos, joka jää jäljelle erytritolikiteiden talteenottami-sen jälkeen ja joka siis on (ei-kiteytyneen) erytritolin, *:··: ribitolin ja glyserolin seos, voidaan myös käyttää sopivan 35 käsittelyn jälkeen.

* · · • · « * · » · · * · · • * 6 85500

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu esittämään keksinnön soveltamista käytäntöön.

Siirrosviljelmän valmistaminen 500 ml:n erlenmeyereihin, Joissa oli 50 ml kasvu-5 alustaa, jossa oli 20 % dekstroosia, 0,5 % hiivauutetta, 0,1 % ureaa ja 300 ppm ksantaanikumia, siirrostettiin pesäke kiinteältä kasvualustalta Ja kasvatusta jatkettiin 3-4 päivää aloittaen pH:sta 5, lämpötilassa 30°C ja edestakaisella sekoituksella 100 heilahdusta minuutissa. Näitä 10 kasvatuksia käytettiin seuraavissa esimerkeissä.

Esimerkki 1

Kahteen 2 litran fermenttoriin, joissa oli 1,5 litraa kasvaualustaa, jossa oli 32 % dekstroosia, 0,5 % hiivauutetta ja 0,1 % ureaa, siirrostettiin siirrosviljelmää. 15 Toiseen fermenttoriin lisättiin 300 ppm kaupallisesti saatavissa olevaa dimetyylipolysiloksaani-vaahdonestoainetta (SAG 471® Union Carbidilta); toiseen fermenttoriin lisättiin 300 ppm vaahdonestoainetta ja 300 ppm ksantaanikumia. Kasvualustaan laskettiin ilmaa nopeudella 1 litra ilmaa/ 20 litra fermentointialutaa/minuutti ja sekoitettiin nopeu della 680 kierrosta minuutissa. Lämpötila oli 30°C ja läh-tö-pH oli 5. Kahden päivän toiminnan jälkeen ilmestyivät * » ··-' mikrobisolut kasvatusliemen pinnalle siinä fermenttorissa, johon ei ollut lisätty ksantaanikumia ja solut ajautuivat * · * : 25 lopulta ulos fermenttorista. Siinä fermenttorissa, johon ksantaanikumia oli lisätty, säilyivät kaikki solut nes-teessä. 9 päivän kuluttua oli solutiheys 30xl06/nil, kun :Y: ksantaanikumia ei ollut läsnä ja 250xl06, kun ksantaaniku mia oli läsnä. Dekstroosikonsentraatiot olivat 4 % ja 18 % ____: 30 vastaavasti kun ksantaanikumia oli läsnä ja kun sitä ei ··· ollut, ja vastaavat erytritolikonsentraatiot (ja kokonais- polyolikonsentraatiot) olivat 9,2 % (10,8 %) ja 1,5 % (2,6 *).

Esimerkki toistettiin käyttämällä lisäksi seuraavia . [·. 35 kaupallisia vaahdonestoaineita, kaikkia määränä 300 ppm:

Biospumex 05® (Sophos), Struktol SB 2020® (Schill ja * · · 7 85500

Seilacher), Silicon M 30® (Dow Corning Serva). Tulokset jokaisessa tapauksessa olivat samat vaahdonestoaineen ollessa tehoton yksin ehkäisemään solujen poistumista.

5 Esimerkki 2

Kuuteen 2 litran fermenttoriin, joissa oli 1,5 litraa kasvualustaa, jossa oli dekstroosia 20-45 %, 0,5 % hiivauutetta ja 0,1 % ureaa ja 300 ppm SAG 471® vaahdones-toainetta ja 300 ppm ksantaanikumia, siirrostettiin kas-10 vustoa kuten edellisessä esimerkissä. Sekoittimen nopeus oli 700 kierrosta minuutissa, ilman nopeus oli 1 litra/ litra fermentointialustaa/minuutti ja lähtö-pH oli 5. Joka päivä mitattiin kasvuliuoksen dekstroosi- ja polyolikon-sentraatiot ja fermenttorien annettiin toimia, kunnes 15 kaikki dekstroosi oli käytetty, mutta korkeintaan 9 päivää. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 1.

Taulukko 1 20 Lähtö Erytritolin Kokonais- Erytritoli- dekstroosi konsentraatio polyoli (1) saanto % %/ paino \ % /paino \ % _^tilavuus/_V tilavuus/___ / 20 7,8 8,0 38 ' y 25 25 10,5 11,0 42 V 30 11,2 12,2 37 35 11,5 13,0 33 :V: 40 8,2 9,2 27 45 7,5 9,2 26 30 __ • ^ Kokona!spolyoli on erytritoli ja glyseroli ja ribito- li.

. .1. 35 » · · ··« m • · « * · · • · 8 85500

Kuten tiedoista havaitaan, saavutettiin korkeimmat erytritolikonsentraatiot 35 %:lla dekstroosia, kun taas korkeimmat erytritolisaannot käytettyyn dekstroosiin verrattuna saavutettiin 25 %:lla dekstroosia.

5 Esimerkki 3 Lähtö-pH:n vaihtelujen vaikutus 2 litran fermenttoreihin, joissa oli 1,5 litraa kasvualustaa, jossa oli 32 % dekstroosia ja hiivauutetta, ureaa, vaahdonestoainetta ja ksantaanikumia kuten edelli-10 sessä esimerkissä, suoritettiin siirrostaminen. Sekoit-timen nopeus oli 680 kierrosta minuutissa ja ilman nopeus oli 1 litra/litra fermentointialustaa/minuutti. Kasvatus-liuosten lähtö-pH:t säädettiin IN HCl:lla tai IN NaOH:lla arvoihin 2, 3, 3, 5, 4 ja 6 vastaavasti. Lopulliset eryt-15 ritoli- ja kokonaispolyolikonsentraatiot mitattiin 9 päivän kuluttua. Tulokset esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2 20 Lähtö-pH Lopullinen Erytritolikon- Kokonaispolyoli- pH sentraatio konsentraatio % /paino \ %/paino \ -*-* _^tilavuus/_vtilavuusy_ 6 2,9 11,1 14,7 F\*: 25 4 2,6 11,7 13,8 fv 3,5 2,2 9,7 11,4 3 2,0 7,6 10,0 2 1,9 0,02 0,02 • Λ 30 ... Tuloksista havaitaan, että mitään merkittävää eroa * · · erytritolin tuotannossa tai kokonaispolyolituotannossa ei m ollut erilaisilla lähtö-pH:n arvoilla alueella 4-6.

• « 35 » · · • · · • · · - · · * · · • ♦ 9 85500

Esimerkki 4

Hapen siirtonopeuden muutoksen vaikutus Kuuteen 2 litran fermenttoriin, joissa oli kasvualustaa, ksantaanikumia ja vaahdonestoainetta kuten edel-5 lisessä esimerkissä, siirrostettiin kasvustoa. Ilman nopeus oli 1 litra/litra fermentointialustaa/minuutti ja sekoittimen nopeus oli 400-790 kierrosta minuutissa. 11 päivän kuluttua mitattiin erytritolikonsentraatiot ja kokona! spolyolikonsentraatiot kasvatusliuoksissa. Tulokset 10 esitetään taulukossa 3.

Taulukko 3

Sekoittimen nopeus Erytritolikon- Kokonaispolyoli- 15 sentraatio konsentraatio __%_%_ 400 8,1 9,3 460 8,1 9,1 585 8,9 10,1 20 680 10,7 13,1 740 11,2 15,9 _790_9^2_16,2_

Tuloksista voidaan havaita, että sekä erytritoli- 25 että kokonaispolyolikonsentraatiot kasvoivat ilmastusno- peuden kasvaessa.

Esimerkki 5

Maissin liotusnesteen käyttäminen 2 litran fermenttoriin, jossa oli 1,5 litraa kasvu-30 alustaa, jossa oli 32 % dekstroosia, 2 % maissin liotus-nestettä (50 % liuenneita kiintoaineita), 0,02 % ureaa, 300 ppm SAG 471® vaahdonestoainetta ja 300 ppm ksantaanikumia, siirrostettiin siirrosviljelmää. Ilman virtausno-peus oli 1 litra ilmaa/litra fermentointialustaa/minuutti . 35 ja sekoittimen nopeus 740 kierrosta minuutissa. Fermen- _·/. toinnin annettiin jatkua 11 päivää, jonka jälkeen fermen- 10 85500 tointialustan erytritolipitoisuuden havaittiin olevan 11 % ja kokona!spolyolipitoisuuden 15 %. Keskimääräinen päivittäinen dekstroosin kulutus oli 30 g/litra/päivä.

Esimerkki 6 5 600 litran tornifermenttoriastiaan, jossa oli 450 litraa kasvualustaa, jossa oli 32 % dekstroosia, 0,5 % hiivauutetta, 0,1 % ureaa, 300 ppm ksantaanikumia ja 300 ppm vaahdonestoainetta SAG 471®, siirrostettiin 5 %:lla siemenkasvustoa. Lähtö-pH oli 5 ja ilman virtausnopeus 10 tornin läpi oli 225 litraa minuutissa. 13 päivän kuluttua lopullinen kasvuliuos sisälsi 10,8 % erytritolia, 5,6 % glyserolia, 1,7 % ribitolia ja 0,8 % dekstroosia. Erytri-tolisaanto oli 34 % ja kokonaispolyolisaanto oli 56 % käytetystä dekstroosista.

15 Tyypillisessä talteenotossa solut erotettiin sent- rifugoimalla ja alusta selkeytettiin ultrasuodatuksella ja puhdistettiin ioninvaihtimilla. Väritön liuos konsentroitiin 70 %:iin liuenneita kiintoaineita ja erytritoli kiteytettiin liuoksesta seuraavalla tavalla. Lämpötila nos-20 tettiin 65°C:een ja sitten jäähdytettiin nopeudella 2°C tunnissa noin huoneenlämpötilaan asti. Kiteet otettiin talteen suodattamalla ja pestiin kerran etanolilla. Tyypillinen kiteytyssaanto oli 74 % ja jäljelle jääneen liuoksen koostumus oli erytritolia 132 g/1; glyserolia 152 25 g/1; ribitolia 79 g/1. Yleisesti voi erytritolin kiteytyk sen jälkeinen liuos sisältää ribitolia, glyserolia ja erytritolia seuraavina osuuksina laskettuna kokonaispolyo-leja kohti; ribitolia 5-30 %; glyserolia 30-60 % erytritolin toimiessa tasapainottajana.

» • · · • ·* · * * * * *

Claims (7)

1. Teollinen menetelmä polyolien, erityisesti eryt-ritolin ja ribitolin valmistamiseksi fermentoimalla aero- 5 bisesti sopivaa sokeria Moniliella tomentosa var. polli-nis-sienellä, tunnettu siitä, että fermentointi-alustassa on ksantaanikumia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksantaanikumia on läsnä määrässä 10 100-500 ppm fermentointialustassa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermenttoriin lisätään myös tavanomaista vaahdonestoainetta.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen mene- 15 telmä, tunnettu siitä, että ilmanvirtaus on 0,1- 1,5 litraa/litra fermentointialustaa/minuutti.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sokeri on dekstroosi.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen mene- 20 telmä, tunnettu siitä, että fermentoinnin alussa fermentointiliuoksessa on sokeria määrässä 20-45 %.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH fermentoinnin alussa säädetään arvoon 3-6, edullisesti 4-5. ; 25 * « · 12 85500