MX2011006745A - Procedimiento para produccion sin celulas de compuestos quimicos. - Google Patents

Abstract

Se describe un procedimiento enzimático para la producción de compuestos químicos a partir de fuentes de carbono. En particular, de acuerdo con un aspecto, se desvela un procedimiento para la producción de un compuesto orgánico diana a partir de una fuente de carbono por un sistema enzimático sin células.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCCIÓN SIN CÉLULAS DE COMPUESTOS QUÍMICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Se describe un procedimiento enzimático para la producción de compuestos químicos a partir de fuentes de carbono. En particular, de acuerdo con un aspecto, se desvela un procedimiento para la producción de un compuesto orgánico diana a partir de una fuente de carbono por un sistema enzimático sin células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La invención se dirige a un procedimiento para la bioconversión de una fuente de carbono, que es preferentemente un carbohidrato u otro compuesto que contiene carbono en un compuesto orgánico diana por un procedimiento enzimático, preferentemente en ausencia de células vivas productoras. El compuesto orgánico diana es preferentemente un compuesto químico hidrófobo, hidrófilo o intermedio.

Los compuestos químicos hidrófobos de acuerdo con la invención comprenden, sin limitación, alcoholes C4, tales como n-butanol, 2-butanol e isobutanol y otros compuestos químicos que tienen una miscibilidad limitada con agua. Miscibilidad limitada significa que a temperatura ambiente no más del 20 % (p/p) puede mezclarse con agua sin separación de fases. Los compuestos químicos hidrófilos e intermedios de acuerdo con la invención comprenden, sin limitación, etanol y otros compuestos químicos. n-Butanol es un líquido neutro incoloro de volatilidad media con miscibilidad restringida (aproximadamente el 7-8 % a TA) en agua. n-Butanol se usa como un intermedio en la producción de compuestos químicos, como un disolvente y como un ingrediente en productos formulados tales como cosméticos. n-Butanol se usa en la síntesis de ésteres de acrilato/metacrilato, glicol éteres, acetato de n-butilo, resinas amínicas y n-butilaminas. n-Butanol también puede usarse como un combustible en motores de combustión debido a su baja presión de vapor, alto contenido energético y la posibilidad de mezclarse con gasolina a altas concentraciones. 2-Butanol es un líquido neutro incoloro de volatilidad media con miscibilidad restringida (aproximadamente del 12 % a TA) en agua. El 2-butanol se usa como un disolvente para pinturas y revestimientos así como ingredientes alimentarios o en la producción de 1-buteno.

Isobutanol es un líquido neutro incoloro de volatilidad media con miscibilidad restringida (aproximadamente del 9-10 % a TA) en agua. Isobutanol se usa como disolvente o como plastificante. También se usa en la producción de isobuteno que es un precursor para la producción de MTBE o ETBE.

Puede producirse n-Butanol usando Clostridium solventogénico, tal como C. acetobuylicum o C. beijerinckii, que producen típicamente una mezcla de n-butanol, acetona y etanol. La producción de butanol usando clostridium solventogénico tiene varias desventajas: (i) El aislamiento del producto a partir de la solución acuosa diluida es muy caro puesto que es elaborado (por ejemplo usando procedimientos de membrana) o consume energía (por ejemplo usando destilación), (ii) El rendimiento es bajo puesto que partes significativas del sustrato se usan en la formación de productos secundarios tales como acetona, etanol, hidrógeno y biomasa. (iii) La productividad de la producción de butanol es baja debido a titulaciones celulares limitadas, (iv) El metabolismo complejo limita la modificación por ingeniería genética metabólica para mayor productividad y rendimiento, (v) La estabilidad de procedimiento limitada con frecuencia conduce a pérdidas de producción y es difícil mantener la esterilidad, (vi) La naturaleza bifásica del crecimiento clostridial limita la flexibilidad y productividad del procedimiento.

Existen varios enfoques para superar las limitaciones de producción de butanol fermentativa clásica. Por ejemplo, el documento WO2008/052596 describe la modificación recombinante de clostridium para un rendimiento mejorado. La selección o modificación por ingeniería genética de variantes para una resistencia a Butanol mayor se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/006038.

La producción sin células de compuestos químicos se ha mostrado desde 1897 cuando Eduard Buchner usó un lisado de células de levadura para convertir glucosa a etanol. Posteriormente Welch y Scopes, 1985 demostraron la producción sin células de etanol, un procedimiento que, sin embargo, técnicamente no era muy útil. El sistema carecía de especificidad (reacción secundaria de las enzimas, actividades no deseadas en el lisado) y se obtuvo un máximo del 9 % de etanol.

Se han descrito varios procedimientos técnicos que usan enzimas aisladas para la producción de compuestos químicos. Por ejemplo, se usan alcohol deshidrogenasas en la producción de alcoholes quirales a partir de cetonas. Tales procedimientos requieren regeneración de cofactor (NAD) que pueden conseguirse, por ejemplo, añadiendo glucosa y glucosa deshidrogenasa. Tales procedimientos se han diseñado para producir compuestos químicos de alto valor pero no para proporcionar un sistema enzimático que comprende reacciones enzimáticas múltiples que conviertan carbohidratos a compuestos químicos con alta eficacia de carbono y energía.

Zhang y col., 2008 describe la idea para conversión enzimática sin células de glucosa a n-butanol. El concepto incluye un mínimo de 18 enzimas, varios cofactores diferentes y coenzimas (por ejemplo, ATP, ADP, NADH, NAD, ferredoxina y coenzima A). Además el procedimiento postulado da como resultado una producción neta de ATP de modo que requiere además una enzima ATPasa para retirar el ATP. En términos prácticos el control de la adición de ATPasa manteniendo a la vez un nivel de ATP equilibrado es muy difícil de conseguir. En resumen, el procedimiento descrito sería caro, técnicamente inestable y proporcionaría solamente bajos rendimientos de butanol.

En resumen existe una necesidad de un procedimiento eficaz en costes para la producción de compuestos químicos a partir de fuentes renovables, en particular etanol y alcoholes C4 tales como n-butanol y sus isómeros.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto, la presente invención aborda esta necesidad a través de un sistema enzimático sin células, usando solamente un número limitado de enzimas y un conjunto limitado de cofactores. En particular, de acuerdo con un aspecto preferido, el procedimiento de la invención no conduce a producción de ATP neta y/o no usa reacciones enzimáticas fosforilantes y/o solamente usa enzimas que soportan la presencia inactivadora de los compuestos químicos producidos.

Definiciones Un compuesto químico hidrófobo es un compuesto químico que es solamente parcialmente soluble en agua y que reside en el estado sólido o líquido a temperatura y presión ambientes. Los compuestos químicos hidrófobos tienen una miscibilidad limitada con agua de no más del 20 % (p/p) sin separación de fases. Los ejemplos particulares de compuestos químicos hidrófobos de acuerdo con la presente invención incluyen n-butanol, 2-butanol e isobutanol.

La fuente de carbono puede ser cualquier material que puedan usar por microorganismos para el crecimiento o la producción de compuestos químicos. Estas incluyen carbohidratos y derivados: poliosas tales como celulosa, hemicelulosa, almidón; biosas tales corrió sacarosa, maltosa, lactosa; hexosas tales como glucosa, mañosa, galactosa; pentosas tales como xilosa, arabinosa; ácidos urónicos, glucosaminas, etc.; polioles tales como sorbitol, glicerol; lípidos y derivados, lignina y derivados. Son fuentes de carbono particularmente preferidas glucosa, un oligómero o polímero que contiene glucosa, una hexosa monomérica no glucosa o un derivado de azúcar polimérico o mezclas de los mismos.

La presente invención se refiere a un procedimiento sin células para la producción biotecnológica de compuestos químicos a partir de fuentes de carbono, en particular de compuestos químicos hidrófobos tales como alcoholes C4 incluyendo n-butanol, isobutanol o 2-butanol y de compuestos químicos hidrófilos e intermedios tales como etanol.

De acuerdo con un aspecto preferido, la invención desvela y reivindica la producción de un compuesto orgánico diana a partir de una fuente de carbono por un sistema enzimático sin células, que comprende la conversión de glucosa a piruvato como un producto intermedio en el que no sucede producción neta de ATP. Preferentemente, no sucede producción neta de ATP en la conversión de glucosa a piruvato como un producto intermedio. Más preferentemente, no sucede producción neta de ATP en la conversión global de la fuente de carbono al compuesto orgánico diana.

De acuerdo con un aspecto preferido, el compuesto fuente de carbono es glucosa, un oligómero o polímero que contiene glucosa, una hexosa monomérica no glucosa o un derivado de azúcar polimérico.

De acuerdo con un aspecto preferido adicional, el compuesto orgánico diana es etanol, un mono-alcohol de cuatro carbonos, en particular n-butanol, isobutanol, 2-butanol u otro compuesto orgánico derivable de piruvato, preferentemente por una ruta enzimática.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la conversión de glucosa a piruvato como un producto intermedio funciona completamente sin ATP y/o ADP, como cofactores. Más preferentemente, la conversión global de la fuente de carbono al compuesto orgánico diana (la ruta de reacción) funciona completamente sin ATP y/o ADP como cofactores.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, el procedimiento de producción se realiza en un sistema líquido que comprende dos fases separadas y el compuesto orgánico diana está presente principalmente en, o forma, una de las fases separadas y el compuesto orgánico diana se recoge de la fase separada.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, se añade un disolvente orgánico para establecer las dos fases separadas.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, el compuesto o fuente de carbono se introduce continuamente en el procedimiento y el compuesto orgánico diana se retira continuamente.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, el sistema enzimático comprende las siguientes enzimas o actividades enzimáticas, preferentemente para la conversión de glucosa a piruvato: glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.47), gluconolactonasa (EC 3.1.1.17), gluconato deshidratasa (EC 4.2.1.39), · 2-ceto-3-desoxi gluconato aldolasa (EC 4.1.2.14), aldehido deshidrogenasa (EC 1.2.1.3), glicerato deshidrogenasa (EC 1.1.1.29) o Hidroxipiruvato reductasa (EC 1.1.1.81), serina-piruvato transaminasa (EC 2.6.1.51 ), · L-serina amoniaco-liasa (EC 4.3.1.17) y alanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.1 ).

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, el sistema enzimático comprende las siguientes enzimas o actividades enzimáticas, preferentemente para la conversión de glucosa a piruvato: glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.47), gluconolactonasa (EC 3.1.1.17), gluconato deshidratasa (EC 4.2.1.39) 2-ceto-3-desoxi gluconato aldolasa (EC 4.1.2.14) • aldehido deshidrogenasa (EC 1.2.1.3) y glicerato deshidratasa (EC 4.2.1.).

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, se produce etanol a partir de glucosa por un sistema enzimático que comprende 11 , 10, 9, 8, 7 o menos enzimas.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, n-butanol se produce a partir de glucosa por un sistema enzimático que comprende 17, 16, 15 o menos enzimas.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, se produce iso-butanol por un sistema enzimático que comprende 14, 13 o menos enzimas.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención y como se describe adicionalmente en el presente documento, 2-butanol se produce por un sistema enzimático que comprende 13 o menos enzimas.

De acuerdo con un aspecto preferido, el procedimiento de producción de la invención comprende las siguientes 4 etapas: I. Producción de enzimas (las "enzimas diana") para la conversión de una fuente de carbono en un compuesto químico (también denominado en el presente documento "compuesto químico diana" o "compuesto orgánico diana" ) usando células microbianas; II. Liberación de las enzimas diana de las células microbianas usadas en la etapa I, preferentemente combinada con liberación de cofactores y con inactivación de actividades enzimáticas no diana adicionales; III. Poner las enzimas diana de la etapa II en contacto con la fuente de carbono en condiciones adecuadas para la conversión de la fuente de carbono en el compuesto químico diana; IV. Separar el compuesto químico diana de la mezcla de reacción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra adicionalmente una posible implementación del concepto de la invención de acuerdo con una realización preferida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Etapa I: En la etapa I se producen las enzimas diana usando células microbianas.

En una realización de la invención, la producción enzimática se realiza en dos o más líneas celulares microbianas diferentes, de modo que la ruta de producción completa o partes principales de ella no se reconstituyen en un microorganismo. Esto evita el inicio no deseado de conversión de sustrato hacia el compuesto químico y conduce a una producción enzimática más eficaz. La producción enzimática puede ser intracelular o extracelular, recombinante o no recombinante. Si la producción enzimática es recombinantes, esta puede ser homologa o heteróloga.

En una realización adicional de la invención, las enzimas diana son selectivas para un sustrato y una reacción. Preferentemente, las enzimas diana tienen una selectividad de sustrato (kcat/kM) de al menos 10 veces en comparación con cualquier otra sustancia presente de manera natural y una selectividad de reacción de al menos el 90 %. Más preferentemente, las enzimas diana tienen una selectividad de sustrato de al menos 20 veces y una selectividad de reacción de al menos el 95 %. Incluso más preferentemente las enzimas diana tienen una selectividad de sustrato de al menos 100 veces y una selectividad de reacción de al menos el 99 %.

En una realización adicional de la invención, las enzimas diana muestran inhibición baja o nula por el sustrato o el producto u otros intermedios de la reacción multietapa (inhibición de la retroalimentación baja o nula). Preferentemente, las constantes de inhibición (K¡) para cualquier sustrato, producto o intermedio de la reacción multietapa son al menos 10 veces mayores que el valor de KM para la enzima y sustrato respectivos. Más preferentemente, tales constantes de inhibición son 100 veces mayores que la KM respectiva. En una realización adicional particularmente preferida las enzimas diana aún tienen 50 % de su actividad máxima a concentraciones de cualquier sustrato, intermedio o producto en la reacción multietapa de 100 mM o más.

Preferentemente, las enzimas diana tienen valores de t y KM que se ajustan a la naturaleza multietapa de la ruta enzimática.

De acuerdo con una realización del procedimiento de la invención, las enzimas diana toleran niveles elevados del compuesto químico diana y, opcionalmente, otros disolventes orgánicos que se añaden opcionalmente para apoyar la segregación del compuesto químico diana en una fase separada. Preferentemente las enzimas diana toleran concentraciones del compuesto químico diana de más del 2 % en peso, más preferentemente más del 6 % en peso y más preferentemente más del 12 % en peso. En una realización particularmente preferida, las enzimas diana toleran concentraciones de los compuestos químicos diana hasta el máximo de solubilidad en agua.

En una realización preferida de la invención, las enzimas diana toleran niveles elevados de sustancias caotrópicas y temperaturas elevadas. Preferentemente, las enzimas diana toleran concentraciones de cloruro de guanidinio de más de 1 M, más preferentemente más de 3 M y más preferentemente más de 6 M. Como alternativa o en combinación, las enzimas diana toleran preferentemente temperaturas de más de 50 °C, más preferentemente más de 70 °C y más preferentemente más de 90 °C. En tales realizaciones preferidas, la producción de enzima diana se realiza en un organismo huésped cuyas actividades enzimáticas endógenas se inactivan principalmente a niveles elevados de sustancias caotrópicas y/o a temperaturas elevadas. Preferentemente la producción de enzima diana se realiza usando las siguientes especies microbianas: Escherichia coli; Pseudomonas fluorescence; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae; Pichia pastoris; Hansenula polymorpha; Klyuveromyces lactis; Trichoderma reesei; Aspergillus niger. Más preferentemente la producción de enzima diana se realiza usando Escherichia coli como organismo huésped.

En una realización preferida adicional de la invención, las enzimas diana toleran niveles elevados de oxigeno. Preferentemente, las enzimas diana toleran concentraciones de oxígeno de más de 1 ppm, más preferentemente más de 7 ppm. Más preferentemente las enzimas diana son activas y estables en condiciones aeróbicas. Preferentemente, la reacción multietapa no requiere oxígeno y no se inhibe por oxígeno. Por lo tanto, no deben tomarse precauciones especiales para exclusión de oxígeno haciendo el procedimiento más estable con menos esfuerzo en el equipamiento y/o ambiente de producción.

Preferentemente, la producción de enzimas y el crecimiento celular se separan en fases separadas. Por lo tanto, no se usa sustrato para la actividad metabólica general.

Etapa II: En la etapa II las enzimas diana se liberan de las células.

En una realización preferida, las enzimas diana toleran temperaturas altas y condiciones caotrópicas, mientras que las enzimas de fondo del microorganismo productor no toleran estas condiciones. De acuerdo con esta realización, las enzimas diana se producen de forma intracelular en células microbianas, las células se lisan usando alta temperatura y/o condiciones caotrópicas, liberando de este modo las enzimas diana en forma activa, opcionalmente junto con cofactores mientras que se inactivan las actividades enzimáticas de fondo no deseadas.

En otra realización preferida, la producción enzimática es extracelular, las enzimas diana toleran altas temperaturas y condiciones caotrópicas y las actividades enzimáticas de fondo (enzimas no diana) no toleran estas condiciones. De acuerdo con esta realización, el sobrenadante de la producción extracelular se trata en condiciones tales como altas temperaturas y/o condiciones caotrópicas. Esto conduce a inactivación de actividades enzimáticas de fondo no deseadas (enzimas no diana) mientras que las enzimas diana permanecen activas.

En una realización de la invención, se requieren cofactores para una o más de las múltiples etapas de conversión enzimática. En un aspecto de la invención tales cofactores se añaden a la mezcla de enzima. En otro aspecto particularmente preferido de esta realización tales cofactores también los producen las células microbianas de forma intracelular y se liberan por el mismo tratamiento por el que se liberan las enzimas diana. En otra realización preferida de la invención, las células microbianas se obtienen por ingeniería genética para optimizar los niveles de cofactores producidos.

Preferentemente, las células microbianas se inactivan durante la etapa II. Por lo tanto, el crecimiento celular y la actividad enzimática se separan en el procedimiento y no se consume fuente de carbono por crecimiento celular no deseado.

Etapa III: En la etapa III la fuente de carbono se convierte por una mezcla de enzimas en una reacción enzimática multietapa al compuesto químico diana.

De acuerdo con el procedimiento de la invención, las enzimas están activas bajo la actividad desnaturalizante del compuesto químico diana. Preferentemente, las células microbianas usadas en la etapa I son inactivas y/o se inactivan durante las condiciones de reacción de la etapa III.

Preferentemente, la concentración de cada enzima en la mezcla de enzima diana se ajusta al nivel óptimo en condiciones del procedimiento. En una realización particularmente preferida una o más concentraciones de enzima se aumentan por encima de las concentraciones intracelulares típicas para mejorar el rendimiento del procedimiento (sin límite por la densidad máxima de los microorganismos como en los procedimientos clásicos). En otra realización particularmente preferida, se obtienen por ingeniería genética una o más enzimas para eficacia catalítica máxima (que conduce a menor tamaño del reactor y costes de ejecución en comparación con los procedimientos clásicos).

En una realización preferida adicional, el compuesto químico diana se añade a la mezcla de reacción en la etapa Ill a una concentración justo por encima del nivel máximo que puede mezclarse en una fase sencilla con agua en condiciones del procedimiento. De acuerdo con esta realización, el compuesto químico diana continuamente se segrega a la segunda fase durante el procedimiento. En una variante particular de esta realización, se añade una sustancia soluble en agua a la mezcla de reacción que conduce a una separación de fases del compuesto químico diana a una concentración inferior que sin la sustancia añadida. Los ejemplos de tales sustancias son sales y son conocidas para el experto en la materia. En una variante particularmente preferida de esta realización, se añade cloruro sódico para reducir la solubilidad del compuesto químico diana en la fase acuosa.

En otra realización preferida, se añade un disolvente orgánico adicional al procedimiento que forma su propia fase y extrae el compuesto químico hidrófobo producido a partir de la fase acuosa. Los ejemplos preferidos de tales disolventes adicionales comprenden: n-hexano, ciclohexano, octanol, etilacetato, metilbutilcetona o combinaciones de los mismos.

En otra realización preferida, el rendimiento se mejora debido a que la formación de productos secundarios se reduce usando enzimas diana que son específicas para las reacciones deseadas. En otra realización preferida, se inactivan enzimas del huésped que catalizarían reacciones secundarias durante la etapa II y/o están inactivas en las condiciones de reacción de la etapa III.

En otra realización preferida más de la invención, la contaminación del procedimiento por microorganismos se evita ajustando las condiciones de reacción en la etapa III que son tóxicas para contaminantes microbianos típicos. Tales condiciones comprenden temperatura elevada, pH extremo, adición de compuestos químicos orgánicos. En una realización particularmente preferida de la invención, el compuesto químico diana en sí mismo es tóxico a la concentración conseguida en el procedimiento (procedimiento más estable con menos esfuerzo en equipamiento y/o ambiente de producción).

De acuerdo con otra realización preferida de la invención, no se añaden cofactores adicionales a la mezcla de reacción excepto los cofactores que se producen por los microorganismos usados en la etapa I y que se incluyen en el lisado celular producido en la etapa II. Son ejemplos de tales cofactores NAD/NADH, NADP/NADPH, ATP/ADP. De acuerdo con esta realización, los cofactores que se requieren los producen las células microbianas en la etapa I y se regeneran durante el procedimiento (NADH a NAD y viceversa; NADPH a NADP y viceversa, ADP a ATP y viceversa). En una realización de la invención, se regeneran equivalentes de energía (NADH, NADPH) o equivalentes de reducción (ATP) en exceso por enzimas adicionales (NADH oxidasa para NADH; NADPH oxidasa para NADPH; ATPasa para ATP).

En una realización particularmente preferida de la invención, no se implica ni ATP ni ADP como un cofactor en al menos una parte sustancial del procedimiento de reacción multietapa. Una parte sustancial de la ruta de reacción multietapa comprende preferentemente al menos el 20 % de las actividades enzimáticas, y más preferentemente al menos el 50 % de las actividades enzimáticas. Más preferentemente, ninguna de las actividades enzimáticas de la mezcla de enzima diana (la mezcla de enzima producida en la etapa I) comprende una etapa de fosforilación (ruta de reacción no fosforilante). En una realización particularmente preferida de la invención la ruta de reacción implica la conversión de glucosa a piruvato y ninguna de las enzimas diana implicadas en esta conversión comprende una etapa de fosforilación (producción de piruvato no fosforilante).

Etapa IV: En la etapa IV, el o los compuestos químicos diana se separan de la mezcla de reacción.

En una realización preferida de la invención el o los compuestos químicos diana son hidrófobos y forman una fase separada que preferentemente contiene al menos una fracción sustancial de los compuestos químicos producidos. En una realización particularmente preferida el o los compuestos químicos diana se retiran continuamente de la mezcla de reacción.

En una realización preferida adicional de la invención, la fuente de carbono se suministra continuamente a la mezcla de reacción para convertirse en el compuesto químico diana. De forma similar, el compuesto químico diana preferentemente se retira continuamente como una fase separada y se purifica adicionalmente por procedimientos conocidos en la técnica. Por lo tanto, el aislamiento del producto se simplifica puesto que el producto se recoge en una fase separada de la que puede purificarse adicionalmente. Por lo tanto, el rendimiento se mejora y se simplifica la purificación del producto.

Un problema principal de los procedimientos enzimáticos sin células descritos (Zhang y col., 2008, Welch y Scopes 1985) es la acumulación de ATP. En los procedimientos descritos este se elude por la adición de una ATPasa. Encontrar la concentración correcta de ATPasa, sin embargo, es difícil puesto que depende de la concentración del sustrato y diferentes intermedios así como de la actividad de las enzimas. Con demasiada ATPasa o muy poca ATPasa la conversión cesa completamente (Welch y Scopes, 1985). Por el contrario, de acuerdo con un aspecto particularmente preferido, el procedimiento sin células de la invención convierte una fuente de carbono tal como glucosa y sus polímeros a un compuesto químico diana tal como etanol/butanol y/o isobutanol sin producción neta de ATP y sin usar una ATPasa.

En una realización preferida adicional, el procedimiento de la invención no requiere ADP o ATP como cofactores. Otros procedimientos (Welch y Scopes, 1985; Algar y Scopes, 1985) requieren cofactores tales como ADP/ATP y NAD+/NADH. La conversión postulada de glucosa a Butanol (Zhang y col, 2008) requiere los cofactores ADP/ATP, NAD7NADH, Ferredoxina y Coenzima A.

Tal como se usa en el presente documento, el término "enzima" abarca también la expresión "actividad enzimática" y pueden usarse de forma indistinta. Se describen en lo sucesivo en el presente documento varias realizaciones preferidas con respecto a la producción de n-butanol, isobutanol, etanol y 2-butanol. Producción de n-butanol En una realización de la invención, el compuesto químico diana es n-butanol y la mezcla de enzima diana para producir n-butanol comprende menos de 19 actividades enzimáticas diferentes. Preferentemente la mezcla de enzima diana comprende 17 o menos actividades enzimáticas diferentes, más preferentemente 16 o menos actividades enzimáticas diferentes incluso más preferentemente 15 o menos actividades enzimáticas y más preferentemente solamente 12 actividades enzimáticas diferentes. Debido a que la producción de enzimas es un factor de coste importante en el procedimiento esto proporciona una ventaja importante sobre otros procedimientos.

En una realización particularmente preferida, n-butanol se produce a partir de glucosa mediante los intermedios piruvato y acetil CoA. La producción de n-butanol a partir de glucosa puede subdividirse arbitrariamente en tres etapas: (A) Conversión de una molécula de glucosa a dos moléculas de piruvato. (B) Conversión de dos moléculas de piruvato a dos moléculas de acetil CoA. (C) Conversión de dos moléculas de acetil CoA a una molécula de n-butanol.

Etapa (A): Conversión de glucosa a piruvato.

Esta etapa es común en la mayoría si no en todos los organismos, incluso aunque existen diferentes rutas metabólicas (por ejemplo ruta Embden-Meyerhof-Parnas, ruta Entner-Doudoroff). Una variante particular de la etapa (A) usa enzimas de la ruta Embden-Meyerhof-Parnas, que comprende las actividades de 10 enzimas como se enumeran en la Tabla 1 (combinación de enzimas A.1). La ruta de reacción catalizada por esta combinación de enzimas incluye enzimas fosforilantes y conduce a una producción de ATP neta (se generan dos moléculas de ATP por molécula de glucosa).

N° Enzima EC N° Sustrato Producto 1 Hexoquinasa 2.7.1.1 Glucosa Glucosa-6-Fosfato 2 Fosfohexoisomerasa 5.3.1.9 Glucosa 6 Fosfato Fructosa-6-Fosfato 2.7.1.11 Fructosa-1 ,6- 3 Fosfofructoquinasa Fructosa-6-Fosfato Bisfosfato 4.1.2.13 Gliceraldehido-3- Fructosa-1 ,6- Fosfato, 4 Aldolasa Bisfosfato Dihidroxiacetona- Fosfato Fosfotriosa 5.3.1.1 Dihidroxiacetona- Gliceraldehído-3- 5 isomerasa Fosfato Fosfato Glicerinaldehido-3- 1.2.1.12 Gliceraldehído-3- Glicerato-1 ,3 6 Fosfato- Fosfato Bisfosfato Deshidrogenasa Fosfoglicerato 2.7.2.3 Glicerato-1 ,3 7 Glicerato-3-Fosfato quinasa Bisfosfato Fosfoglicerato 5.4.2.1 8 Glicerato-3-Fosfato Glicerato-2-Fosfato mutasa 9 Enolasa 4.2.1.11 Glicerato-2-Fosfato Fosfoenolpiruvato 10 Piruvato quinasa 2.7.1.40 Fosfoenolpiruvato Piruvato Tabla 1 : Combinación de enzimas A.1 , que comprende enzimas de la ruta Embden- Meyerhof-Parnas.

Otra variante particular de la etapa (A) usa actividades enzimáticas de la ruta Entner-Doudoroff. De acuerdo con una realización preferida de la invención, se usan enzimas de la ruta Entner-Doudoroff no fosforilante conocidas a partir de arqueobacterias en la etapa (A). Esto comprende las 8 actividades enzimáticas enumeradas en la Tabla 2 (combinación de enzimas A.2). Esta combinación de enzimas comprende enzimas fosforilantes y, por lo tanto, requiere ATP y/o ADP como cofactores, pero la conversión de glucosa a piruvato no conduce a producción neta de ATP.

Tabla 2: Combinación de enzimas A.2, que comprende enzimas de la ruta Entner-Doudoroff no fosforilante.

Otra variante particularmente preferida de la etapa (A) usa una combinación de enzimas que no conduce a producción neta de ATP ni requiere ATP o ADP como cofactores. La combinación de enzimas respectiva comprende las 9 actividades enzimáticas diferentes como se enumeran en la Tabla 3 (combinación de enzimas A.3). a a : ombinac n e enz mas A.3, que comprende acl ividades enzimáticas de diversas rutas.

Una variante adicional particularmente preferida de la etapa (A) usa otra combinación de enzimas que tampoco conduce a producción neta de ATP ni requiere ATP o ADP como cofactores. La combinación de enzimas respectiva comprende las 5 actividades enzimáticas diferentes como se enumeran en la Tabla 4 (combinación de enzimas A.4).

N° Enzima EC N° Sustrato Producto Glucosa 1.1.1.4 1 Glucosa Gluconolactona deshidrogenasa 7 3.1.1.1 2 Gluconolactona Gluconato Gluconolactonasa 7 Dihidroxiácido deshidratasa (con 2-ceto-3-desoxi 3 Gluconato actividad gluconato gluconato deshidratasa) 4.2.1.9 2-ceto-3-desoxi 4.1.2.1 2-ceto-3-desoxi Piruvato, 4 gluconato aldolasa 4 gluconato Gliceraldehído Aldehido 5 Gliceraldehído Glicerato deshidrogenasa 1.2.1.3 Dihidroxiácido deshidratasa (con 6 Glicerato Piruvato actividad glicerato deshidratasa) 4.2.1.9 Tabla 4: Combinación de enzimas A.4, que comprende actividades enzimáticas de diversas rutas.

Etapa (B): Conversión de piruvato a acetil CoA Existen diversas opciones para la conversión de piruvato a acetil CoA.

En una realización de la invención, se usan una o más de las siguientes enzimas para conversión: (i) piruvato oxidorreductasa que usa ferredoxina como cofactor; (ii) piruvato deshidrogenasa que usa NAD(P)H como cofactor; (iii) piruvato formato liasa; (iv) complejo de enzima piruvato deshidrogenasa.

En una realización preferida, se usa piruvato deshidrogenasa como. la enzima para esta conversión, usando NADH como cofactor (como se enumera en la Tabla 5).

Tabla 5: Combinación de enzimas B.1 Las piruvato deshidrogenasas son habitualmente parte de un complejo multienzima (complejo de piruvato deshidrogenasa, PDC) que consiste en tres actividades enzimáticas y tiene un peso molecular de aproximadamente 1 millón de Da. Para aplicación en un sistema de reacción sin células es beneficioso tener enzimas no en complejo robustas y pequeñas. Se ha descubierto que la piruvato deshidrogenasa de Euglena gracilis puede usarse en la mezcla de enzimas B.1. Esta enzima es singular y sin complejo. Además usa NADH como cofactor que se compara con NADPH, el cofactor más adecuado (disponible en mayores cantidades; más fácil de regenerar).

Como alternativa, puede combinarse piruvato formato liasa con una formato deshidrogenasa usando NADH como cofactor.

Etapa (C): Conversión de acetil CoA a n-butanol Existen diversas opciones para la conversión de acetil CoA a n-butanol, puesto que varios microorganismos producen n-butanol mediante esta ruta (por ejemplo C. acetobutylicum, C. beijerínckii).

En una variante preferida de la etapa (C), las enzimas como se enumeran en la Tabla 6 se usan para la conversión. Dependiendo de las enzimas (organismos fuente) se usan diferentes cofactores.

N° Enzima EC N° Sustrato Producto 1 Tiolasa 2.3.1.16 AcetilCoA AcetoacetilCoA ß-HidroxibutirilCoA 1.1.1.15 2 AcetoacetilCoA ß-HidroxibutirilCoA deshidrogenase 7 3 Crotonasa 4.2.1.55 ß-HidroxibutirilCoA CrotonilCoA ButirilCoA 1.3.99.2 4 CrotonilCoA ButirilCoA Deshidrogenasa Butanal 1.2.1.57 5 Deshidrogenasa que Butirato Butanal acila CoA Butanol 1.1.1 - 6 Butanal Butanol Deshidrogenasa Tabla 6: Combinación de enzimas C.1 para la conversión de Acetil CoA a n-Butanol.

En otra variante preferida la ruta de reacción desde el intermedio Butiril CoA a Butanol no implica butirato sino butirilfosfato. Las rutas enumeradas y las enzimas no son exclusivas. Pueden usarse también enzimas y rutas alternativas conocidas en la técnica.

Cuando todas las etapas de reacción como se han descrito anteriormente se combinan (combinación de enzimas A.1 , A.2, A.3 o A.4; más combinaciones de enzimas B.1 y C.1) se consigue una conversión neta de una molécula de glucosa a dos moléculas de C02, una molécula de agua y una molécula de n-butanol. Ninguna de las combinaciones de enzimas conduce a una producción neta de equivalentes de reducción (se liberan 4 moléculas de H2 y posteriormente se usan de nuevo). Dependiendo de la ruta de glucosa a piruvato se generan ninguna (A.2, A.3 o A.4) o hasta 2 moléculas de ATP (A.1) a partir de ADP y fosfato.

En una realización particularmente preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.4, B.1 y C.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende solamente 12 actividades enzimáticas diferentes, no requiere ADP/ATP como cofactor y, en consecuencia, no conduce a una producción de ATP neta.

En otra realización particularmente preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.3, B.1 y C.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende 16 actividades enzimáticas diferentes, no requiere ADP/ATP como cofactor y, en consecuencia, no conduce a una producción de ATP neta.

En otra realización preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.2, B.1 y C.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende 15 actividades enzimáticas diferentes, requiere ADP/ATP como cofactores, pero no conduce a una producción neta de ATP.

Producción de isobutanol En otra realización de la invención el compuesto químico diana es isobutanol. En una realización particularmente preferida, se produce isobutanol a partir de glucosa mediante el intermedio piruvato. La producción de isobutanol a partir de glucosa puede subdividirse arbitrariamente en dos etapas: (A) Conversión de una molécula de glucosa a dos moléculas de piruvato; y (D) Conversión de dos moléculas de piruvato a una molécula de isobutanol.

Etapa (A): Conversión de glucosa a piruvato Esta etapa es equivalente a la etapa (A) en la Producción de n-butanol (véase anteriormente).

Etapa (D): Conversión de piruvato a isobutanol En una realización preferida de la invención, las actividades enzimáticas como se enumeran en la Tabla 7 se usan en la Etapa (D) para producción sin células de isobutanol.

N° Enzima EC N° Sustrato Producto 1 acetolactato sintasa 2.2.1.6 Piruvato Acetolactato Cetoácido 2,3 dihidroxi 2 Acetolactato reductoisomerasa 1.1.1.86 isovalerato Dihidroxiácido 2,3 dihidroxi 3 a-ceto-isovalerato deshidratase 4.2.1.9 isovalerato 2-oxo ácido 4 descarboxilasa de a-ceto-isovalerato isobutanal cadena ramificada 4.1.1.72 5 alcohol deshidrogenasa 1.1.1.1 Isobutanal isobutanol Tabla 7: Combinación de enzimas D.1, que comprende actividades enzimáticas para la conversión de piruvato a isobutanol.

Cuando todas las reacciones como se han descrito anteriormente se combinan (combinaciones de enzima A.1 , A.2, A.3 o A.4; más combinación de enzimas D.1) se consigue una conversión neta de una molécula de glucosa a dos moléculas de C02, una molécula de agua y una molécula de isobutanol. Ninguna de las combinaciones de enzimas conduce a una producción neta de equivalentes de reducción (se forman 4 moléculas de H2 en la formación de dos moléculas de piruvato y se usan posteriormente en la formación de isobutanol). Dependiendo de la ruta de glucosa a piruvato se generan ninguna (A.2, A.3 o A.4) o hasta 2 moléculas de ATP (A.1) a partir de ADP y fosfato.

En una realización particularmente preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.4 y D.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende solamente 10 actividades enzimáticas diferentes, no requiere ADP/ATP como cofactor y, en consecuencia, no conduce a una producción de ATP neta.

En otra realización particularmente preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.3 y D.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende 14 actividades enzimáticas diferentes, no requiere ADP/ATP como cofactor y, en consecuencia no conduce a una producción de ATP neta.

En otra realización preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.2 y D.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende 13 actividades enzimáticas diferentes, requiere ADP/ATP como cofactores, pero no conduce a una producción de ATP neta.

Producción de etanol En otra realización de la invención, el compuesto químico diana es etanol. El etanol es completamente soluble en agua a cualquier relación y no permite una purificación fácil por formación de una fase orgánica separada. El procedimiento de la invención para la producción sin células no obstante proporciona un modo eficaz en costes para producir etanol a partir de fuentes de carbono renovables.

En una realización particularmente preferida, se produce etanol a partir de glucosa mediante el intermedio piruvato. La producción de etanol a partir de glucosa puede subdividirse arbitrariamente en dos etapas: (A) Conversión de una molécula de glucosa a dos moléculas de piruvato; y (E) Conversión de dos moléculas de piruvato a dos moléculas de etanol.

Etapa (A): Conversión de glucosa a piruvato Esta etapa es equivalente a la etapa (A) en la Producción de n-butanol (véase anteriormente).

Etapa (E): Conversión de piruvato a etanol En una realización preferida de la invención, las actividades enzimáticas como se enumeran en la Tabla 8 se usan para la conversión de piruvato a etanol.

N° Enzima EC N° Sustrato Producto 1 Piruvato decarboxilasa 4.1.1.1 Piruvato Acetaldehído Alcohol 2 Acetaldehído Etanol deshidrogenasa 1.1.1.1 Tabla 8: Combinación de enzimas E.1 , que comprende actividades enzimáticas para la conversión de piruvato a etanol.

Cuando todas las reacciones como se han descrito anteriormente se combinan (combinaciones de enzima A.1 , A.2, A.3 o A.4; más combinación de enzimas E.1) se consigue una conversión neta de una molécula de glucosa a dos moléculas de C02 y dos moléculas de etanol. Ninguna de las combinaciones de enzimas conduce a una producción neta de equivalentes de reducción. Dependiendo de la ruta de glucosa a piruvato se generan ninguna (A.2, A.3 o A.4) o hasta 2 moléculas de ATP (A.1) a partir de ADP y fosfato.

En una realización particularmente preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.4 y E.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende solamente 7 actividades enzimáticas diferentes, no requiere ADP/ATP como cofactor y, en consecuencia, no conduce a una producción neta de ATP.

En otra realización particularmente preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.3 y E.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende 11 actividades enzimáticas diferentes, no requiere ADP/ATP como cofactor y no conduce a una producción neta de ATP.

En otra realización preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.2 y E.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende 10 actividades enzimáticas diferentes, requiere ADP/ATP como cofactores, pero no conduce a una Producción neta de ATP.

Producción de 2-butanol En otra realización de la invención, el compuesto químico diana es 2-butanol.

En una realización particularmente preferida, se produce 2-butanol a partir de glucosa mediante el intermedio piruvato. La producción de 2-butanol a partir de glucosa puede subdividirse arbitrariamente en dos etapas: (A) Conversión de una molécula de glucosa a dos moléculas de piruvato; y (F) Conversión de dos moléculas de piruvato a dos moléculas de 2-butanol.

Etapa (A): Conversión de glucosa a piruvato Esta etapa es equivalente a la etapa (A) en la producción de n-butanol (véase anteriormente).

Etapa (F): Conversión de piruvato a 2-butanol En una realización preferida de la invención, las actividades enzimáticas como se enumeran en la Tabla 9 se usan en la Etapa (F) para la producción sin células de 2-butanol. En una realización preferida se usa una alcohol deshidrogenase que usa acetoína así como 2-butanona como Sustrato.

Tabla 9: Combinación de enzimas F.1 , que comprende actividades enzimáticas para la conversión de piruvato a 2-butanol.

• Cuando todas las reacciones como se han descrito anteriormente se combinan (combinaciones de enzimas A.1 , A.2, A.3 o A.4; más combinación de enzimas F.1) se consigue una conversión neta de una molécula de glucosa a dos moléculas de CO2, una molécula de agua y una molécula de 2-butanol. Ninguna de las combinaciones de enzimas conduce a una producción neta equivalentes de reducción (se forman 4 moléculas de H2 en la formación de dos moléculas de piruvato y se usan posteriormente en la formación de 2-butanol). Dependiendo de la ruta de glucosa a piruvato se generan ninguna (A.2, A.3 o A.4) o hasta 2 moléculas de ATP (A.1) a partir de ADP y fosfato.

En una realización particularmente preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.4 y F.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende solamente 9 enzimas diferentes, no requiere ADP/ATP como cofactor y, en consecuencia, no conduce a una producción neta de ATP.

En otra realización particularmente preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.3 y F.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende 14 actividades enzimáticas diferentes, no requiere ADP/ATP como cofactor y, en consecuencia, no conduce a una producción neta de ATP.

En otra realización preferida de la invención, se combinan las combinaciones de enzimas A.2 y F.1. Esta mezcla de enzimas diana comprende 13 actividades enzimáticas diferentes, requiere ADP/ATP como cofactores, pero no conduce a una Producción neta de ATP.

Otros Sustratos distintos de glucosa Las rutas descritas de la invención para la producción de etanol, n-butanol, isobutanol, 2-butanol u otros compuestos químicos no se limitan al uso de glucosa como sustrato. Dependiendo de la selectividad de la glucosa deshidrogenasa aplicada en el procedimiento por ejemplo pueden usarse también otros azúcares de C6 como sustrato. Además puede usarse almidón como sustrato en combinación con una actividad amilasa/glucoamilasa. Puede usarse material celulósico como sustrato junto con una actividad endocelulosa/exocelulosa/glucosidasa. También pueden usarse lactosa, sacarosa y otros derivados de azúcares oligoméricos o poliméricos junto con las enzimas correspondientes que convierten estos a hexosas monoméricas.

Para una realización de la invención, se convierte material lignocelulósico a etanol usando solamente 10 enzimas en total (combinaciones de enzimas A.4 y E.1 , endocelulasa, exocelulasa, beta-glucosidasa).

Ejemplos La presente invención se define adicionalmente en los siguientes ejemplos.

Debería entenderse que estos ejemplos se proporcionan como ilustración solamente y no son limitantes del alcance de la invención. A partir del análisis anterior y estos ejemplos, un experto en la materia puede determinar las características esenciales de la presente invención y sin alejarse del espíritu y alcance de la misma, pueden realizar diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones.

Ejemplo 1 : Conversión de glucosa a n-butanol usando mezclas de enzimas a partir de lisados celulares de C. saccharobutylicum. S. cerevisae v Z. mobilis S. cerevisae se cultiva de forma anaerobia a 30 °C en medio YPD que contiene glucosa al 12 %. La formación de etanol se controla tomando muestras cada hora y por análisis con cromatografía de gases. En una fase de máxima productividad de etanol las células se recogen y se suspenden con volumen 4x de tampón de reacción (fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?). Las células se lisan después por disrupción en una prensa francesa, se elimina el sobrenadante celular por centrifugación y se esteriliza por filtrado para retirar cualquier célula restante.

Z mobilis (ATCC10998) se cultiva a 35 °C en medio LB que contiene glucosa al 12 %. La formación de etanol se controla tomando muestras cada hora y por análisis de cromatografía de gases. En una fase de máxima productividad de etanol las células se recogen y se suspenden con volumen 4x de tampón de reacción (fosfato potásico 20 m , pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoC 500 µ?, MnC^ 200 µ?). Las células se lisan después por disrupción en una prensa francesa y se elimina el sobrenadante celular por centrifugación y se esteriliza por filtrado para retirar cualquier célula restante.

Clostrídium saccharobutylicum DSMZ 13864 se cultiva en medio TYA (peptona Tristona 6 g/l, extracto de levadura 2 g/l, NH4CH3COO 3 g/l, MgS04 0,3 g/l, KH2P04 0,5 g/l, Resazurin 1 mg/l, MnS04 10 mg/l, ácido p-aminobenzoico 1 mg/l, clorhidrato de cloruro de tiamina 1 mg/l, biotina 0,2 mg/l) con concentración de glucosa del 6 % a 35 °C. La formación de butanol se sigue de toma de muestras cada 2 horas y análisis por CG. Después de 40 horas las células están en una fase productora de disolvente. Las células se recogen, se lisan y el lisado se esteriliza por filtración.

Se incuba un mililitro de lisado celular de C. saccharobutylicum con glucosa 100 mM con o sin una cantidad igual del lisado de S. cerevisae o Z. mobilis. En todas las reacciones se añade ácido cetomalónico 10 mM (71740, Fluka) que actúa como inhibidor de piruvato descarboxilasa. Después de 2 horas de incubación anaeróbica a 30 °C se cuantifica el n-butanol producido en todas las reacciones.

Ejemplo 2: Conversión de glucosa a n-butanol usando enzimas aisladas v enzimas de lisados celulares de C. saccharobutylicum El lisado celular de C. saccharobutylicum del ejemplo 1 se incuba con las siguientes enzimas: hexoquinasa (20 u/ml), fosfohexoisomerasa (15 u/ml), fosfofructoquinasa (4 u/ml), aldolasa (16 u/ml), fosfotriosaisomerasa (300 u/ml), glicerinaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (60 u/ml), fosfoglicerato quinasa (120 u/ml), fosfoglicerato mutasa (60 u/ml), enolasa (1 1 u/ml), piruvatoquinasa (15 u/ml), piruvato deshidrogenasa (20 u/ml), fosfotransacetilasa (15 u/ml) (todas las enzimas obtenidas de Sigma, véase tabla posterior, solamente fosfoglicerato mutasa obtenida de USB, 26111 Miles Road, Cleveland Ohio, número de Producto 261 18 100 UG, enzima humana expresada de forma recombinante en E .coli). La incubación se realiza en fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?, ATP 4 mM, ADP 1 mM, NADH 1 mM, NAD 1 mM, Coenzima A 1mM y glucosa 200 mM a 30 °C en condiciones anaerobicas. Se agota el oxígeno de todos los reactivos usados por procedimientos convencionales. Después de 10 minutos se añade ATPasa (0,5 u/ml) para evitar la acumulación temprana de ATP. Después de 3 horas se cuantifica el n-butanol producido.

Enzima Sustrato Producto EC N° Producto Origen N° Hexoquinasa Glucosa Glucosa-6-Fosfato 2.7.1.1 H6380 S. cerevisiae Fosfohexoisomerasa Glucosa 6 Fosfato Fructosa-6-Fosfato 5.3.1.9 P5381 S. cerevisiae Fosfofructoquinasa Fructosa-6-Fosfato Fructosa-1 , 6- 2.7.1.11 F0137 B.

Blsfosfato stearother- mophilus Aldolasa Fructosa-1 ,6- Gliceraldehído-3- 4.1.2.13 A2714 O.

Blsfosfato Fosfato, cuniculus Dihidroxiacetona- (Conejo) fosfato Fosfotriosa isomerasa Dihidroxiacetona- GI¡ceraldehído-3- 5.3.1.1 T2507 S. fosfato Fosfato cerevisiae Glicerinaldehldo-3- GI¡ceraldehído-3- Glicerato-1 ,3 1.2.1.12 G5537 S. fosfato- Fosfato Bisfosfato cerevisiae Deshidrogenasa Enzima Sustrato Producto EC N° Producto Origen N° Fosfoglicerato quinasa Glicerato-1 ,3 Glicerato-3-Fosfato 2.7.2.3 P7634 S.

Bisfosfato cerevisiae Enolasa Glicerato-2- Fosfoenolpiruvato 4.2.1.11 E6126 S.

Fosfato cerevisiae Piruvato quinasa Fosfoenolpiruvato Piruvato 2.7.1.40 P1903 B. stearother- mophilus Piruvato Piruvato Acetilfosfato 1.2.1.51 P3798 L. deshidrogenasa delbrueckii Fosfotra n saceti lasa Acetilfosfato AcetilCoA 1.2.1.51 P2783 B. stearother- mophilus ATP fosfohidrolasa ATP ADP y fosfato 3.6.1.3 A7510 S. scrofa (Cerdo) Tabla 10: Enzimas (Sigma-Aldrich) para la conversión de glucosa a Acetil CoA.

Ejemplo 3: Conversión de glucosa a n-butanol usando enzimas aisladas Las enzimas Tiolasa (EC 2.3.1.16, Clostridium acetobutylicum, NCBI-GenID NP_349476.1), 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (EC 1.1.1.157, NP_349314.1), Crotonasa (EC 4.2.1.55, Clostridium acetobutylicum, NP_349318.1), Butiril-CoA deshidrogenasa (EC 1.3.99.2, Clostridium acetobutylicum, NCBI-GenID NP_349317.1), Aldehido deshidrogenasa que acila Coenzima A (EC 1.2.1.57, Clostridium beijerinckii, NCBI-GenID AF132754_1), butanol deshidrogenasa B dependiente de NADH (BDH II) (EC 1.1.1.-, Clostridium acetobutylicum, NCBI-GenID NP_349891.1) y una flavoproteína de transferencia de electrones (etfA y B, Clostridium acetobutylicum, NCBI-GenID NP_349315.1 y NP_349316.1) se sintetizan y se expresan de forma recombinante en E. coli como se ha descrito. Todas las enzimas se combinan (1 mg de cada una) en una solución de reacción de 5 mi (fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaC1 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2200 µ?, ATP 4 mM, ADP 1 mM, NADH 1 mM, NAD 1 mM, Coenzima A 1 mM). Un volumen igual de la mezcla de enzimas como se enumera en la Tabla 9 anterior (conversión de glucosa a acetil CoA) se añade: hexoquinasa (200 u/ml), fosfohexoisomerasa ( 50 u/ml), fosfofructoquinasa (40 u/ml), aldolasa (160 u/ml), fosfotriosaisomerasa (3000 u/ml), glicerinaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (600 u/ml), fosfoglicerato quinasa (1200 u/ml), fosfoglicerato mutasa (600 u/ml), enolasa (110 u/ml), piruvatoquinasa (150 u/ml), piruvato deshidrogenasa (200 u/ml), fosfotransacetilasa (150 u/ml), ATPasa (4,5 u/ml) combinado en tampón de fosfato potásico 20 mM (pH 6,5) que incluye glucosa 500 mM. La reacción se agita en condiciones anaeróbicas a 30 °C. Después de 3 horas se cuantifica el n-butanol producido.

Como alternativa, la reacción se realiza en adición continua de glucosa a una velocidad de 120 mg/h (adición manual de 60 mg en intervalos de 30 minutos, comenzando 2 horas después del comienzo de la reacción). Después de un tiempo total de reacción de 20 horas se cuantifica el n-butanol producido.

Ejemplo 4: Conversión de glucosa a isobutanol usando enzimas aisladas v un lisado celular de T. marítima T. marítima se cultiva a 80 °C en glucosa al 5 %. Antes del uso completo de la glucosa las células se recogen, se resuspenden en volumen 4x de tampón de reacción (fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?) y se lisan por disrupción en una prensa francesa. El sobrenadante celular se elimina por centrifugación y se esteriliza por filtración. Los genes ilvICD para biosíntesis de valina (acetolactato sintetasa, EC: 2.2.1.6, NCBI-GeneID: NP_228358.1 ; cetoácido reductoisomerasa, EC. 1.1.1.86, NCBI-GeneID: NP_228360.1 y dihidroxiácido deshidratasa, EC: 4.2.1.9, NCBI-GeneID: NP_228361.1) se clonan de Thermotoga marítima y se expresan de forma recombinante en E. coli por procedimientos convencionales, oc-cetoisovalerato descarboxilasa de Lactococcus lactis (EC 4.1.1.-, NCBI-GeneID: CAG34226.1 ) se clona y se expresa de forma recombinante en E. coli por procedimientos convencionales. Alcohol deshidrogenasa (EC: 1.1.1.1) de S. cerevisiae se obtiene de Sigma-Aldrich (A3263).

Todas las enzimas se combinan en 5 mi de solución de reacción (fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS0 500 µ?, CoCI2 500 µ , MnCI2 200 µ?, ATP 4 mM, ADP 1 mM, NADH 1 mM, NAD 1 mM) a una concentración de 100 u/ml.

Se añade un volumen igual del lisado celular de T. marítima y la muestra combinada se incuba a 50 °C con glucosa 250 mM. Después de 1 hora se cuantifica el isobutanol producido.

Ejemplo 5: Conversión de glucosa a etanol usando enzimas aisladas Los genes para las enzimas: glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.47, S. solfataricus, NCBI Gen ID: NP_344316.1), gluconolactonasa (EC 3.1.1.17, Picrophilus torridus, NCBI Gen ID YP_023685.1), gluconato deshidratasa (EC 4.2.1.39, Sulfolobus solfataricus, NCBI-Gen ID: NP_344505, Mutación 9L), 2-ceto-3-desoxi gluconato aldolasa (EC 4.1.2.14, Sulflobus solfataricus, NCBI Gen ID NP_344504.1), aldehido deshidrogenasa (EC 1.2.1.3, Flavobacterium frigidimaris, NCBI Gen ID: BAB96577.1 ), glicerato quinasa (EC 2.7.1.-, Sulfolobus solfataricus, NCBI Gen ID: NP_342180.1), enolasa (EC 4.2.1.1 1 , Sulfolobus solfataricus, NCBI Gen ID: NP_342405.1) y piruvato quinasa (EC 2.7.1.40, Sulfolobus solfataricus, NCBI Gen ID: NP_342465.1) se sintetizan y clonan en el vector de expresión pET3b por procedimientos convencionales usando Ndel y BamHI para clonación. El crecimiento celular, expresión proteica y la purificación parcial se realizan como se describe en Lamble y col. (2003) pero proporcionando además todos los tampones con mercaptoetanol 5 mM y usando 80 °C como la temperatura general para precipitación por calor (para la aldehido deshidrogenasa se usan 60 °C). La producción proteica está habitualmente entre 5 y 50 mg/l. Se obtienen piruvato descarboxilasa y aldehido deshidrogenasa de S. cerevisiae de Sigma-Aldrich (P N° 29163 y 82884).

Todas las enzimas se combinan (1 mg de cada una de las enzimas producidas de forma recombinante y 2 u de las enzimas compradas) en 5 mi de solución de reacción (fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?, ATP 4 mM, ADP 1 mM, NADH 1 mM, NAD 1 mM) que contiene glucosa 250 mM y se incuba a 47 °C. Cada 30 minutos se añaden las dos enzimas de levadura a la solución para compensar la inactivación térmica. Después de 6 horas se cuantifica el etanol producido. El etanol se produce a partir de glucosa usando solamente 10 enzimas. Además no se produce ATP neto.

Ejemplo 6: Conversión de glucosa a etanol usando enzimas aisladas Aunque es ventajoso producir etanol o compuestos químicos y combustibles a partir de glucosa sin una producción neta de ATP o cualquier otro cofactor es más beneficioso cuando ATP o ADP como cofactor se eliminan completamente del procedimiento. Por lo tanto, se usan las enzimas como se describe en el ejemplo 5 pero sin las enzimas glicerato quinasa (EC 2.7.1.-), enolasa (EC 4.2.1.11) y piruvato quinasa (EC 2.7.1.40). La conversión de glicerato a piruvato se consigue usando las enzimas glicerato deshidrogenasa (también conocida como hidroxipiruvato reductasa (EC 1.1.1.29 / 1.1.1.81)), serina-piruvato transaminasa (EC 2.6.1.51), L-serina amoniaco-liasa (EC 4.3.1.17) y alanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.1). Los genes para las enzimas glicerato deshidrogenasa/hidroxipiruvato reductasa (EC 1.1.1.29 / 1.1.1.81 , Picrophilus torridus, NCBI Gen ID: YP_023894.1), serina-piruvato transaminasa (EC 2.6.1.51 , Sulfolobus solfataricus, NCBI Gen ID: NP_343929.1), L- serina amoniaco-liasa (EC 4.3.1.17, Thermus thermophilus, YP_144295.1 y ??_144005.1) y alanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.1 , Thermus thermophilus, NCBI-Gen ID: YP_005739.1) se sintetizan (codones optimizados para la producción en E. coli) y se clonan en el vector de expresión pET3b usando Ndel y BamHI. La expresión proteica se realiza en E. coli.

Todas las enzimas se combinan (1 mg de cada una de las enzimas producidas de forma recombinante y 2 u de las enzimas compradas) en 5 mi de solución de reacción (fosfato potásico 20 mM, sulfato de amonio 10 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?, NADH 1 mM, NAD 1 mM, serina 1 mM, alanina 1 mM) que contiene glucosa 250 mM y se incuba a 47 °C. Cada 30 minutos se añaden las dos enzimas de levadura de nuevo a la solución para compensar la inactivación térmica. Después de 6 horas de incubación se cuantifica el etanol producido. El etanol se produce a partir de glucosa sin implicar fosforilación y sin requerir ATP o ADP como cofactor.

Ejemplo 7: Conversión de glucosa a etanol usando enzimas aisladas La formación de piruvato a partir de glicerato es una etapa crítica en la producción de etanol u otros derivados de piruvato. Se ha mostrado que la dihidroxiácido deshidratase (EC 4.2.1.9) de S. solfataricus acepta diferentes sustratos (Kim y Lee, 2006). El gen para la dihidroxiácido deshidratase (EC 4.2.1.9, S. solfataricus, NP_344419.1) se expresa como se ha descrito por Kim y Lee (2006). La enzima es capaz de convertir glicerato a piruvato (aunque a una actividad menor en comparación con el sustrato natural). La enzima también es activa hacia gluconato (aunque a una actividad menor en comparación con el sustrato natural).

Las enzimas glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa, 2-ceto-3-desoxigluconato aldolasa y aldehido deshidrogenasa del ejemplo 9 se combinan con dihidroxiácido deshidratasa (como se ha descrito anteriormente) y piruvato descarboxilasa y aldehido deshidrogenasa de Sigma (véase ejemplo 5) (1 mg de cada una de las enzimas producidas de forma recombinante y 2 u de las enzimas compradas) en 5 mi de solución de reacción (fosfato potásico 20 mM, sulfato de amonio 10 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?, NADH 1 mM, NAD 1 mM) que contiene glucosa 250 mM y se incuba a 47 °C. Cada 30 minutos se añaden las dos enzimas de levadura de nuevo a la solución para compensar la inactivación térmica. Después de 6 horas de incubación se cuantifica el etanol producido.

Ejemplo 8: Conversión de glucosa a n-butanol usando enzimas aisladas sin producción neta de ATP Los genes de las 4 unidades de piruvato sintasa (EC 1.2.7.1., Sulfolobus solfataricus, NCBI-GenID: NP_342664.1 , NP_342663.1 , NP_342666.1 , NP_343517.1 ) y el gen de NADH ferrodoxina reductasa (EC 1.18.1.3, NCBI-GenID NP_342682.1) se sintetizan y clonan en pET3b usando sitios Ndel y BamHI. Los genes se expresan de forma anaerobia en E. coli y se purifican parcialmente como se ha descrito. Glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa, gluconato deshidratasa, 2-ceto-3-desoxi gluconato aldolasa, aldehido deshidrogenasa, glicerato quinasa, enolasa y piruvato quinasa se obtienen como se ha descrito en el ejemplo 5. Tiolasa, ß-hidroxibutirilCoA deshidrogenasa, butirilCoA deshidrogenasa, butanal deshidrogenasa que acila CoA y butanol deshidrogenasa con etfA y etfB se obtienen como se ha descrito en el ejemplo 3.

Todas las enzimas se combinan (1 mg de cada una) en 10 mi de solución de reacción (fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgSO-4 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?, ATP 4 mM, ADP 1 mM, NADH 1 mM, NAD 1 mM, Coenzima A 1 mM, FAD 1 mM, FADH21 mM) que contiene glucosa 250 mM. La solución se incuba a 45 °C. Después de 1 hora se cuantifica el butanol producido.

Ejemplo 9: Conversión de glucosa a n-butanol usando enzimas aisladas sin producción neta de ATP Glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa, 2-ceto-3-desoxi gluconato aldolasa y aldehido deshidrogenasa se obtienen como se ha descrito en el ejemplo 5. Dihidroxiácido deshidratase se obtiene como se ha descrito en el ejemplo 9. NADH ferrodoxin reductasa y piruvato sintasa se obtienen como se ha descrito en el ejemplo 10. Tiolasa, ß-hidroxibutirilCoA deshidrogenasa, butirilCoA deshidrogenasa, butanal deshidrogenasa que acila CoA y butanol deshidrogenasa con etfA y etfB se obtienen como se ha descrito en el ejemplo 3.

Todas las enzimas se combinan (1 mg de cada una) en 10 mi de solución de reacción (fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgS04 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?, NADH 1 mM, NAD 1 mM, Coenzima A 1 mM, FAD 1 mM, FADH21 mM) que contiene glucosa 250 mM. La solución se incuba a 45 °C. Después de 1 hora se cuantifica el n-butanol producido. Ejemplo 10: Conversión de glucosa a isobutanol usando enzimas aisladas sin producción neta de ATP La unidad catalítica de acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6, Sulfolobus solfataricus, NCBI-GenID: NP_342102.1), Cetoácido reductoisomerasa (EC 1.1.1.86, Sulfolobus solfataricus, NCBI-GenID: NP_342100.1), 2-oxo ácido descarboxilasa de cadena ramificada (EC 4.1.1.72, Lactococcus lactis, NCBI-GenID:) y una alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 , Flavobacterium frigidimaris, NCBI-GenID: BAB91411.1) se clonan en pET3b usando sitios Ndel y BamHI. Los genes se expresan en E. coli. Junto con dihidroxiácido deshidratasa (véase ejemplo 7) estas enzimas constituyen la ruta de piruvato a isobutanol. Glucosa deshidrogenasa, gluconolactonasa, gluconato deshidratasa, 2-ceto-3-desoxigluconato aldolasa, aldehido deshidrogenasa, glicerato quinasa, enolasa y piruvato quinasa se obtienen como se ha descrito en el ejemplo 5. Dihidroxiácido deshidratasa se obtiene como se ha descrito en el ejemplo 5.

Todas las enzimas se combinan (1 mg de cada una) en 10 mi de solución de reacción (fosfato potásico 20 mM, pH 6,5; mercaptoetanol 5 mM, NaCI 10 mM, MgSC-4 10 mM, ZnS04 500 µ?, CoCI2 500 µ?, MnCI2 200 µ?, ATP 4 mM, ADP 1 mM, NADH 1 mM, NAD 1 mM) que contiene glucosa 250 mM. La solución se incuba a 53 °C durante 1 hora. Cada 10 minutos se añade 2-oxo ácido descarboxilasa de cadena ramificada fresca para compensar la inactivación térmica. Después de 1 hora se cuantifica el isobutanol producido.

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(2008) Biotechnology: Research, Technology and Applications Las siguientes son secuencias a modo de ejemplo y no limitantes útiles en diversas realizaciones de la invención: Acetil-CoA acetiltransferasa (Tiolasa) (2.3.1.16) >gi | 15896127 | ref | P_349476.11 acetil-CoA acetiltransferasa [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] MKEVVIASAVRTAIGSYGKSLKDVPAVDLGATAIKEAVKKAGIKPEDVNEVILGNVLQAGLGQNPARQAS FKAGLPVEIPAMTINKVCGSGLRTVSLAAQIIKAGDADVIIAGGMENMSRAPYLANNARWGYRMGNAKFV DEMITDGLWDAFNDYHMGITAENIAERWNISREEQDEFALASQKKAEEAIKSGQFKDEIVPVVIKGRKGE TVVDTDEHPRFGSTIEGLAKLKPAFKKDGTVTAGNASGLNDCAAVLVIMSAEKAKELGVKPLAKIVSYGS AGVDPAIMGYGPFYATKAAIEKAGWTVDELDLIESNEAFAAQSLAVA DLKFDMNKVNVNGGAIALGHPI GASGARILVTLVHA QKRDAKKGLATLCIGGGQGTAILLEKC 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenase (1.1.1.157) >gi 115895965 | ref | P_349314.11 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] MKKVCVIGAGTMGSGIAQAFAAKGFEVVLRDIKDEFVDRGLDFINKNLSKLV KGKIEEATKVEILTRIS GTVDLNMAADCDLVIEAAVERMDIKKQIFADLDNICKPETILASNTSSLSITEVASAT RPDKVIGMHFF NPAPVMKLVEVIRGIATSQETFDAVKETSIAIGKDPVEVAEAPGFVVNRILIPMINEAVGILAEGIASVE DIDKAMKLGANHPMGPLELGDFIGLDICLAIMDVLYSETGDSKYRPHTLLKKYVRAGWLGRKSGKGFYDY SK 3-hidroxibutiril-CoA deshidratase (Crotonasa) (4.2.1.55) >gi|15895969|ref|NP_349318.1 | 3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] MELNNVILEKEGKVAVVTINRPKALNALNSDTLKE DYVIGEIENDSEVLAVILTGAGEKSFVAGADISE MKEMNTIEGR FGILGN VFRRLELLEKPVIAAVNGFALGGGCEIAMSCDIRIASSNARFGQPEVGLGIT PGFGGTQRLSRLVG GMAKQLIFTAQNIKADEALRIGLVNKVVEPSELMNTAKEIANKIVSNAPVAVKLS KQAINRG QCDIDTALAFESEAFGECFSTEDQKDAMTAFIEKRKIEGFKNR butiril-CoA deshidrogenasa (1.3.99.2) >gi|15895968|ref|NP_349317.1 | butiril-CoA deshidrogenasa [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] MDFNLTREQELVRQMVREFAENEVKPIAAEIDETERFPMENVKKMGQYGM GIPFSKEYGGAGGDVLSYI IAVEELSKVCGTTGVILSAHTSLCASLINEHGTEEQKQKYLVPLAKGEKIGAYGLTEPNAGTDSGAQQTV AVLEGDHYVINGSKIFITNGGVADTFVIFAMTDRTKGTKGISAFIIEKGFKGFSIGKVEQKLGIRASSTT ELVFED IVPVENMIGKEGKGFPIAMKTLDGGRIGIAAQALGIAEGAFNEARAYMKERKQFGRSLD FQG LA MMADMDVAIESARYLVY AAYLKQAGLPYTVDAARAKLHAANVANDVTTPAVQLFGGYGYTKDYPVE RMMRDA ITEIYEGTSEVQKLVISGKIFR Aldehido deshidrogenasa que acila coenzima A (1.2.1.57) >gi|4884855|gb|AAD3 841.1 |AF132754_1 Aldehido deshidrogenasa que acila coenzima A [Clostridium beijerinckii] MNKDTLIPTTKDLKL TNVENINLKNYKDNSSCFGVFENVENAINSAVHAQKILSLHYTKEQREKIITEI RKAALENKEVLATMILEETHMGRYEDKILKHELVAKYTPGTEDLTTTAWSGDNGLTVVEMSPYGVIGAIT PSTNPTETVICNSIGMIAAGNAVVFNGHPGAKKCVAFAIEMINKAIISCGGPENLVTTIKNPTMESLDAI IKHPLIKLLCGTGGPGMVKTLLNSGKKAIGAGAGNPPVIVDDTADIEKAG SIIEGCSFDNNLPCIAEKE VFVFENVADDLISNML NNAVII EDQVSKLIDLVLQKNNETQEYFINKFWVGKDA LFSDEIDVESPSN IKCIVCEVNANHPFVMTELMMPILPIVRVKDIDEAVKYTKIAEQNRKHSAYIYSKNIDNLNRFEREIDTT IFV NAKSFAGVGYEAEGFTTFTIAGSTGEGITSARNFTRQRRCVLAG Butanol deshidrogenasa dependiente de NADH B (1.1.1.-) >gi|15896542|ref|NP_349891.1 | Butanol deshidrogenasa dependiente de NADH B (BDH II) [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] MVDFEYSIPTRIFFGKD INVLGRELKKYGSKVLIVYGGGSIKRNGIYDKAVSILEKNSIKFYELAGVEP NPRVTTVEKGVKICRENGVEVVLAIGGGSAIDCAKVIAAACEYDGNPWDIVLDGS IKRVLPIASILTIA ATGSEMDTWAVINNMDTNEKLIAAHPDMAPKFSILDPTYTYTVPTNQTAAGTADIMSHIFEVYFSNTKTA YLQDRMAEALLRTCIKYGGIALEKPDDYEARANL WASSLAINGLLTYGKDTNWSVHLMEHELSAYYDIT HGVGLAILTPN MEYILNNDTVYKFVEYGVNVWGIDKEKNHYDIAHQAIQKTRDYFVNVLGLPSRLRDVG IEEEKLDIMAKESVKLTGGTIGNLRPVNASEVLQIFKKSV etfB >gi|15895967|ref|NP_349316.1 | flavoproteína de transferencia de electrones subunidad beta [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] MNIVVCLKQVPDTAEVRIDPVKGTLIREGVPSIINPDDKNALEEALVLKDNYGAHVTVISMGPPQA NAL VEALAMGADEAVLLTDRAFGGADTLATSHTIAAGI KLKYDIVFAGRQAIDGDTAQVGPEIAEHLGIPQV TYVEKVEVDGDTLKIRKAWEDGYEVVEVKTPVLLTAIKELNVPRYMSVEKIFGAFDKEV MWTADDIDVD KANLGLKGSPTKVKKSSTKEVKGQGEVIDKPVKEAAAYVVSKLKEEHYI etfA >gi|15895966|ref|NP_349315.1 | flavoproteína de transferencia de electrones subunidad alfa [Clostridium acetobutylicum ATCC 824] MNKADYKGVWVFAEQRDGELQKVSLELLGKGKEMAEKLGVELTAVLLGHNTEKMSKDLLSHGADKVLAAD NELLAHFSTDGYAKVICDLVNERKPEILFIGATFIGRDLGPRIAARLSTGLTADCTSLDIDVENRDLLAT RPAFGGNLIATIVCSDHRPQMATVRPGVFEKLPVNDANVSDDKIEKVAIKLTASDIRTKVSKVVKLAKDI ADIGEAKVLVAGGRGVGSKENFEKLEELASLLGGTIAASRAAIEKEWVDKDLQVGQTGKTVRPTLYIACG ISGAIQHLAGMQDSDYIIAINKDVEAPIMKVADLAIVGDVNKVVPELIAQVKAANN Acetolactato sintasa (2.2.1.6) >gi|15643314|ref|NP_228358.1 | acetolactato sintasa, subunidad grande [Thermotoga marítima MSB8] MVHVKMKGSKMLFEALLKEGVDTIFGIPGGAIINVYDELCNYEDKINFYLFRHEQGATHAADGYARVTGK PGVVIVTSGPGATNTVTGIATAYMDSIPIVVITGQVPTSFIGTDAFQEVDVTGITMPITKHNHLVTSIEE LPYAIKEMFYVATTGRPGPVLLDFPKDIQTAEGEFNYPDTVEIPGYKPTVKGHPKQIKKAVELLKESKRP VIVGGGANLSGAMDLVNQFIDKFKVPAVSTLMGRGVNPSDEKLYYEGIGMHGTYYGNYAVANADLIIAL GVRFSDRILGNPRTFAKNARIVHVDIDPAEIGKNVRVDVPIVGDLKSVLEEFLKYEIETDFSD IEELQE IKKKYPLTYKRDG LIKPQY VEKVNEVFPDDTVVVADVGQNQM VAQFY F HQRSFLCSGGLGTMGYA LPAGIGAKIGAPDKEVVVFAGDGGFQMNIQELMTIKRYNLPVKIIVMDNKALGMVRQWQQLFFNCRYSAT ILSDNPDFAKIAEAVGIKAMRIE PDQVDEAIEKLAKSKEPMLIHAVVDPAENVLPMVPPGGDVGTPLIE APYDETFVERVLKVIEESRRGDER Cetoácido reductoisomerasa (1.1.1.86) >gi|15643316|ref|NP_228360.1 | cetoácido reductoisomerasa [Thermotoga marítima MSB8] MAVIYYDKDADLNLIKDKKIAIIGYGSQGHAHALNLKDSGLNVVVGLREGSKS KKAEEQGLTVKTIEEA AKEADIIMILIPDEHQPEIYKKYIEKHLTEGKML FAHGFNIHYHQIIPP NVDVTMIAPKSPGHIVRRE YVEGRGVPALVAVYQDYTGKAKDIALAYAKGIGVTRAGVIETTFKEETETDLFGEQAVLCGGVTALIKAG FETLVDAGYQPEIAYFECLNEL LIVDLIYEGGLSFMRYSVSNTAEYGDYISQEKIVTKEVRENMKQMLK DIQTGKFAKDWILENQAGRPYFYTMRKKESEHLIEKVGKELR MMPWLKERNVDEE Dihidroxi ácido deshidratasa (4.2.1.9) >gi|15643317|ref|NP_228361.1 | Dihidroxi ácido deshidratasa [Thermotoga marítima MSB8] MRSDVIKKGLERVPHRSLLKALGITDDEMRRPFIGIVSSWNEIIPGHVHLDKVVEAVKAGVRMAGGVPFV FPTIGICDGIAMDHRGM FSLPSRELIADSIEIVASGFPFDGLVFVPNCDKITPGMMMAMGRLNIPSVLI SGGPMLAGRYNGRDIDLITVFEAVGGYKVGKVDEETLKAIEDLACPGAGSCAGLFTANTMNSLAEALGIA PRGNGTVPAVHAKRLRMAKEAGMLVVELVKRDVKPRDIVTLDSF NAVMVDLATGGSTNTVLHLKAIAES FGIDFDIKLFDELSRKIPHICNISPVGPYHIQDLDDAGGIYAVM RLQENGLLKEDVMTIYLRKIGDLVR EAKILNEDVIRPFDNPYHKEGGLGILFGNLAPEGAVAKLSGVPEKMMHHVGPAVVFEDGEEATKAILSGK IKKGDVVVIRYEGPKGGPG REMLSPTSAIVGMGLAEDVALITDGRFSGGSHGAVIGHVSPEAAEGGPIG IVKDGDLIEIDFEKRTLNLLISDEEFERRMKEFTPLVKEVDSDYLRRYAFFVQSASKGAIFRKP Alfa-cetoísovalerato descarboxilasa (4.1.1.72) >gi|51870502|emb|CAG34226.1 | alfa-cetoisovalerato descarboxilasa [Lactococcus lactis subsp. lactis] MYTVGDYLLDRLHELGIEEIFGVPGDYNLQFLDQIISHKDMK VGNANELNASYMADGYART KAAAFLT TFGVGELSAVNGLAGSYAENLPVVEIVGSPTSKVQNEGKFVHHTLADGDFKHFMK HEPVTAARTLLTAE NATVEIDRVLSALLKERKPVYINLPVDVAAAKAEKPSLPLKKENSTSNTSDQEILNKIQESLKNA PIV ITGHEIISFGLEKTVTQFISKT LPITTLNFG SSVDEALPSFLGIYNGTLSEPNLKEFVESADFILMLG V LTDSSTGAFTHHLNENKMISLNIDEGKIFNERIQNFDFESLISSLLDLSEIEYKGKYIDKKQEDFVPS NALLSQDRLWQAVENLTQSNETIVAEQGTSFFGASSIFLKSKSHFIGQPLWGSIGYTFPAALGSQIADKE SRHLLFIGDGSLQLTVQELGLAIREKINPICFIINNDGYTVEREIHGPNQSYNDIPMWNYSKLPESFGAT EDRVVSKIVRTENEFVSVMKEAQADPNRMYWIELILAKEGAPKVLKKMGKLFAEQNKS Glucosa deshldrogenasa (EC 1.1.1.47) >gi|15899711 |ref|NP_344316.1 | Glucosa 1-deshidrogenasa (dhg-1) [Sulfolobus solfataricus P2] MKAIIVKPPNAGVQVKDVDEKKLDSYGKIKIRTIYNGICGTDREIVNGKLTLSTLPKGKDFLVLGHEAIG VVEESYHGFSQGDLVMPVNRRGCGICRNCLVGRPDFCETGEFGEAGIH MDGFMREWWYDDPKYLV IP SIEDIGILAQPLADIEKSIEEILEVQKRVPVWTCDDGTLNCRKVLVVGTGPIGVLFTLLFRTYGLEVWMA NRREPTEVEQTVIEETKTNYYNSSNGYDKLKDSVGKFDVIIDATGADVNILGNVIPLLGRNGVLGLFGFS TSGSVPLDYKTLQEIVHTNKTIIGLVNGQKPHFQQAVVHLASWKTLYPKAAKMLITKTVSINDEKELLKV LREKEHGEIKIRILWE Gluconolactonasa (EC 3.1.1.17) >g¡|48477979|ref|YP_023685.1 | gluconolactonasa [Picrophilus torridus DSM 9790] MELNIEPQRLGESPIYIRELDTFLWVDILNGDIFSYNGNAK EMHVNDMITSISPYKGTEVIASLRDGIA IIDWKNKITNTLLKLDFPENIRFNDGRCDARGRFFIGT D NEKEPLGALYKFSGRKLERVLDNVTISNG IA SLDSRFMYYIDSPRKSVQVFDYDLSMGRITRHLYDIDL NYSGVPDGMAIDINNNLWVAIHGSSLIS VIDPAKNEILNEVKIAAKKVTSCTFGSVN DKLFVTSAYDGTGGIPFIIDTGSRGVELNRYIP Gluconato deshidratasa (EC 4.2.1.39) >gi|15899900|ref|NP_344505.1 | proteína relacionada con muconato cicloisomerasa [Sulfolobus solfataricus P2] MRIREIEPIVLTSKEKGSATWASIMIVTRVITENGEVGYGEAVPTLRVISVYNAI QVSKAYIGKEVEEV E NYHEWY QDFYLARSFESATAVSAIDIASWDIIGKELGAPIHKLLGGKTRDRVPVYANG YQDCVTPE EFAEKAKDVVKMGYKALKFDPFGPYYDWIDERGLREAEERVKAVREAVGDNVDILIEHHGRFNANSAI I AKRLEKYNPGFMEEPVHHEDVIGLRKYKASTHLRVALGERLISE ETAFYVEEGLVNILQPDLTNIGGVT VGRSVIKIAEANDVEVAFHNAFGSIQNAVEIQLSAVTQNLYLLENFYDWFPQWKRDLVYNETPVEGGHVK VPYKPGLGVSINEKIIEQLRAEPIPLDVIEEPVWVVKGTWKNYGV 2-ceto-3-desoxi gluconato aldolasa (EC 4.1.2.14) >gi|15899899|ref|NP_344504.1 | 2-ceto-3-desox¡ gluconato aldolasa (eda) [Sulfolobus solfataricus P2] MGRQGNLEELWCLRMPEIITPIITPFTKDNRIDKEKLKIHAENLIRKGIDKLFVNGTTGLGPSLSPEEKL ENLKAVYDVTNKIIFQVGGLNLDDAIRLAKLSKDFDIVGIASYAPYYYPRMSEKHLVKYFKTLCEVSPHP VYLYNYPTATGKDIDAKVAKEIGCFTGVKDTIENIIHTLDYKRLNPNMLVYSGSD LIATVASTGLDGNV AAGSNYLPEVTVTIKKLAMER IDEALKLQFLHDEVIEASRIFGSLSSNYVLTKYFQGYDLGYPRPPIFP LDDEEERQLIKKVEGIRAKLVELKILKE Aldehido deshidrogenasa (EC 1.2.1.3) >gi|21238945|dbj|BAB96577.1 | Aldehido deshidrogenasa [Flavobacterium frigidimaris] MSNTIQRPEFKAKYDNYINGKFTAPVKGEYFDVLSPIDGKVFTKAAHSGKEDLELAVDAAYEAFKTWGKT SVTERSILLNKIAQKIEDNLEYIATVETIDNGKPIRETLAADIPLAIDHFRYFAGVIRAEESSIAELDSQ TVSIALSEPLGVVAQIIPWNFPILMAVWKIAPALAAGNTIVLKPAESTPISILVLMELIGDILPPGVLNI VNGFGAELGRPLVTNKKVAKAAFTGSTTTGRLVMQYATENIIPVTLELGGKSPNIFFPSVADHDDDFFDK AIEGAVLFALNQGEICTCPSRLLIHEDIYEKFIARVIERTEAIIAGNPLDKSTMIGAQTSLVQKEKIMSY IKLG EEGAELLTGGDENHLGGDLEGGYYIKPTLFKGHNK RIFQEEIFGPVLAVTTFKTTEEAIEIAND TMYGLGAGVWTRDAHEIYQVPRAIQSGRV INQYHSYPAGAPFGGYKQSGIGRENHKM LGQYRQTKNML ISYD KKLGFF Glicerato quinasa (EC 2.7.1.-) >gi|15897575|ref|NP_342180.1 | Glicerato quinasa, potencial [Sulfolobus solfataricus P2] MDIVDKILEYTDPYKALQEKVRVYNNILLFNNEKIPF KPILISIGKASLPMARFFRERMELKAKLIVTP KGTNGKENDVIEAGHPLPDENSIKAG RMIELLANEDYDLVIFAISGGASALVEYSEIPLDELKIINKVL VTSGLGINKINIVRKHLS VKGGKILEYVKDKIPIVSFIVSDVPGNDISSIGSGLTSIDNSSNDDALEIL KAIGLEKYSKYLTETP SFSRIVKNYIILDNMEVLRKLANTLVNSFILTSEIRGEARDVGAIIASIYNSS ESYNIPFRRPYYLLVGGEPEVTIQGKAGKGGRNGEVCLSFLKYAKKRNRFELLGFATDGIDGNSEYAGC VSSDMEIREDEINNALETHNSYGLLESHKAVIKTGYTHTNVNNIYVLRAP Enolasa (EC 4.2.1.11) >gi| 15897800| ref | N P_342405.11 enolasa [Sulfolobus solfataricus P2] MINRFSIEKV GLEIVDSRGNPTIRVFIRTSDGVESFGDAPAGASKGTREAVEVRDENGLTVKRAVDIVN YIIDPALHGIDVREQGIIDKLLKDIDSTENKS LGGNTIIATSIAALKTASKALGLEVFKYISGPRLPKI PIPLLNIINGGLHAGNKLKIQEFIIVPIKFNTFKEALFAAIDVYRTLKGLITERYGKIYTAVGDEGGFSP PLEDTREALDLIYTSINNAGYEGKIYMGMDAAGSDFYDSK E YIIDGRELDPNQLLEFYLDLVKQYPIV YLEDPFEENSFDMFSQLQNKLSSTIITGDDLYTTNIKYLKIGIEKRSTKGVIVKPNQVGTISETFEFTNL ARRNSMKLITSHRSGETEDNFIADFAVGIESDFIKVGAPARGERTSKYNKLLEIENKFGLEYEGKYFYL Piruvato quinasa (EC 2.7.1.40) >gi|15897860|ref|NP_342465.1 | Piruvato quinasa (pyK) [Sulfolobus solfataricus P2] MRKTKIVATLGPSSEEKVKELAEYVDVFRINFAHGDETSHRKYFDLIRTYAPESSIIVDLPGPKLRLGEL KEPIEVKKGDKIVFSQKDGIPVDDELFYSAVKENSDILIADGTIRVRVKSKAKDRVEGTVIEGGILLSR GINIPNVNLKSGITDNDL LLKRALDLGADYIGLSFVISENDVKKVKEFVGDEA VIAKIEKSEALKNLT NIVNESDGI VARGDLGVETGLENLPLIQRRIVRTSRVFGKPVILATQVLTSMINSPIPTRAEIIDISNS IMQGVDSIMLSDETAIGNYPVESVRTLHNIISNVEKSVKHRPIGPLNSESDAIALAAVNASKVSKADVIV VYSRSGNSILRVSRLRPERNIIGVSPDPRLAKKFKLCYGVIPISINKK QSIDEIIDVSAKLMQEKIKDL KFKKIVIVGGDPKQEAGKTNFVIVKTLEQQKK Glicerato deshidrogenasa/Hidroxipiruvato reductasa (EC 1.1.1.29 o 1.1.1.81) >gi|48478188|ref|YP_023894.1 | Glicerato deshidrogenasa [Picrophilus torridus DSM 9790] M VSVQVNSYYNNEMSKKLLELCRDITGLDAVPGFDDDAEIILFSGRPVPGKKTKFMQSLSAGVNHLDFS KIPDNIIIASNADAYSIPVAETAIGLMLAWARKICISNYNIHNNNYKRLDY EYVSLYNKSLGILGYGGI GRRTALIA SFGMNIYAYSRSYKNDGISSYMEPEDIMKKSDFVLISLPLTKETANSINDKMLSLFRGLAI INVGRAGVVDRNSMLNFLRNHNDKYYLTDVW NEPIINENIPDNVIITPHSAGMSDNIYQPAVAAIENIK NYINGKPKNIVKRSDYI Serina-piruvato transaminasa (EC 2.6.1.51) >gi|15899324|ref|NP_343929.1 | Serine-piruvato aminotransferasa (agxT) [Sulfolobus solfataricus P2] MD LLLHVGPTTIKEDVLVAGLENNVGFTSKEFVEALAYSLKGLRYVMGASKNYQPLIIPGGGTSAMESV TSLLKPNDKIL VSNGVFGDRWEQIFKRYPVNVKVLRPSPGDYVKPGEVEEEVRKSEYKLVALTHVETST GVREPVKDVINKIRKYVELIVVDGVSSVGAEEVKAEE NVDVYLTASQKALGSAAGLGLLLLSPKALSIL DSQNSIAGYYLDLRNWLPVMRGAEEGKAAYFATPPVHVILQLAEAFRLIEKEGIENRIKRHTMVASAIRA GLEALGLEIVARRPESYSNTVTGVILKVADPQKVLAGTVNEGVEFAPGVHPAFKYFRIGHMGWVTPNDAI IAISVIERTLRKLGEPIRFGEGVKAVEEVLFSAR L-Ser¡na amoniaco-Nasa (EC 4.3.1.17) >gi|55980998|ref|YP_144295.1 | L-serina deshidratasa, subunidad alfa [Thermus thermophilus HB8] MPLTLNQLAELSGRASEHVLAEEVEETGTPAEEILARLRERLAVMRDSVRRGLASDAPSVAGLVGKNAKT L EAPDPLQDPLLKRVQAYA^4AV EENARMGRIVAAPTAGSAGTLPGALLGVADHLGIPDEELL·MPLVL·A GGVAKMIGRVIHIAGASGGCQAEIGSSAAMAAAAVTELLGGTPEACAHAAALALQNTLGLVCDPVGGFVE VPCVMRNGFYAVHAVSAASMALAGIRSVIPPDEVVLAMAGIGRLLPLELKETGLGGLADTPTGRRLAEEA LKKT >gi|55980708|ref|YP_144005.1 | L-serina deshidratasa, subunidad beta [Thermus thermophilus HB8] MGLLDMIGPVMVGPSSSHTAGACRLALLARHLLGEKPKRVEFGLHGSFAKTGKGHGTHLALAAGVLGLTP DDERLKESLSLAEREGVE VFKEVELGDVHPNTVRMVLEGEKERLAVTGSSLGGGLVRVFDVDGFEVRIT GSAPTLVIKNVDTPGVVARVARILADDEVNIAYLTVSRKKRGGEAMMSIEVDRPLSEVPLRYLEHLSYIL VRQIPPVMG Alanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.1) >gi|46200072|ref|YP_005739.1 | alanina deshidrogenasa [Thermus thermophilus HB27] MVIGVPREIKTLENRVALTPGGVESLVRRGHTVLVERGAGEGSGLSDAEYARAGAELVGREEAWGAEMVV KVKEPLPEEYGFLREGLILFTYLHLAADRGLTEAMLRSGVTGIAYETVQLPDGTLPLLVPMSEVAGRMAP QVGAQFLE PKGGRGVLLGGVPGVAPASVVILGGGTVGTNAAKIALGMGAQVTILDVNHKRLQYLDDVFG GRVVTLTATEANIKKSVQHADLLIGAVLVPGAíAPKLVTRDMLSLMKEGAVIVDVAVDQGGCVETIRPTT HAEPTYVVDGVVHYGVANMPGAVPRTSTFALTNQTLPYVLKLAEKGLDALLEDAALLKGLNTHKGRLTHP GVAEAFGLPYTPPEEALRG Dihidroxiácido deshidratasa (EC 4.2.1.9) >gi|15899814|ref|NP_344419.1 | Dihidroxi ácido deshidratasa [Sulfolobus solfataricus P2] MPAKLNSPSRYHGIYNAPHRAFLRSVGLTDEEIGKPLVAIATAWSEAGPCNFHTLALARVAKEGTKEAGL SPLAFPTMVVNDNIGMGSEGMRYSLVSRDLIADMVEAQFNAHAFDGLVGIGGCDKTTPGILMAMARLNVP SIYIYGGSAEPGYF GKRLTIEDVHEAIGAYLAKRITENELYEIEKRAHPTLGTCSGLFTANTMGSMSEA LGMALPGSASPTATSSRRVMYV ETGKALGSLIENGI SREILTFEAFENAITTLMA GGSTNAVLHLLA IAYEAGVKLTLDDFNRISKRTPYIASMKPGGDYVMADLDEVGGVPVVLKKLLDAGLLHGDVLTVTGKTMK QNLEQYKYPNVPHSHIVRDVKNPIKPRGGIVILKGSLAPEGAVI VAATNVVKFEGKAKVYNSEDDAFKG VQSGEVSEGEVVIIRYEGPKGAPGMPEMLRVTAAIMGAGLNNVALVTDGRFSGATRGPMVGHVAPEAMVG GPIAIVEDGDTIVIDVESERLDLKLSEEEIKNRLKRWSPPSPRY SGLLAKYASLVSQASMGAVTRPA Piruvato sintasa (1.2.7.1) >gi|15898059|ref|NP_342664.1 | Piruvato sintasa cadena alfa (Ferredoxina Pirúvica oxidorreductasa cadena alfa) (porA-1) [Sulfolobus solfataricus P2] MQVLKRKVLALVGNHAVAYAVKQAKPKVLAVFPITPQTTMLEKLSEYISSEELKAELI VESEHSALASI YGAALAGARVFTATSSQGLLYMTEMIYWAGGQRVPIVAAVATRAIAEPWSI DDHQDFVSKRDAIWIQIM AENVQEAYDMTIQAFRISEDERVILPVMMGFDGFILTHTMERIEVLEDNEVDNFLPPRQFNLIDFSDPIA IGPIATPEEYIKYRYEAMKAMERAKGVIEEIMGEYERISGRKQHGLVECYKCEDAKYVFVTMGAWSGDGK AAVDRLRDSGVKTGLLKIRVFRPFPKEKVEEYLRSMKGVVVFDRAYSYGYGGILVNEI AALYGYRVPVY SVVAGIGGKDVRPRHFQKVIEDLINDNLEEERWLF >gi|15898058|ref|NP_342663.1 | 2-cetoisovalerato ferredoxina oxidorreductasa subunidad beta [Sulfolobus solfataricus P2] MAVLSSQVTPKRMPKFYRGNAACPGCPIPKELDVALEVLGNKTVLVVPASCTTIIMGDTNGMPSTVPVVH SAFGAAAAIGSGIVRSLRMRGDNDAIVAVWAGDGSTGDIGFAAVSGAAERNEDILYICYDNEAYMNTGIQ RSGLTPKGAWTTTTPEGKREVKKPLPFIIAEHKVPYVATASIAYIYDYEAKMRKAKQIRGFRYIHLLSPC PPGWRFDSKLTIDIAKLAVETGVWPLFEIENGEFKLTSVSKTLVEK NR PVAEYLKLQGRF QLTEEQI KGIQEEIDEM EEIKRLIKK >gi|15898061 |ref|NP_342666.1 | Piruvato sintasa cadena gamma (Ferredoxina pirúvica oxidorreductasa cadena gamma) (porG-1) [Sulfolobus solfataricus P2] MEYYNCDKMTLIELALRGRGGQGIVTAGELMTKAMVLEDKYAQSIPFFGGERRGAPVVSFVRLSDKPILL HREVYNPDGVAIFDVSMIQLINVTEGLKENGFLLLNTNTPKRIWKNEYVVDATNIAKELGLIVAG AIVN TAMIGALARILGQPSLHSLEEAVKEEFPGKIGELNAEAVEIGYKEVKRVD >gi|15898912|ref|NP_343517.1 | Piruvato sintasa cadena delta (Ferredoxina pirúvica oxidorreductasa cadena delta) (tipo porD) [Sulfolobus solfataricus P2] MGVKDEVKYVEIVYRGIFQKRLAKYIAEGIVYTAREMGRPALSFGRYGDSPERNGVPAKYYVGIGDGVNE EDLIGYSTRVEPDLVDVIIVLDDTLLKGVES AWQGVQPINLKLKSNGTMLVTSTKRINELLKMIPKKDF NWTLGVIKTEPSFSGLWAFKDDLTMEKV GGLAKLRPDIIDLDHLLKYVTKKQDANKRVSAVREAYSSVD YRTVM GEGIDFVYNPPRLLTWQEMLEGTVIPAVPRGKRNELFKRGTTKFERPTVDFDTCIKCKLCWVYC PDECFDETPDGYYDIAYDYCVGCGICAEVCPVKDCIVMVDESMFTDYRRPYEM KEDKAKYKEWLKTVRQ AR ERVYVPGLGR NADH ferrodoxina reductasa (1.18.1.3) >gi|15898077|ref|NP_342682.1 | componente ferredoxina NAD (+) reductasa del sistema de tolueno 1 ,2-dioxigenasa (todA) [Sulfolobus solfataricus P2] MKCEYLIIGSGIAGYNALKELLQIKPNSRIIMITSDKYYPYDRPPLSKDYLKGKLEKDMLFFESDDFYKR DNLEVMLNKSVERIDANLKEAILNDGSVISFDKALISTGGRPRRLNIPGSENALYLRSLDDADRIREAAS KGKNALIIGAGFIGVEVASSLITLGV TT VEVMPYIWNTFVDEKVSRVIQQYLESKGINFILNESVKEI QGKIATTSSGRKIEADMFLIAVGISPNVELAQRSGMQVDNGIVVNEYLETSARDIYAAGDIANIFDPREG KRKRIEHWNNAEYTGKLAARNMAGSREAYNFISSIWSDIFDLHIESAGETRNYDEYIIRGKFELERPRFS VIYLKGG11KGYLAINRNV EIIALNKLIQKQADVSSKRDKLADESFDLQKLLI Acetolactato sintasa (2.2.1.6) (subunidad grande) >gi115897497 |ref|NP_342102.11 Acetolactato sintasa subunidad catalítica [Sulfolobus solfataricus P2] MPTGARILVDSLKREGVKVVFGIPGLSNMQIYDAFVEDLANGELRHVLMRHEQAAAHAADGYARASGVPG VCTATSGPGTTNLTTGLITAYWDSSPVIAITGNVPRSVMGKMAFQEADAMGVFENVTKYVIGIKRIDEIP QWI NAFYIATTGRPGPVVVDIPRDIFYEKMEEIKWPEKPLVKGYRDFPTRIDRLALKKAAEILINAERP IILVGTGVVWANATPEVLELAELLHIPIVSTFPGKTAIPHDHPLYFGPMGYYGRAEASMAALESDAMLVV GARFSDRTFTSYDEMVETRKKFIMVNIDPTDGEKAIKVDVGLYGNAKIILRELIKAIITLGQKRDKSAWI KRVKEYKEYYSQFYYTEENGKLKPWKIMKTIRQSLPRDAIVTTGVGQHQM AEVF EVLEPRTFLTSSGM GTMGFGLPAAMGAKLARPDKIVVDLDGDGSFL TGTNLATAVDEHIPVISVIFDNRTLGLVRQVQDLFFG RRIVGVDYGPSPDFVKLAEAFGALGFNATTYEEIEKSIKSAIKEDIPAVIRVPVDKEELALPTLPPGGRL KQVILRDPRKSS Cetoácido reductoisomerasa (1.1.1.86) >gi 115897495 | ref | NP_342100.11 cetoácido reductoisomerasa [Sulfolobus solfataricus P2] MKCTSKIYTDNDANLDLIKGKRIAVLGYGSQGRAWAQNLRDSGLNVVVGLEDLGKSWELAKSDGITPLHT DAVKDADIIIFLVPDMVQRTLWLESVQPYMKKGADLVFAHGFNIHYKLIDPPKDSDVYMIAPKGPGPTV REYYKAGGGVPALVAVHQDVSGTALHKALAIAKGIGATRAGVIPTTFKEETETDLFGEQVILVGGIMELM RAAFETLVEEGYQPEVAYFETINELKMLVDLVYEKGISGMLKAVSDTAKYGGMTVGKFVIDESVRKRMKE ALQRIKSGKFAEEWVEEYGRG PTVVNGLSNVQNSLEEKIGNQLRDLVQKGKPKS Alcohol Deshidrogenasa (1.1.1.1) >gi | 20502556 | dbj | BAB91411.1 | alcohol deshidrogenasa [Flavobacterium frigidimaris ] MLPKTMKAAVIREFGSLL IEEVEVKRPGRNEILVKVIASGVCHTDLHAVEGDWPVKPKMPLIPGHEAVG YVVAVGQEVKNVKEGDAVGVPWLYSACGGCDQCITGWETLCDTQQNGGYSVDGGFAEYVIADARYVGLLP SNVNFMEMAPILCAGVTVYKGLKETEVKPGEWVAISGIGGLGHVAVQYAKAMGMHVAAIDVADDKLDLAK KLGADLVVNAKNQNPGEFLKKEVGGMHGALITAVSPIAFKQGLETLRRKGTMALNGLPPGNFDLSIFDTV LNRITIRGSIVGTRKDMKEAIEFAVEGKVKATVTPAKLENINEVFDKMK GQIEGRVVLEIAKA Alfa-acetolactato descarboxilasa (4.1.1.5) >gi | 113592 | sp | P23616.1 I ALDC_BREBE NombreRec: Completo=Alfa-acetolactato descarboxilasa; Corto=ALDC; Marcadores: Precursor MKKNIITSITSLALVAGLSLTAFAATTATVPAPPAKQESKPAVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGD LTLKDLKLRGDMGLGTINDLDGEMIQ GTKFYQIDSTG LSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQD YNQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKKQSEFEFKNVKGTLIGFYTP NYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFDNANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQA ESERK Alcohol deshidrogenasa (1.1.1.1 o 1.1.1.4) >gi | 18978332 | ref | NP_579689.1 | aldosa reductasa [Pyrococcus furiosus DSM 3638] MKRVNAFNDLKRIGDDKVTAIGMGT GIGGRETPDYSRDKESIEAIRYGLELGMNLIDTAEFYGAGHAEE IVGEAIKEFEREDIFIVSKVWPTHFGYEEAKKAARASAKRLGTYIDLYLLHWPVDDFKKIEETLHALEDL VDEGVIRYIGVSNFNLELLQRSQEVMRKYEIVANQVKYSVKDRWPETTGLLDYMKREGIALMAYTPLEKG TLARNECLAKIGE YGKTAAQVALNYLI EENVVAIPKASNKEHLKENFGAMGWRLSEEDREMARRCV Diol deshidratasa (4.2.1.28) >gi | 11633 19 | ref | YP_795721.1 | propanodiol deshidratasa, subunidad pequeña [Lactobacillus brevis ATCC 367] MSEIDDLVAKIVQQIGGTEAADQTTATPTSTATQTQHAALSKQDYPLYSKHPELVHSPSGKALNDITLDN VLNDDIKANDLRITPDTLRMQGEVANDAGRDAVQRNFQRASELTSIPDDRLLEMYNALRPYRSTKAELLA ISAELKDKYHAPVNAGWFAEAADYYESRKKLKGDN >gi I 116334195 I ref| YP_795722.1 I diol deshidratasa subunidad media [Lactobacillus brevis ATCC 367] MAQEIDENLLRNIIRDVIAETQTGDTPISFKADAPAASSATTATAAPVNGDGPEPEKPVDWFKHVGVA P GYSRDEVVIAVAPAFAEVMDHNLTGISHKEILRQMVAGIEEEGLKARIVKVYRTSDVSFCGAEGDHLSGS GIAIAIQSKGTTIIHQKDQEPLSNLELFPQAPVLDGDTYRAIGKNAAEYAKGMSPSPVPTVNDQMARVQY QALSALMHI ETKQVVMGKPAEQIEVNFN >gi| 116334196|ref|YP_795723.1 | propanodiol deshidratasa, subunidad grande [Lactobacillus brevis ATCC 367] MKRQ RFEELEKRPIHLDGFVKEWPEEGFVAMMGPNDPKPSIKIENG VTEMDSKPAADFDLIDLYIA Y GIKLENAEKVMAMDSTKIAN LCDPNVPRKDIIEITTAMTPAKAEEVISKLNFAEMIMATQKMRPRRTPA TQCHVTNIRDNPVQIAADAADAALRGFPEQETTTAVARYAPLNAISLMVGAQTGRPGVITQCSVEEAEEL SLGMRGFTGYAETISVYGTDKVFTDGDDTP SKGFLASCYASRGLKMRFTSGSGSEVMMGYTEGKSMLYL ESRCIFITKASGVQGLQNGGVSCIGIPGSVPSGIRSVLGENLLCMMLDLECASANDQAFSHSDMRRTERL LGQFIAGTDYISSGYSSTPNYDNTFAGSNTDGLDYDDYYVMERDLAINGGIHPVDEQTIIKARNKAARAL QGVFEDLGLPKITDEEVEAATYANTSKDMPERNMVEDMKAAQDLMDRGITGVDIVKALFNHGFKDVAQAV LDLQKQKVCGDFLQTSAIFDSK HVISAVNDANDYQGPGTGYRLEEDTEEWERIKNLPFAIDPQNMQL

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la producción de un compuesto orgánico diana a partir de glucosa, un oligómero o polímero que contiene glucosa, una hexosa monomérica no glucosa o un derivado de azúcar polimérico por un sistema enzimático sin células, caracterizado porque comprende la conversión de glucosa a piruvato como un producto intermedio en el que no sucede producción neta de ATP y en el que la ruta de reacción funciona completamente sin ATP y/o ADP como cofactores.

2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el compuesto orgánico diana es etanol, un monoalcohol de cuatro carbonos, en particular n-butanol, iso-butanol, 2-butanol u otro compuesto orgánico derivable de piruvato.

3. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el procedimiento de producción se realiza en un sistema líquido que comprende dos fases separadas y el compuesto orgánico diana está principalmente presente en, o forma, una de las fases separadas y el compuesto orgánico diana se recoge de la fase separada.

4. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se añade un disolvente orgánico para establecer las dos fases separadas.

5. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el compuesto fuente de carbono se introduce continuamente en el proceso y el compuesto orgánico diana se retira continuamente.

6. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el sistema enzimático comprende las siguientes enzimas, preferentemente para la conversión de glucosa a piruvato: glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.47), gluconolactonasa (EC 3.1.1.17), gluconato deshidratasa (EC 4.2.1.39), 2-ceto-3-desoxi gluconato aldolasa (EC 4.1.2.14), aldehido deshidrogenasa (EC 1.2.1.3), glicerato deshidrogenasa (EC 1.1.1.29) o Hidroxipiruvato reductasa (EC 1.1.1.81), serina-piruvato transaminasa (EC 2.6.1.51), L-serina amoniaco-liasa (EC 4.3.1.17) y alanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.1).

7. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el sistema enzimático comprende las siguientes actividades enzimáticas, preferentemente para la conversión de glucosa a piruvato: glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.47), gluconolactonasa (EC 3.1.1.17), gluconato deshidratasa (EC 4.2.1.39) 2-ceto-3-desoxi gluconato aldolasa (EC 4.1.2.14) • aldehido deshidrogenasa (EC 1.2.1.3) y glicerato deshidratasa (EC 4.2.1.).

8. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se produce etanol a partir de glucosa por un sistema enzimático que comprende 11, 10, 9, 8, 7 o menos enzimas.

9. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se produce n-butanol a partir de glucosa por un sistema enzimático que comprende 17, 16, 15 o menos enzimas.

10. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se produce iso-butanol por un sistema enzimático que comprende 14, 13 o menos enzimas.

11. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se produce 2-butanol por un sistema enzimático que comprende 13 o menos enzimas. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describe un procedimiento enzimático para la producción de compuestos químicos a partir de fuentes de carbono. En particular, de acuerdo con un aspecto, se desvela un procedimiento para la producción de un compuesto orgánico diana a partir de una fuente de carbono por un sistema enzimático sin células. 1/1 Figura 1 : Esquema del procedimiento I II III IV