CN100463968C

CN100463968C - 一种由生物催化转化甘油制备1,3-丙二醇和二羟基丙酮的方法

Info

Publication number: CN100463968C
Application number: CNB2006100381367A
Authority: CN
Inventors: 方柏山; 陈宏文
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2009-02-25
Anticipated expiration: 2026-01-27
Also published as: CN1840668A

Abstract

本发明公开一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法，是通过酶耦合催化、辅酶再生法转化甘油、3-羟基丙醛生成二羟基丙酮和1，3-丙二醇。此方法大大提高了产品得率。

Description

一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法

技术领域

本发明涉及一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法。

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)是一种重要的化工原料，它可直接作为抗冻剂、多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料，它也用于食品、化妆品和制药等行业。其最主要的用途是作为聚酯、聚醚和聚氨酯等高分子材料的单体。以1，3-PD为单体合成的聚对苯二甲酸-1，3-丙二醇酯(polytrimethyleneterephthalate，PTT)较之以乙二醇为单体合成的聚乙烯对苯二酸酯(polyethylene terephthalate，PET)具有许多更优良的特性，如：优异的回弹性(伸长20％后取消外力可完全恢复原状)、染色性(既无需像PET那样借助载体来染色，也不必像尼龙那样用添加剂做染色后处理)、抗污性、抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性，以及抗内应力、低水吸附、低静电、良好的生物降解、可循环利用等，1，3-PD在地毯、工程塑料、服装面料等领域倍受青睐。由于以1，3-PD为原料生产的聚酯既提高了产品性能，又减轻了环境污染，因此，1，3-PD的生产和应用成为当前国际上合成纤上维材料开发的热点。

目前，国际上1，3-PD生产方法主要有三种：(1)1995年德国Degussa公司开发的丙烯醛水合加氢法；(2)1996年荷兰Shell公司开发的环氧乙烷氢甲酰化法；(3)2002年美国DuPont公司开发的葡萄糖微生物发酵法。由于丙烯醛本身也是一种重要的有机中间体，成本较高，而且属剧毒易燃易爆物品，难以储存和运输；环氧乙烷法设备投资大，技术难度高，催化剂体系复杂，制作工艺苛刻，配位体剧毒，而且这两种化学法所用的最初原料都是愈来愈贫乏的石油资源，研究以可再生资源为原料、污染程度低的生物法生产1，3-PD引起人们更高度的重视。为此，以研究、开发和经销化学品闻名于世的美国DuPont公司与Genencor公司联合研究以葡萄糖为原料发酵法生产1，3-PD的新技术，欧共体国家自1993年以来在第三、四和五个框架计划中连续大力资助德国生物技术研究中心开展甘油转化为1，3-PD的研究(甘油是葡萄糖酒精发酵或动植物脂肪加工的副产物，可视为可再生资源)。我国目前已有大连理工大学、清华大学、广西大学和华侨大学等高校开展生物法生产1，3-PD的研究。但是用微生物发酵时，细胞的生长和存活需要消耗底物，使得产物得率难于提高，以至于：(1)以甘油为碳源的1，3-PD的理论得率仅为59.5％；(2)用代谢工程菌生产1，3-PD，产物对葡萄糖得率的最高水平为51％；(3)使用肠道细菌将甘油厌氧歧化为1，3-PD的最高水平为55％。可见，用微生物发酵法提高1，3-PD得率的潜力已经很有限，如何进一步提高1，3-PD的得率关系到生物法工业化生产1，3-PD的竞争力。

1，3-二羟基丙酮(1，3-Dihydroxyacetone，DHA)，简称二羟基丙酮，是最简单的酮糖，易溶于水及乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。二羟基丙酮分子中含有三个官能团，即两个羟基和一个酮基，化学性质活泼，广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一种重要的医药、化学合成中间体和食品添加剂，得到广泛的实际应用。如作为合成鞣剂、乳化剂、增塑剂、酸醇型树脂和抗X射线剂的中间体。二羟基丙酮也是一个重要的多功能试剂，如能最有效地还原丁二烯-苯乙烯复合物，能有效地催化甲醛到羟醛、羟酮的缩合反应。目前以淀粉质原料(可再生资源)发酵法甘油生产二羟基丙酮。1，3-PD市场价格在约为8000元/吨左右，而二羟基丙酮的价格约为12万元/吨，利润空间和市场潜力很大。国内目前对二羟基丙酮作为化工原料和医药中间体，后续开发的产品种类很多，而且这些产品的市场容量也很大。国内目前对二羟基丙酮的需求量已经达到1000吨/年以上，预计随着生产成本的降低，需求量将会进一步扩大。

发明内容

本发明的目的是提供一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法，以便提高产品得率。

本发明的解决方案是：通过酶耦合催化辅酶再生法胞外有氧条件下，转化甘油、3-羟基丙醛生成二羟基丙酮和1，3-丙二醇。

酶耦合催化辅酶再生方法是利用细胞自身甘油歧化途径，即利用甘油脱氢酶GDH将甘油还原成二羟基丙酮所产生的辅酶NADH(还原型辅酶I)，使1，3-丙二醇氧化还原酶PDOR将3-羟基丙醛氧化成1，3-丙二醇和再生所需的辅酶NAD⁺(氧化型辅酶I)，同时生产1，3-丙二醇和二羟基丙酮。

在甘油转化为1，3-PD的氧化途径中，甘油在依赖于NAD⁺的甘油脱氢酶的作用下形成二羟基丙酮，再在二羟基丙酮激酶的作用下，生成二羟基丙酮磷酸，然后进入糖酵解途径，这一代谢过程是以甘油为底物生长的微生物的共同代谢途径，为微生物生长提供ATP和NADH；在还原途径中，甘油在以维生素B₁₂为辅酶的甘油脱水酶的作用下生成3-羟基丙醛，然后在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶的作用下形成1，3-PD；还原途径所需的NADH由氧化途径提供，整个过程伴随着辅酶I的再生。

上述微生物为克雷伯肺炎杆菌属。

上述微生物为梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌。

本发明与国内外1，3-PD领域的研究现状相比，本发明创新之处在于，利用细胞自身的甘油代谢途径，在国内外率先构建具有两种酶连续催化、一种辅酶同时再生的胞外有氧条件下甘油、3-羟基丙醛合成1，3-丙二醇和二羟基丙酮多酶耦合催化体系，此方法可大大提高产品得率。

附图说明

图1是辅酶再生的酶耦联法生产DHA和1，3-PD的示意图。

符号说明

Gly——甘油； DHA——二羟基丙酮；

3-HPA——3-羟基丙醛； 1，3-PD——1，3-丙二醇；

GDH——甘油脱氢酶； GDHt——甘油脱水酶；

PDOR——1，3-丙二醇氧化还原酶； NADH——还原型辅酶I；

NAD⁺——氧化型辅酶I。

具体实施例

菌种选择：

现已发现几种能以甘油为底物发酵生产1，3-PD的菌种，但还没有发现可以利用其它有机物质为底物生产1，3-PD的自然菌。到目前为止，能够生产1，3-PD的菌株主要有肠道细菌中的克雷伯肺炎杆菌属(Klebsiella pneumoniae)、产气克雷伯菌属(Klebsiellaaerogenes)、肠细菌属(Enterobacter agglomerans)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundii)以及乳杆菌属的短乳杆菌(Lactobacillibrevis)和布氏乳杆菌(Lactobacilli buchneri)、梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)和巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridia pasteuianum)等。其中K.pneumoniae、C.butyricum和C.freundii具有较高的1，3-PD转化率及生产能力，是研究得比较多的三种菌。C.butyricum具有良好的1，3-PD耐受力，但是该菌属于严格厌氧菌，培养条件苛刻。K.pneumoniae和C.butyricum属兼性厌氧菌，虽然属于病原菌，但实验所用菌株较为温和，在实验室范围内未见有其致病的报道，因此是比较适宜的1，3-PD生产菌。

参见图1所示，本发明通过酶耦合催化辅酶再生法胞外有氧条件下，转化甘油、3-羟基丙醛生成二羟基丙酮和1，3-丙二醇。本发明利用细胞自身甘油歧化途径，即利用甘油脱氢酶(GDH)将甘油还原成二羟基丙酮所产生的辅酶NADH，解决1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)将3-羟基丙醛氧化成1，3-丙二醇所需的辅酶再生问题，同时生产1，3-丙二醇和二羟基丙酮。

本发明的代谢途径是：在甘油转化为1，3-PD的氧化途径中，甘油在依赖于NAD⁺的甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase，GDH，EC1.1.1.6)的作用下形成二羟基丙酮(dihydroxyacetone，DHA)，再在二羟基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase，DhaK，EC 2.7.1.29)的作用下，生成二羟基丙酮磷酸(digydroxyacetonephosphate，DHAP)，然后进入糖酵解途径，这一代谢过程是以甘油为底物生长的微生物的共同代谢途径，为微生物生长提供ATP和NADH。在还原途径中，甘油在以维生素B₁₂为辅酶的甘油脱水酶(glycerol dehydratase，GDHt，EC 4.2.1.30)的作用下生成3-羟基丙醛(3-hydroxypropional dehyde，3-HPA)，然后在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶(1，3-propanediol oxidoreductase，PDOR，EC 1.1.1.202)的作用下形成1，3-PD。还原途径所需的NADH由氧化途径提供，整个过程伴随着辅酶I的再生。

本发明的具体制备：包括菌的培养方法、酶的制备方法、分析方法及酶耦合催化方法。

培养方法：50mL种子培养基置于250mL三角瓶，接入1mL经过活化、保存于LB培养基的菌液，37℃、120r/min旋转式摇床培养24h，得到种子液。5L发酵罐装入3L发酵培养基，在温度37C、pH7.0、转速200r/min以及接种量5％条件下，培养20h。

酶的制备方法：发酵液于6500r/min、1℃下离心30min，收集菌体，用50mmol/L、pH8.4的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，按2g湿菌体悬浮于1mL上述缓冲溶液中(含有2mmol/L二硫苏糖醇，DTT)的比例制备菌悬液，所得菌悬液保存在-20℃的冰箱中。

-20℃保存的菌悬液室温下活化，将装有10mL菌悬液的15mL离心管置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，功率400W，超声3秒，间歇2秒，超声时间12min。破碎后的悬浮液，于13000r/min、1℃下离心30min，上清液为无细胞抽提液，用于酶活力分析和酶纯化。

DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析：取6mL无细胞抽提液上样到已被50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.4，含2mmol/L二硫代苏糖醇)充分平衡的DEAE Sepharose Fast Flow 1mL预装柱，采用10个柱体积0-1mol/L KCl线性梯度洗脱，流速1mL/min，分部收集(1mL/管)，测定各管GDH、PDOR酶活。

Blue Sepharose CL-6B亲和层析：合并经离子交换洗脱具有较高GDH、PDOR酶活力的洗脱液，上样到Blue Sepharose CL-6B层析柱(1.6cm×4cm)，用10个柱体积0-2mmol/L NAD⁺线性梯度洗脱，流速2mL/min，分部收集(4mL/管)，测定各管酶活。

分析方法：

GDH、PDOR活力测定：GDH、PDOR酶活力用初速度法测定。1.5mLGDH酶活力分析反应液含有30mmol/L(NH4)2SO4、0.2mol/L甘油、2mmol/L NAD、1μmol/L Fe(NH4)2(SO4)2、0.1mol/L碳酸钾缓冲溶液(pH12.0)。45℃条件下，加入适量酶液启动反应，紫外分光光度计340nM波长下测定吸光度变化(NADH形成)。PDOR酶活力测定以1，3-PD为底物(碳酸钾缓冲溶液pH9.5)，其余同GDH酶活测定。酶活力定义为：在上述条件下，每分钟还原1μmol底物的酶量为1个单位。酶的比活力为每mg蛋白所含酶的单位数(U/mg)。

蛋白质含量测定：采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

Gly、3-HPA、1，3-PD和DHA的含量测定：反应液样品(2mL)在10000r/min下离心5min，取上清液进样。色谱柱：Bio-Rad公司Aminex HPX-87H离子交换柱(7.8mmi.d.×300mm)，流动相为水：乙腈＝65：35(含0.001N H2SO4)溶液，流速为0.5mL/min，柱温25℃，进样量20μL，示差折光检测器检测。

酶耦合催化方法：反应在水浴恒温反应器(45℃)中进行，30mL反应液的组成为Gly 20.7mmol/L，3-HPA 20.7mmol/L，NAD⁺2mmol/L，GDH 4.68U/mL，PDOR 4.55U/mL，50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.4)。加入NAD⁺启动反应。按时取样0.5mL，经沸水浴加热10min，10000r/min离心5min，取上清液用高效液相色谱分析反应液组成。

本发明具体实施时，培养基为：

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨，10.0；酵母浸膏，5.0；NaCl，10.0，pH7.0。

种子培养基(g/L)：甘油，20.0；K₂HPO₄，3.4；KH₂PO₄，1.3；(NH₄)₂SO₄，2.0；MgSO₄·7H₂O，0.2；酵母浸膏，1.0；CaCO₃，2.0；FeSO₄·7H₂O，5.0×10^-3；CaCl₂，2.0×10^-3；微量元素A，2.0ml/L。

微量元素A组成(g/L)：ZnCl₂，0.07；MnCl₂·4H₂O，0.1；H₃BO₃，0.06；CoCl₂·6H₂O，0.2；CuCl₂·2H₂O，0.02；NiCl₂·6H₂O，0.025；Na2MoO₄·2H₂O，0.035。

发酵培养基(g/L)：采用第三章培养基优化后条件，即：甘油，30.0；KCl，1.6；NH₄Cl，6.7；CaCl₂·2H₂O，0.28；酵母浸膏，2.8；pH7.0。

分批反应在45℃恒温水浴中进行，反应液的组成为20.7mmol/L甘油，20.7mmol/L 3-HPA，2mmol/L NAD⁺，GDH 4.68U/mL，PDOR4.55U/mL，50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.4)。加入NAD⁺启动反应。240min之后反应，底物和产物浓度几乎不再变化，结果如表1。从表1可看出，分批操作条件下，GDH和PDOR偶合催化反应得率都已接近理论得率1mol/mol，说明辅酶NAD⁺在有氧条件下可有效实现自行再生。以上实验结果表明，在胞外有氧条件下，通过酶催化辅酶再生法，可实现转化甘油、3-HPA制备DHA和1，3-PD。

表1 分批操作条件下GDH和PDOR偶合催化反应结果

作为原料之一的3-羟基丙醛制备：3-羟基丙醛(3-HPA)在化学工业上具有很高的应用价值。它是一种有效的抗菌剂，可作为食品防腐剂或治疗辅助剂。3-HPA还是许多工业有机化合物的前体，如：丙烯酸、丙烯醛、1，3-丙二醇等。目前工业上主要通过环氧乙烷羰基合成或丙烯醛水合法生产3-HPA，但是3-HPA稳定性差，合成后作为中间体随即参与下一步反应，3-HPA纯度低，组分复杂，因此迄今为止还没有商品化的3-HPA纯品。本发明通过克雷伯杆菌利用甘油有氧发酵制备，得到纯度、稳定性较好的3-羟基丙醛。

Claims

1.一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法，其特征在于:包括同时进行的如下两个反应步骤:

一步是以甘油脱氢酶GDH和氧化型辅酶I NAD⁺为催化剂，在胞外有氧条件下，通过酶耦合催化、辅酶再生，由甘油还原生成二羟基丙酮，氧化型辅酶I NAD⁺再生为用于另一步反应的还原型辅酶I NADH；

另一步是以1，3-丙二醇氧化还原酶PDOR和还原型辅酶I NADH为催化剂，在胞外有氧条件下，通过酶耦合催化、辅酶再生，由3-羟基丙醛氧化生成1，3-丙二醇，还原型辅酶I NADH再生为用于一步反应的氧化型辅酶I NAD⁺。

2.如权利要求1所述之一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法，其特征在于:另一步反应原料3-羟基丙醛，是由甘油发酵或化学合成。

3.如权利要求1所述之一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法，其特征在于:

另一步反应原料3-羟基丙醛，是以甘油脱水酶和维生素B₁₂辅酶为催化剂的条件下，由甘油转化而成。

4.如权利要求1所述之一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法，其特征在于:

一步的甘油脱氢酶GDH、另一步的1，3-丙二醇氧化还原酶PDOR来源于微生物。

5.如权利要求3所述之一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法，其特征在于:

另一步反应原料3-羟基丙醛的制备中，甘油脱水酶来源于微生物。

6.如权利要求4或5所述之一种由生物催化转化甘油制备1，3-丙二醇和二羟基丙酮的方法，其特征在于:微生物为肠道细菌中的克雷伯肺炎杆菌属、产气克雷伯菌属、肠细菌属、弗氏柠檬菌、乳杆菌属的短乳杆菌和布氏乳杆菌、梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌和巴氏梭状芽孢杆菌中的任意一种或几种组合。