CN109609426A - 一种以甲醇/甲醛和葡萄糖为共底物生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种以甲醇/甲醛和葡萄糖为共底物成产1,3‑丙二醇的方法。本发明通过在重组大肠杆菌中过表达四种酶：甲醇脱氢酶(MDH)、醛缩酶、2‑氧代脱羧酶和1,3‑丙二醇脱氢酶，构建新型的甲醇和甲醛一碳化合物转化为1,3‑PDO合成途径。用于解决目前甲醇和甲醛等一碳化合物的利用过于依赖核酮糖单磷酸途径(RuMP)及低效率的Ru5P受体再生的问题；避免生产途径中外加辅因子维生素B12或S‑腺苷甲硫氨酸(SAM)的问题，并且缩短1,3‑PDO合成途径，提高1,3‑PDO的产量。

Description

一种以甲醇/甲醛和葡萄糖为共底物生产1,3-丙二醇的方法

技术领域：

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种以甲醇/甲醛和葡萄糖为共底物成产1,3- 丙二醇的方法。

背景技术：

甲醛(Formaldehyde)是一种重要的一碳化合物代谢中间体。甲醇，甲酸和甲烷都可以转化为甲醛，然后进入中心代谢途径，合成生物质用于微生物体的生长以及合成化学品(Bennett et al.2018；Zhang et al.2018；Hwang et al.2018；Pieja et al.2017)。目前的研究发现，主要有三种不同的甲醛利用天然代谢途径，包括：(1)核酮糖单磷酸途径(RuMP，ribulose monophosphate pathway),(2)丝氨酸途径(serine pathway)和(3)卡尔文循环(CBB， Calvin-Benson-Bassham pathway)(Zhang et al.2017；Ludmila 2011；Vorholt 2002)。其中研究最多和最有效的甲醛利用途径是RuMP途径，包括两种关键酶：3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps， 3-hexulose-6-phosphate synthase)，其催化核酮糖-5-磷酸与甲醛的羟醛缩合反应，生成己酮糖 -6-磷酸(Hu6P)，Hu6P通过6-磷酸-3-己糖异构酶(Phi)异构化形成果糖-6-磷酸(F6P)，随后F6P通过戊糖磷酸途径(PPP)再生Ru5P(Nobuo etal.2006；Yurimoto et al.2009)或进入中心代谢途径(例如：EMP途径，ED途径)生成微生物赖以生长的有机化合物(Zhang et al.2017； Whitaker et al.2015)。目前已有文献报道，在工程大肠杆菌中利用RuMP途径来转化甲醇生成有机营养物维持微生物体生长(Mulleret al.2015；Woolston et al.2018；Meyer et al.2018)或生产高附加值化学品(Whitakeret al.2017)。但同样RuMP途径也存在着不足，其中一个不足点，是由于RuMP途径过于依赖Ru5P受体的再生，及低效率的Ru5P受体再生的问题。从而限制了甲醇和甲醛等一碳化合物在微生物体内的利用(He et al.2018)。

1,3-丙二醇(1,3-PDO，1,3-propanediol)是一种无色、无味的黏稠液体，可溶于水、醇、醚等多种有机溶剂，是一种重要的化工原料，在食品、医药、化妆品和有机合成中也有着重要应用(Saxena et al.2009)。此外，1,3-PDO还可以作为单体用以合成聚酯、聚醚、聚氨酯和杂环化合物。近几年的研究表明，以1,3-PDO为单体合成的聚酯(PTT)比以乙二醇为单体合成的聚酯(PET)具有更优良的特性，PTT纤维既具有PET的性能，又具有尼龙的良好的回弹性、抗污染性能和可生物降解特性。因此作为一种具有潜在利用价值的塑料，有可能取代传统的聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)(Bhatia etal.2008)。

1,3-PDO合成早期以化学合成为主，如Degussa公司的丙烯醛法和Shell公司的环氧乙烷法(Knifton et al.2003；Arntz et al.2010)。但化学合成法生产1,3-PDO过程中需要高压、高温的条件并使用昂贵的催化剂等缺点。近年来，随着合成生物学技术的发展，生物法合成 1,3-PDO开始对化学合成法形成激烈的竞争，成为研究的重点。生物法合成1,3-PDO主要有两种途径:(1)通过基因工程菌转化甘油合成1,3-PDO(Zeng et al.2015)。(2)由DuPont和 Genencor公司联合研发的利用重组大肠杆菌将葡萄糖转化为1,3-PDO(CharlesE et al.2003)。但上述二种途径在生产发酵过程中需要加入催化所需的辅因子维生素B12或S-腺苷甲硫氨酸 (SAM,S-Adenosyl-L-methionine)。近年来，对于生物法合成1,3-PDO途径的研究，主要集中于对于上述两种途径的优化。但均存在合成途径较长，难以调控强化，而且1,3-PDO的产量较低的问题。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一种高效、快捷、高产的1,3-丙二醇(1,3-PDO) 生产方法，该方法通过在重组大肠杆菌中过表达四种酶：甲醇脱氢酶(MDH)、醛缩酶、2- 氧代脱羧酶和1,3-丙二醇脱氢酶，构建新型的甲醇和甲醛一碳化合物转化为1,3-PDO合成途径。用于解决目前甲醇和甲醛等一碳化合物的利用过于依赖核酮糖单磷酸途径(RuMP)及低效率的Ru5P受体再生的问题；避免生产途径中外加辅因子维生素B12或S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)的问题，并且缩短1,3-PDO合成途径，提高1,3-PDO的产量。

本发明提供的技术方案之一，是一株基因工程重组菌株，所述重组菌通过在宿主细胞中过表达醛缩酶、2-氧代脱羧酶和1,3-丙二醇脱氢酶所得；

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌还同时过表达甲醇脱氢酶(MDH)；

在本发明的一种实施方式中，所述甲醇脱氢酶(MDH)可以是吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型的或氧化态NAD依赖型的或氧(O₂)依赖型的甲醇脱氢酶；

在本发明的一种实施方式中，所述醛缩酶可以是2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶(KHB)、2- 氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶(KHG)或2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶(YfaU)或其它以丙酮酸作为供体，甲醛为受体的醛缩酶；

在本发明的一种实施方式中，所述2-氧代脱羧酶可以是支链-2-氧代脱羧酶(KDC)或丙酮酸脱羧酶(PDC)；

在本发明的一种实施方式中，所述1,3-丙二醇脱氢酶可以是DhaT基因编码的1,3-丙二醇氧化还原酶或yqhD基因编码的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶或其它还原态 NADH/NADPH依赖型的醇脱氢酶；

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌；

在本发明的一种实施方式中，所述甲醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述醛缩酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述2-氧代脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述1,3-丙二醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述醛缩酶、2-氧代脱羧酶和1,3-丙二醇脱氢酶以质粒 pRSFduet-1为表达载体进行共表达。

在本发明的一种实施方式中，所述甲醇脱氢酶、醛缩酶、2-氧代脱羧酶和1,3-丙二醇脱氢酶以质粒pRSFduet-1为表达载体进行共表达。

本发明所提供的技术方案之二，是上述基因工程重组菌株在生产1,3-丙二醇(1,3-PDO) 中的应用；

在本发明的一种实施方式中，所述应用具体如下：

(1)发酵培养：种子液以0.4-0.6％体积比接种量接种至发酵培养基，37℃，220r/min 培养；待菌体OD₆₀₀达到0.4-0.6时，添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续培养 8-10h。

(2)生物转化：离心收集菌体后用缓冲液重悬，将40-50mL(OD₆₀₀为2.4-2.6)重悬菌体转移到反应容器中，加入终浓度为10g/L的葡萄糖、0.1-0.5mM硫胺素焦磷酸(TPP)、1-10mM Mg₂SO₄；每小时加入0.2mmol的甲醛或2mmol甲醇，转化时间24-30h。

发酵结束后，以甲醛、葡萄糖为底物生产1,3-丙二醇的产量达到3.8-4.0mM；以甲醇、葡萄糖为底物生产1,3-丙二醇的产量达到0.04-0.06mM。

发酵培养基组成(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH 7.0。

有益效果：

本发明通过向宿主菌导入甲醇脱氢酶基因MDH、2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶基因KHB、酮酸脱羧酶基因KDC和1,3-丙二醇氧还原酶基因DhaT，构建新型的1,3-PDO生产途径，实现由甲醇到1,3-PDO的转化。通过利用葡萄糖即作为底物，提供大量的甲醛受体(丙酮酸)，用于解决目前甲醇和甲醛等一碳化合物的利用过于依赖核酮糖单磷酸途径(RuMP)及低效率的Ru5P受体再生的问题,又作为能量来源来维持微生物的生长。并避免生产过程中外加辅因子维生素B12或S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的问题，缩短1,3-PDO合成途径，提高1,3-PDO的产量。

附图说明：

图1：构建新型的由葡萄糖和甲醇/甲醛作为共底物生产1,3-PDO的途径；

图2：体外验证GC色谱图

其中，A为1,3-PDO标准品GC色谱图；B为1,3-PDO产物验证GC色谱图；

图3：1,3-PDO新生物合成途径重组菌株的发酵验证

其中，A为菌株BP3的补料分批发酵曲线-甲醛和葡萄糖作为共底物生产1,3-PDO；

B为菌株BP4的补料分批发酵曲线-甲醇和葡萄糖作为共底物生产1,3-PDO。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所采用的测定方法如下：

(1)生物质浓度(OD)测定：取发酵液在600nm处测定吸光度。

(2)乳酸、乙醇、甲酸盐和乙酸分析测定：

利用配有有机酸分析柱(Aminex HPX-87H，Bio-Rad)和示差折射率检测器的HPLC(LC-2030C，3D，CN)，流动相为5mM H₂SO₄，流速为0.6mL/min，柱温为65℃，检测器温度为35℃(Du et al.2006)。

(3)葡萄糖分析测定：

利用SBA-40E双通道生物传感分析仪(Baisheng，Jinan，China)。

(4)甲醛和2-氧代-4-羟基丁酸钠分析测定：

从反应混合物中取出样品并用去离子水稀释，得到3至50mM的浓度范围。将稀释液(25 μL)与O-苄基羟胺盐酸盐溶液(50μL，130mM储备溶液的吡啶：甲醇：水＝33：15：2)混合。25℃反应10分钟后，将样品用甲醇(500μL)稀释，离心过膜(0.22μm)，利用配有 Shim-packGIST-C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)的HPLC分析。

流动相为：(A)：去离子水(ddH₂0)中加入0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA，trifluoroacetic acid)；(B)：乙腈(CH₃CN)中加入0.095％(v/v)TFA，流速1mL min^-1，在215nm检测，柱温30℃。洗脱条件：梯度洗脱，30min内流动相(B)由8变化80％(Hernandez etal.2017)。

(5)1,3-PDO分析方法：

采用气质连用(GC-MS)方法：将样品(300μL)与苯硼酸(300μL，300mM母液)在室温(25℃)下进行10min反应，离心后，使用色谱/质谱仪(GC/MS QP2020；Shimadzu， Japan)系统配备有Sh-Rxi-5Sil-Ms柱(Shimadzu，Japan)，氦气作为载气。最初柱温箱温度 100℃，保持2min，然后以15℃min^-1的速率升至270℃，并保持12min。

本发明通过在重组大肠杆菌中过表达四种酶：甲醇脱氢酶(MDH)、醛缩酶、2-氧代脱羧酶和1,3-丙二醇脱氢酶，构建新型的甲醇/甲醛一碳化合物转化为1,3-PDO合成途径。用于解决目前甲醇和甲醛等一碳化合物的利用过于依赖核酮糖单磷酸途径(RuMP，ribulose monophosphate pathway)及低效率的Ru5P受体再生的问题。避免生产途径中外加辅因子维生素B12或S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的问题，并且缩短1,3-PDO合成途径，提高1,3-PDO的产量。

在本发明的一种实施方式中，通过将醛缩酶基因、2-氧代脱羧酶基因和1,3-丙二醇脱氢酶基因导入到宿主细胞，构建由甲醛到1,3-PDO生产途径。此代谢途径包括三步酶催化反应： (1)甲醛与微生物体内的丙酮酸在醛缩酶催化下，发生羟醛缩合反应生成2-氧代-4-羟基丁酸(HOBA)；(2)HOBA在2-氧代脱羧酶基因催化下，生成3-羟基丙醛(3-HPA, 3-hydroxypropionaldehyde)和CO₂；(3)1,3-丙二醇脱氢酶催化3-HPA生成1.3-PDO和NAD。(见附图1)

在本发明的一种实施方式中，通过将甲醇脱氢酶基因、醛缩酶基因、2-氧代脱羧酶基因和还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖型的1,3-丙二醇脱氢酶基因导入到重组大肠杆菌，构建由甲醇到1,3-PDO生产途径。此代谢途径包括四步酶催化反应：(1)甲醇脱氢酶催化甲醇氧化生成甲醛和NADH；(2)甲醛与微生物体内的丙酮酸在醛缩酶催化下，发生羟醛缩合反应生成HOBA；(3)HOBA在2-氧代脱羧酶催化下，生成3-羟基丙醛(3-HPA, 3-hydroxypropionaldehyde)和CO₂；(4)1,3-丙二醇脱氢酶催化3-HPA生成1.3-PDO和NAD。(见附图1)

在本发明的一种实施方式中，选用的甲醇脱氢酶MDH根据其电子受体的不同，可以是吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型的甲醇脱氢酶(MDHs)、NAD依赖型的甲醇脱氢酶(MDHs) 或氧(O₂，oxygen)依赖型的醇氧化酶(AOD，alcohol oxidase)。MDH的来源可以是真核及原核甲基营养菌。

在本发明的一种实施方式中，选用的醛缩酶可以是2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶(KHB， 2-keto-4-hydroxybutyrate aldolase)、2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶(KHG， 2-keto-4-hydroxyglutarate aldolase)、2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶(YfaU, 2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)及其它以丙酮酸作为供体，甲醛为受体的醛缩酶。醛缩酶的来源可以是人来源、高等动物来源及细菌来源。

在本发明的一种实施方式中，选用的2-氧代脱羧酶可以是支链-2-氧代脱羧酶(KDC， branched-chain alpha-keto acid decarboxylase)或丙酮酸脱羧化酶(PDC，pyruvate decarboxylase)。2-氧代脱羧酶的来源可以是人来源、高等动物来源、植物来源、真菌及细菌来源。

在本发明的一种实施方式中，选用的1,3-丙二醇脱氢酶可以是DhaT基因编码的NADH 依赖型1,3-丙二醇氧化还原酶或yqhD基因编码的还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(NADPH) 依赖型的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶(nonspecific alcoholoxidoreductase)或其它还原态 NADH/NADPH依赖型的醇脱氢酶。1,3-丙二醇脱氢酶的来源可以是细菌来源。

在本发明的一种实施方式中，选用的宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)或酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)等，优选大肠杆菌，更优选的是大肠杆菌BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，醛缩酶、2-氧代脱羧酶和1,3-丙二醇脱氢酶以质粒pRSFduet-1为表达载体进行共表达。

在本发明的一种实施方式中，甲醇脱氢酶、醛缩酶、2-氧代脱羧酶和1,3-丙二醇脱氢酶以质粒pRSFduet-1为表达载体进行共表达。

在本发明的一种实施方式中，甲醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，醛缩酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，2-氧代脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，1,3-丙二醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，采用本发明所述的重组菌以甲醛和葡萄糖为底物生产 1,3-PDO的方法如下：

(1)发酵培养：据转入质粒的抗性向发酵培养基添加卡那霉素(50μg/mL)，以约0.4-0.6％体积比接种量接种至发酵培养基，37℃，220r/min培养；待菌体OD₆₀₀达到0.4-0.6时，添加 0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续培养8-10h。

(2)生物转化：离心收集菌体后用缓冲液重悬，将集40-50mL(OD₆₀₀为2.4-2.6)重悬菌体转移到250mL空摇瓶中，加入终浓度为10g/L的葡萄糖，0.5-2mM硫胺素焦磷酸(TPP),1-10mM Mg₂SO₄；每小时加入0.2mmol的甲醛，发酵时间24-30h。

发酵培养基组成(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH 7.0。

缓冲液为20mM，pH＝7.0的磷酸钾缓冲液。

发酵结束后，以甲醛、葡萄糖为底物生产1,3-丙二醇的产量达到3.8-4.0mM。

在本发明的一种实施方式中，采用本发明所述的重组菌以甲醇和葡萄糖为底物生产 1,3-PDO的方法如下：

(1)发酵培养：根据转入质粒的抗性向发酵培养基添加卡那霉素(50μg/mL)，以约0.4-0.6％体积比接种量接种至发酵培养基，37℃，220r/min培养；待菌体OD₆₀₀达到0.4-0.6时，添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续培养8-10h。

(2)生物转化：离心收集菌体后用缓冲液重悬，将40-50mL(OD₆₀₀为2.4-2.6)重悬菌体转移到250mL空摇瓶中，加入终浓度为10g/L的葡萄糖，0.5-2mM硫胺素焦磷酸(TPP), 1-10mM Mg₂SO₄；每小时加入2mmol甲醇，发酵时间24-30h。

缓冲液为20mM，pH＝7.0的磷酸钾缓冲液。

发酵培养基组成(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH 7.0。

发酵结束后，以甲醇、葡萄糖为底物生产1,3-丙二醇的产量达到0.04-0.06mM。

以下将通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1筛选和表征合适的醛缩酶用于新型的1,3-PDO生产途径

将不同来源的醛缩酶基因，分别为：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶KHB；来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶 YfaU；来源于鼠(Rattus norvegicus)的2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶RnKHG；来源于人(Homo sapiens)的2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶HsKHG；来源于牛(Bos taurus)的2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶BtKHG，构建到表达载体pET22b上，分别为：pET22b-KHB；pET22b-YfaU； pET22b-RnKHG；pET22b-HsKHG；pET22b-BtKHG。

将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中，37℃培养至OD达到0.5-0.6时，添加0.2mM IPTG诱导基因表达，30℃继续培养10h后收集菌体，超声破碎后取上清备用。

向总体积为0.5mL pH为7.0的PBS缓冲液中加入终浓度为100mM的甲醛，100mM丙酮酸钠，加入50μL破碎上清，30℃下震荡反应5min，测定2-氧代-4-羟基丁酸浓度，计算酶的比活力。经测定KHB比活力最高(1.62±0.11μmol min^-1OD^-1mL^-1)。

实施例2：甲醛到1,3-PDO新生物合成途径的体外验证

将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的KHB编码基因(SEQ ID NO.2)构建到表达载体pET22b上，来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的KDC编码基因(SEQ ID NO.3)构建到表达载体pET22b上，来源于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的DhaT基因(SEQ ID NO.4)构建到表达载体pET22b上。将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中，37℃培养至OD达到0.5-0.6时，添加0.2mM IPTG诱导基因表达，30℃继续培养10h后收集菌体，超声破碎后取上清备用。

向总体积为1mL pH为7.0的PBS缓冲液中加入终浓度为10mM的甲醛，10mM丙酮酸钠，20mM NADH，1mM硫胺素焦磷酸(TPP)，加入上述KHB、KDC及DhaT破菌液各300μL、100μL及200μL，30℃下震荡反应12h，检测其1,3-PDO浓度，计算收率。反应结束后，1,3-PDO浓度为1.3mM，收率为13.0％，检测结果如图2。这证明了确实可以通过附图1所示的新途径将甲醛转化为1,3-PDO。

实施例3：甲醛到1,3-PDO新生物合成途径重组菌株的构建

利用试剂盒In-fusion HD Cloning Kit(Clontech Laboratories,Inc,US)构建质粒 pRSFduet-1-KHB-KDC-DhaT：首先将质粒载体pRSFduet-1和KDC编码基因(SEQ IDNO.3) 通过NdeI、NcoI限制性内切酶进行双酶切，酶连得到pRSFduet-1-KDC。后利用引物KHB-F 和KHB-R PCR扩增KHB编码基因(SEQ ID NO.2)，利用引物DhaT-F和DhaT-R PCR扩增DhaT基因(SEQ ID NO.4)。PCR扩增pRSFduet-1-KDC质粒，引物分别为pRSFduet-1-KDC-F 和pRSFduet-1-KDC-R，将各片段用In-fusion试剂盒连接，新合成的质粒命名为 pRSFduet-1-KHB-KDC-DhaT。(引物参见表3)

将带有2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶(KHB)、支链-2-氧代脱羧酶基因(KDC)和1,3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)基因的质粒pRSFduet-1-KHB-KDC-DhaT转化到E.coli BL21(DE3) 中，获得实验组菌株记为BP3，带有卡那霉素抗性。

表3

实施例4：甲醇到1,3-PDO新生物合成途径重组菌株的构建

利用试剂盒In-fusion HD Cloning Kit(Clontech Laboratories,Inc,US)构建质粒 pRSFduet-1-KHB-MDH-KDC-DhaT：利用引物MDH-F和MDH-R PCR扩增来源于芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)的MDH基因(SEQ ID NO.1),引物pRSFduet-1-KHB-KDC-DhaT-F和pRSFduet-1-KHB-KDC-DhaT-R PCR扩增pRSFduet-1-KHB-KDC-DhaT质粒，将各片段用 In-fusion试剂盒连接，该新合成的质粒命名为pRSFduet-1-KHB-MDH-KDC-DhaT。(引物参见表3)

将带有甲醇脱氢酶基因(MDH)、2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶(KHB)、支链-2-氧代脱羧酶基因(KDC)和1,3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)基因的质粒 pRSFduet-1-KHB-MDH2-KDC-DhaT转化到E.coli BL21(DE3)中，获得实验组菌株记为BP4，带有卡那霉素抗性。

实施例5：甲醛到1,3-PDO新生物合成途径重组菌株的发酵验证

将菌株BP3经种子培养后进行发酵培养，向发酵培养基添加卡那霉素(50μg/mL)，以约 0.5％体积比接种量将种子液接种至发酵培养基，37℃，220r/min培养；待菌体OD达到0.5 时，添加0.1mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续培养8h。

发酵培养基组成(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH 7.0。

离心收集菌体后用20mM，pH＝7.0的磷酸钾缓冲液重悬，将40mL(OD₆₀₀为2.4-2.6)重悬菌体转移到250mL空摇瓶中，加入终浓度为10g/L的葡萄糖，0.1mM硫胺素焦磷酸(TPP),3mM Mg₂SO₄；每小时加入0.2mmol的甲醛，发酵时间27h。结果显示(见图3)，导入新合成途径的菌株BP3的1,3-PDO产量可达3.92±0.15mM,较Chen et al.(2015)报道的 1,3-PDO合成途径,1,3-PDO产量提高了485％，同等条件下宿主菌1,3-PDO未能检出。

实施例6：甲醇到1,3-PDO新生物合成途径重组菌株的发酵验证

将菌株BP4经种子培养后进行发酵培养，向发酵培养基添加卡那霉素(50μg/mL)，以约 0.4％体积比接种量将种子液接种至发酵培养基，37℃，220r/min培养；待菌体OD₆₀₀达到 0.5时，添加0.1mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续培养8h；

发酵培养基组成(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH 7.0。

离心收集菌体后用20mM，pH＝7.0的磷酸钾缓冲液重悬，将50mL(OD₆₀₀为2.4-2.6)重悬菌体转移到250mL空摇瓶中，加入终浓度为10g/L的葡萄糖，0.1mM硫胺素焦磷酸(TPP),5mM Mg₂SO₄；每小时加入2mmol甲醇，发酵时间27h。结果显示(见图3)，导入新合成途径的菌株BP4的1,3-PDO产量可达0.05mM，产量见下表，同等条件下宿主菌 1,3-PDO未能检出：

虽然本发明已以较佳实施公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种以甲醇/甲醛和葡萄糖为共底物生产1,3-丙二醇的方法

<130> 1

<141> 2019-01-04

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)

<400> 1

atgaaaaaca cccagtctgc tttctacatg ccgtctgtta acctgttcgg tgctggttct 60

gttaacgaag ttggtacccg tctggctggt ctgggtgtta aaaaagctct gctggttacc 120

gacgctggtc tgcactctct gggtctgtct gaaaaaatcg ctggtatcat ccgtgaagct 180

ggtgttgaag ttgctatctt cccgaaagct gaaccgaacc cgaccgacaa aaacgttgct 240

gaaggtctgg aagcttacaa cgctgaaaac tgcgactcta tcgttaccct gggtggtggt 300

tcttctcacg acgctggtaa agctatcgct ctggttgctg ctaacggtgg taccatccac 360

gactacgaag gtgttgacgt ttctaaaaaa ccgatggttc cgctgatcgc tatcaacacc 420

accgctggta ccggttctga actgaccaaa ttcaccatca tcaccgacac cgaacgtaaa 480

gttaaaatgg ctatcgttga caaacacgtt accccgaccc tgtctatcaa cgacccggaa 540

ctgatggttg gtatgccgcc gtctctgacc gctgctaccg gtctggacgc tctgacccac 600

gctatcgaag cttacgtttc taccggtgct accccgatca ccgacgctct ggctatccag 660

gctatcaaaa tcatctctaa atacctgccg cgtgctgttg ctaacggtaa agacatcgaa 720

gctcgtgaac agatggcttt cgctcagtct ctggctggta tggctttcaa caacgctggt 780

ctgggttacg ttcacgctat cgctcaccag ctgggtggtt tctacaactt cccgcacggt 840

gtttgcaacg ctatcctgct gccgcacgtt tgccgtttca acctgatctc taaagttgaa 900

cgttacgctg aaatcgctgc tttcctgggt gaaaacgttg acggtctgtc tacctacgaa 960

gctgctgaaa aagctatcaa agctatcgaa cgtatggctc gtgacctgaa catcccgaaa 1020

ggtttcaaag aactgggtgc taaagaagaa gacatcgaaa ccctggctaa aaacgctatg 1080

aacgacgctt gcgctctgac caacccgcgt aaaccgaaac tggaagaagt tatccagatc 1140

atcaaaaacg ctatg 1155

<210> 2

<211> 639

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

atgaaaaact ggaaaacaag tgcagaatca atcctgacca ccggcccggt tgtaccggtt 60

atcgtggtaa aaaaactgga acacgcggtg ccgatggcaa aagcgttggt tgctggtggg 120

gtgcgcgttc tggaagtgac tctgcgtacc gagtgtgcag ttgacgctat ccgtgctatc 180

gccaaagaag tgcctgaagc gattgtgggt gccggtacgg tgctgaatcc acagcagctg 240

gcagaagtca ctgaagcggg tgcacagttc gcaattagcc cgggtctgac cgagccgctg 300

ctgaaagctg ctaccgaagg gactattcct ctgattccgg ggatcagcac tgtttccgaa 360

ctgatgctgg gtatggacta cggtttgaaa gagttcaaat tcttcccggc tgaagctaac 420

ggcggcgtga aagccctgca ggcgatcgcg ggtccgttct cccaggtccg tttctgcccg 480

acgggtggta tttctccggc taactaccgt gactacctgg cgctgaaaag cgtgctgtgc 540

atcggtggtt cctggctggt tccggcagat gcgctggaag cgggcgatta cgaccgcatt 600

actaagctgg cgcgtgaagc tgtagaaggc gctaagctg 639

<210> 3

<211> 1643

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

<400> 3

atgtacaccg ttggtgacta cctgctggac cgtctgcacg aactgggtat cgaagaaatc 60

ttcggtgttc cgggtgacta caacctgcaa ttcctggacc agatcatctc tcgtgaagac 120

atgaaatgga tcggtaacgc taacgaactg aacgcttctt acatggctga cggttacgct 180

cgtaccaaaa aagctgctgc tttcctgacc accttcggtg ttggtgaact gtctgctatc 240

aacggtctgg ctggttctta cgctgaaaac ctgccggttg ttgaaatcgt tggttctccg 300

acctctaaag ttcagaacga cggtaaattc gttcaccaca ccctggctga cggtgacttc 360

aaacacttca tgaaaatgca cgaaccggtt accgctgctc gtaccctgct gaccgctgaa 420

aacgctacct acgaaatcga ccgtgttctg tctcaactgc tgaaagaacg taaaccggtt 480

tacatcaacc tgccggttga cgttgctgct gctaaagctg aaaaaccggc tctgtctctg 540

gaaaaagaat cttctaccac caacaccacc gaacaggtta tcctgtctaa aatcgaagaa 600

tctctgaaaa acgctcaaaa accggttgtt atcgctggtc acgaagttat ctctttcggt 660

ctggaaaaaa ccgttaccca gttcgtttct gaaaccaaac tgccgatcac caccctgaac 720

ttcggtaaat ctgctgttga cgaatctctg ccgtctttcc tgggtatcta caacggtaaa 780

ctgtctgaaa tctctctgaa aaacttcgtt gaatctgctg acttcatcct gatgctgggt 840

gttaaactga ccgactcttc taccggtgct ttcacccacc acctggacga aaacaaaatg 900

atctctctga acatcgacga aggtatcatc ttcaacaaag ttgttgaaga cttcgacttc 960

cgtgctgttg tttcttctct gtctgaactg aaaggtatcg aatacgaagg tcagtacatc 1020

gacaaacagt acgaagaatt tatcccgtct tctgctccgc tgtctcaaga ccgtctgtgg 1080

caggctgttg aatctctgac ccagtctaac gaaaccatcg ttgctgaaca gggtacctct 1140

ttcttcggtg cttctaccat cttcctgaaa tctaactctc gtttcatcgg tcagccgctg 1200

tggggttcta tcggttacac cttcccggct gctctgggtt ctcaaatcgc tgacaaagaa 1260

tctcgtcacc tgctgttcat cggtgacggt tctctgcaac tgaccgttca ggaactgggt 1320

ctgtctatcc gtgaaaaact gaacccgatc tgcttcatca tcaacaacga cggttacacc 1380

gttgaacgtg aaatccacgg tccgacccag tcttacaacg acatcccgat gtggaactac 1440

tctaaactgc cggaaacctt cggtgctacc gaagaccgtg ttgtttctaa aatcgttcgt 1500

accgagaacg agttcgtgag cgttatgaaa gaagctcaag ctgacgttaa ccgtatgtac 1560

tggatcgaac tggttctgga aaaagaagac gctccgaaac tgctgaaaaa aatgggtaaa 1620

ctgttcgctg aacagaacaa ata 1643

<210> 4

<211> 1161

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 4

atgtcttacc gtatgttcga ctacctggtt ccgaacgtta acttcttcgg tccgaacgct 60

atctctgttg ttggtgaacg ttgccagctg ctgggtggta aaaaagctct gctggttacc 120

gacaaaggtc tgcgtgctat caaagacggt gctgttgaca aaaccctgca ctacctgcgt 180

gaagctggta tcgaagttgc tatcttcgac ggtgttgaac cgaacccgaa agacaccaac 240

gttcgtgacg gtctggctgt tttccgtcgt gaacagtgcg acatcatcgt taccgttggt 300

ggtggttctc cgcacgactg cggtaaaggt atcggtatcg ctgctaccca cgaaggtgac 360

ctgtaccagt acgctggtat cgaaaccctg accaacccgc tgccgccgat cgttgctgtt 420

aacaccaccg ctggtaccgc ttctgaagtt acccgtcact gcgttctgac caacaccgaa 480

accaaagtta aattcgttat cgtttcttgg cgtaacctgc cgtctgtttc tatcaacgac 540

ccgctgctga tgatcggtaa accggctgct ctgaccgctg ctaccggtat ggacgctctg 600

acccacgctg ttgaagctta catctctaaa gacgctaacc cggttaccga cgctgctgct 660

atgcaggcta tccgtctgat cgctcgtaac ctgcgtcagg ctgttgctct gggttctaac 720

ctgcaggctc gtgaatacat ggcttacgct tctctgctgg ctggtatggc tttcaacaac 780

gctaacctgg gttacgttca cgctatggct caccagctgg gtggtctgta cgacatgccg 840

cacggtgttg ctaacgctgt tctgctgccg cacgttgctc gttacaacct gatcgctaac 900

ccggaaaaat tcgctgacat cgctgaactg atgggtgaaa acatcaccgg tctgtctacc 960

ctggacgctg ctgaaaaagc tatcgctgct atcacccgtc tgtctatgga catcggtatc 1020

ccgcagcacc tgcgtgacct gggtgttaaa gaaaccgact tcccgtacat ggctgaaatg 1080

gctctgaaag acggtaacgc tttctctaac ccgcgtaaag gtaacgaaca ggaaatcgct 1140

gctatcttcc gtcaggcttt c 1161

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ttaactttaa taaggagata taccaaggat gaaaaactgg aaaacaagtg cag 53

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gagctcgaat tcggatcctt acagcttagc gccttctaca gc 42

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ttaactttaa taaggagata taccaaggat gtcttaccgt atgttcgact ac 52

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ttctttacca gactcgagtt agaaagcctg acggaagata gcag 44

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ggatccgaat tcgagctcgg 20

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tctccttatt aaagttaaac aaaattattt ctac 34

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ttaactttaa taaggagata taccaaggat gaaaaacacc cagtctgctt tc 52

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gagctcgaat tcggatcctt acatagcgtt tttgatgatc tggataac 48

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ggatccgaat tcgagctcgg 20

<210> 14

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

tctccttatt aaagttaaac aaaattattt ctacaggtta cagcttagcg ccttctacag 60

c 61

Claims (10)

1.一种基因工程重组菌株，其特征在于，所述重组菌通过在宿主细胞中过表达醛缩酶、2-氧代脱羧酶和1,3-丙二醇脱氢酶所得；所述醛缩酶是以丙酮酸作为供体，甲醛为受体的醛缩酶。

2.如权利要求1所述的一种基因工程重组菌株，其特征在于，所述重组菌还同时过表达甲醇脱氢酶。

3.如权利要求2所述的一种基因工程重组菌株，其特征在于，所述甲醇脱氢酶为吡咯喹啉醌依赖型的或氧化态NAD依赖型的或氧依赖型的甲醇脱氢酶。

4.如权利要求3所述的一种基因工程重组菌株，其特征在于，所述甲醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求1或2所述的一种基因工程重组菌株，其特征在于，所述醛缩酶为2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶、2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶或2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶；

所述2-氧代脱羧酶为支链-2-氧代脱羧酶或丙酮酸脱羧化酶。

所述1,3-丙二醇脱氢酶是DhaT基因编码的1,3-丙二醇氧化还原酶或yqhD基因编码的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶或其它还原态NADH/NADPH依赖型的醇脱氢酶。

6.如权利要求5所述的一种基因工程重组菌株，其特征在于，所述醛缩酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述2-氧代脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述1,3-丙二醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.如权利要求1或2所述的一种基因工程重组菌株，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌或酿酒酵母；

所述重组菌采用质粒pRSFduet-1为表达载体。

8.权利要求1或2所述基因工程重组菌株在生产1,3-丙二醇中的应用。

9.如权利要8所述的应用，其特征在于，采用权利要求1所述的菌株发酵生产1,3-丙二醇时，将菌体经发酵培养后，收集菌体重悬后将40-50mL OD₆₀₀为2.4-2.6的菌体转移到反应容器中，加入终浓度为10g/L的葡萄糖，0.1-0.5mM硫胺素焦磷酸,1-10mM Mg₂SO₄；每小时加入0.2mmol的甲醛，转化时间24-30h。

10.如权利要8所述的应用，其特征在于，采用权利要求2所述的菌株发酵生产1,3-丙二醇时，将菌体经发酵培养后，收集菌体重悬后将40-50mL OD₆₀₀为2.4-2.6的菌体转移到反应容器中，加入终浓度为10g/L的葡萄糖，0.1-0.5mM硫胺素焦磷酸,1-10mM Mg₂SO₄；每小时加入2mmol甲醇，转化时间24-30h。