CN1304583C

CN1304583C - 二羟基丙酮的生产方法

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Publication number: CN1304583C
Application number: CNB2005100338235A
Authority: CN
Inventors: 赵金红; 陈守义; 李军涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2007-03-14
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: CN1687434A

Abstract

二羟基丙酮的生产方法，以甘油为底物采用葡萄糖酸杆菌作为发酵菌，其特征在于葡萄糖酸杆菌(gluconobacter suboxydans)与伴生菌共同发酵生产，伴生菌是选自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megeterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)三者其中的一种，也可以是它们的变异株。本发明的伴生菌发酵生产DHA的生产方法，提高了甘油转化为DHA的转化率，降低了发酵成本，缩短了发酵周期。

Description

二羟基丙酮的生产方法

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体地说涉及利用葡萄糖酸杆菌和伴生菌共同培养，生产二羟基丙酮的方法。

背景技术：

二羟基丙酮(DHA，dihydro acetone)是非常重要的化工原料，广泛用于食品添加、制药、化学合成等领域。由于其与蛋白质具有高反应性，在化妆品工业领域中，将其用作日晒肤色模拟剂。

现有技术中，二羟基丙酮的生物工程生产方法主要是采用单一的葡萄糖酸杆菌(如gluconobacter suboxydans ATCC621)，菌种在复苏后先进行预培养，然后转发酵罐扩大培养，以甘油为底物，发酵生产DHA；目前已有采用流加甘油、并在产物DHA达到一定水平(80～120g/L)后，放出部分产物，并补加原料和培养基，这样可以减少达到生产水平的生物量的时间，节约成本[见Bioprocess Biosyst Eng(2003)26：109□116]。

但由于产物DHA的积累达到或超过80～120g/L(克/毫升)时，其主要的问题是底物甘油和产物DHA在培养基中的浓度过高时，产生了高渗透压，使得发酵菌体裂解，失活，使得DHA的产率难以提高、发酵周期无法缩短。

发明内容：

本发明的目的就是为了提高甘油转化二羟基丙酮的转化率，缩短发酵周期，提供一种利用葡萄糖酸杆菌与伴生菌共同培养，以甘油为底物发酵生产二羟基丙酮的方法。

本发明的葡萄糖酸杆菌(gluconobacter suboxydans)的伴生菌选自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegeterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)三者其中的一种，也可以是它们的变异株。其中投入种子培养的葡萄糖酸杆菌和伴生菌活菌数的比例为1(葡萄糖酸杆菌)∶0.3-3(伴生菌)，优先比例范围为1(葡萄糖酸杆菌)∶1-2(伴生菌)。

本发明的葡萄糖酸杆菌可以是gluconobacter suboxydans或它的变异株，可以选自以下保藏菌：gluconobacter suboxydansATCC621，gluconobacter suboxydans AS 1.110，gluconobactersuboxydans ATCC9324，gluconobacter suboxydans IFO3255，gluconobacter suboxydans IFO3251，gluconobacter suboxydansIFO3253，gluconobacter suboxydans ATCC10245，gluconobactersuboxydans ATCC23711，gluconobacter suboxydans DSM2003。

本发明的二羟基丙酮的生产方法包括以下步骤：

(1)菌种复苏：

从斜面培养的葡萄糖酸杆菌中划线分离得到菌种，接入斜面经2～7天、28～30℃培养，直至生长出可用的单一菌落；同样，从斜面培养的芽孢杆菌中划线分离得到伴生菌单菌落，接入斜面，28℃培养1～3天；对于已经采用冻干保存的混合菌种，同样也可以采用这种菌种复苏法复苏菌种；

(2)混合菌种子培养：

将传代后得到的葡萄糖酸杆菌按划线法自然搭配伴生菌的斜面接种[1(葡萄糖酸杆菌)∶0.3-3(伴生菌)]，28℃旋转式摇床(280r/min，转/分钟)，培养16小时左右。

(3)摇瓶发酵：

将种液按接种量5％(v/v，毫升/百毫升，下同)接入摇瓶，28℃旋转式摇床(280r/min)发酵24～72小时左右。测定发酵液中DHA的含量。摇瓶发酵也可以采用自控发酵罐发酵的方式代替。摇瓶发酵在生产过程中，也可以流加补给底物。其中种子培养基可以采用以下种子培养(％：w/w，克/百克，下同)

L-山梨糖，1.5；玉米浆(干粉，下同)0.3；蛋白胨，0.5；尿素，0.4；KH₂PO₄，0.5；MgSO₄·7H₂O，0.02；自来水配制；pH6.8～7.0，装量25ml/250ml三角瓶。112℃，30分钟灭菌。种子培养基的主要条件是提供一定的营养，并且控制pH 6.8～7.0范围内。经种子培养基培养的葡萄糖酸杆菌和伴生菌经28℃培养2天的混合的微生物菌株新鲜斜面，其冻干保存方法可以是用3ml无菌10％的脱脂牛奶洗下，制成菌液和保护剂的混合液，充分混匀，在-80℃下冻干后，于-20℃保存。

而摇瓶发酵的培养基可以采用以下的培养基(％：w/w)。

甘油(工业)，8；玉米浆，2；尿素，1～1.2；自来水配制；pH 7.0，装量50ml/500ml三角瓶。112℃，30分钟灭菌。还可以采用以下培养基：甘油(工业，8～26；玉米浆，2；KH₂PO₄，0.05；MgSO₄·7H₂O，0.01；泡敌(聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚)，0.005；自来水配制；pH 6.7～7.2，112℃，20分钟灭菌。还可以采用以下培养基：酵母提取物(工业级)0.5；KH₂PO₄ 0.5；甘油10～13；泡敌(聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚)，0.005；自来水配制；pH 3.3～7.2，112℃，20分钟灭菌。其主要条件是控制pH 6.7～7.2之间；甘油的用量为(8～26％w/w)。摇瓶发酵时间优选为12～36小时。

采用流加补给底物的发酵方法可以采用：用30L到2500L自控发酵罐进行发酵培养。发酵培养基含8～28％(w/w)甘油，接种量5％(v/v)。整个发酵过程，条件为通气1∶0.8～1，溶氧控制在25％～30％，温度28～30℃，自动控制流加30％NaOH使pH控制在6.7～7.2；初始搅拌转速为200转/分钟，随着菌体生长的变化而调整转速，使溶氧维持在设定范围内，不超过1000转/分钟。发酵过程中，每隔4～8小时取样，测定甘油和DHA。甘油降低至0.5mg/ml左右，发酵结束。发酵时间为20～50小时，优选为24～36小时。

还可以采用：先进行10L的混和种子培养，经过24小时，然后接种30L到2500L自控发酵罐进行发酵培养。培养基为甘油6～13.5％；酵母提取物(工业级)0.5；玉米浆0.5；KH₂PO₄，0.5；CaCO3，2.0。pH值控制在5.5～6.5。大罐发酵和种子培养的区别在甘油浓度提高，并且在后期(20小时后)流加甘油至30％。

本发明的二羟基丙酮(DHA)的纯化及DHA和甘油的检测采用本技术领域常用的方法：离子交换层析，主要用来去除培养基中的杂质，这些杂质会干扰纯化过程。取1L发酵液，加入11g助滤剂，11gBaCO₃，搅拌15分钟，过滤，或直接用超滤方法过滤。预备离子交换树脂柱(约1英寸直径)，装入140ml的强酸阳离子交换树脂。把过滤产物以25～30ml/分钟的速度过滤，以80ml的去离子水冲洗柱子，合并洗脱液和冲洗液。预备220ml阴离子交换柱，柠檬酸盐循环中冲洗，用100ml的去离子水冲洗，真空浓缩到约110ml，温度控制在低于40℃。浓缩物中加入220ml的丁醇(n-butanol)并通过真空共沸蒸馏(低于40℃)去除水分，用折光系数方法检测水分含量。在室温下搅拌结晶物约16～20小时，用0℃的丙酮过滤和冲洗晶体，并在低于40℃的条件下干燥。

DHA和甘油的检测：用薄层层析方法检测DHA生成情况。转化过程中每3小时检测转化情况，用硅胶板薄层层析，溶剂系统为氯仿∶甲醇∶水＝80∶19∶1，碘蒸汽熏蒸，喷以如下试剂：(3g磷钼酸，45ml甲醇，45ml蒸馏水，10ml浓硫酸)。加热到100～140℃，4分钟，迁移比率Rf：甘油＝0.32；DHA＝0.55。

本发明的伴生菌发酵生产DHA的生产方法，提高了甘油转化为DHA的转化率，降低了发酵成本，缩短了发酵周期。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明，应当说明的是，实施例是对本发明的技术方案的进一步说明，但并不表明本发明仅限于这些实施例。

附图说明：

图1为葡萄糖酸杆菌、蜡状芽孢杆菌及混合菌在发酵培养不同时期的DHA转化率的结果图。

图2为葡萄糖酸杆菌单独培养及与蜡状芽孢杆菌混合培养不同时期的葡萄糖酸杆菌的600nm处的吸光度的结果图。

具体实施方式：

实施列1

葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans AS1.110)与伴生菌蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)发酵生产DHA。

培养基

种子培养基：L-山梨糖15g，玉米浆3.0g，蛋白胨5.0g，尿素4.0g，KH₂PO₄ 5.0g，CaCO₃ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，定容至1L，pH 6.8～7.0；

发酵培养基：甘油80g，玉米浆20g，尿素4.0g，KH₂PO₄ 1.0g，CaCO₃ 1.0g，定容至1L，pH 7.0

在30℃振荡培养摇瓶培养条件下，分别进行葡萄糖酸杆菌和伴生菌的单菌培养及葡萄糖酸杆菌、伴生菌的混合培养，由于600nm处吸光度值与葡萄糖酸杆菌的密度是正比，因而选取测定600nm处的吸光度值，来测定葡萄糖酸杆菌的量；间隔一段时间取样通过测定600nm处的吸光度值，测定葡萄糖酸杆菌活菌数，结果见图2。结果表明，在发酵的各个阶段，混菌培养下葡萄糖酸杆菌的生长更为迅速，其最高密度约为单菌培养时的2倍。

同时，对上述不同培养时期的DHA转化活力进行了分析，结果见图1。结果表明，单独的伴生菌测不到DHA转化活力(即单纯的伴生菌不能转化底物甘油生成DHA)，单纯的葡萄糖酸杆菌单菌及混合培养分别在发酵48小时、24小时达最高值；且在24小时时，混合培养的DHA转化率是葡萄糖酸杆菌单菌培养的转化率的近2倍。

图1进一步表明，混合菌摇瓶发酵(未流加补给底物)的时间以12～30小时为宜，在这一段时间，DHA转化率较单菌发酵有显著性提高。

实施例2

将摇瓶培养改为流加补给底物的培养方式，控制甘油含量为8～28％(w/w)，其发酵条件为用30L到2500L自控发酵罐进行发酵培养。发酵培养基含8～28％(w/w)甘油，接种量5％(v/v)。整个发酵过程，在通气1∶0.8～1，溶氧控制在25％～30％，温度28～30℃，自动控制流加30％NaOH使PH控制在6.7～7.2；初始搅拌转速为200r/分钟，随着菌体生长的变化而调整转速，使溶氧维持在设定范围内，不超过1000r/分钟。发酵过程中，每隔4～8小时取样，测定甘油和DHA。甘油降低至0.5mg/ml左右，发酵结束。

其余同实施例1。

实施例2较实施例1可以获得更高的DHA的生产量，达15-28％；其发酵时间为20-50小时；发酵时间优选为24～36小时。

实施例3

葡萄糖酸杆菌(gluconobacter suboxydans ATCC621)，伴生菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)发酵生产DHA。

其种子培养和发酵条件同实施例1；实验发现，混合菌摇瓶发酵的时间以12～30小时为宜，在这一段时间内，DHA转化率较单菌发酵有显著性提高。

实施例4

葡萄糖酸杆菌(gluconobacter suboxydans ATCC23711)，伴生菌为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。

其种子培养和发酵条件同实施例2，实验获得与实施例2相近的结果。

Claims

1、二羟基丙酮的生产方法，以甘油为底物，采用葡萄糖酸杆菌作为发酵菌，其特征在于葡萄糖酸杆菌(gluconobacter suboxydans)与伴生菌共同发酵生产，伴生菌是选自蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megeterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)三者其中的一种。

2、根据权利要求1所述的二羟基丙酮的生产方法，其特征在于生产过程包括：

(1)菌种复苏；

(2)混合菌种子培养；

(3)摇瓶发酵。

3、根据权利要求1或2所述的二羟基丙酮的生产方法，其特征在于投入种子培养的葡萄糖酸杆菌和伴生菌活菌数的比例为1∶0.3～3。

4、根据权利要求1或2所述的二羟基丙酮的生产方法，其特征在于投入种子培养的葡萄糖酸杆菌和伴生菌活菌数的比例为1∶1～2。

5、根据权利要求1或2所述的二羟基丙酮的生产方法，其特征在于发酵中甘油的浓度为8～26％重量百分比。

6、根据权利要求1或2所述的二羟基丙酮的生产方法，其特征在于发酵中pH为6.8～7.2。

7、根据权利要求1或2所述的二羟基丙酮的生产方法，其特征在于摇瓶发酵的时间为12～30小时。

8、根据权利要求1所述的二羟基丙酮的生产方法，其特征在于发酵时，流加补给底物甘油，使甘油浓度为8～28％重量百分比，发酵时间为20～50小时。

9、根据权利要求8所述的二羟基丙酮的生产方法，其特征在于发酵时间为24～36小时。