CN107663517B - 一种l-乳酸催化反应体系及l-乳酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种L‑乳酸催化反应体系及L‑乳酸的制备方法，所述L‑乳酸催化反应体系含有葡萄糖脱氢酶、二羟酸脱水酶、2‑酮‑3‑脱氧葡萄糖酸醛缩酶、甘油醛脱氢酶和L‑乳酸脱氢酶，利用所述反应体系的5个酶，以葡萄糖为原料，在一个反应器中进行级联酶促催化反应即可得到L‑乳酸，不需要添加ATP。

Description

一种L-乳酸催化反应体系及L-乳酸的制备方法
技术领域
本发明涉及L-乳酸的酶催化生产领域，尤其是一种L-乳酸催化反应体系及L-乳酸的制备方法。
背景技术
乳酸又名α-羟基丙酸，因含一个不对称碳原子，分为D-乳酸和L-乳酸。乳酸在食品、医药、生物降解塑料和化妆品行业有较好的应用。乳酸在食品业中的应用主要是作为酸味剂的使用，并且在酿造工业作为抑菌剂和风味调节剂使用。乳酸在医药行业可以直接配制成药，而乳酸盐可作为消毒剂使用。因为L-乳酸中含有羟基和羧基，因此有自动酯化能力，脱水聚合成聚L-乳酸，高度光学异构的聚L-乳酸在骨外科、人造手术缝合线、血管外科及药物缓释材料方面都有良好的应用前景。经研究发现，以乳酸为原料合成的乳酸聚合物具有较好的生物降解性，因此可以作为新型环保材料，具有广泛的市场前景，也符合我国可持续发展，建设环境友好型社会的战略和理念。因为乳酸的钠盐和钙盐具有较好的保湿效果，并且可以改善皮肤组织结构，因此乳酸在化妆品行业有着广泛的应用。到目前为止，乳酸的生产方法主要有发酵法、化学合成法和酶法。发酵法主要是以糖源为底物通过菌体代谢生产乳酸，主要有同型和异型乳酸菌发酵，因为乳酸菌对生长环境的要求苛刻，反应过程不易控制，成为发酵法生产乳酸的限制因素。化学合成法生产乳酸主要有乳腈法、丙烯腈法和丙酸法。以乳腈法为例，该法是以乙醛和氢氰酸为原料，经过粗乳酸、蒸馏提纯、浓硫酸水解等步骤生产乳酸，生产过程产生大量的有毒有害物质，对环境危害较大，不利于可持续发展。酶法主要有氯丙酸酶法转化和丙酮酸酶法转化。氯丙酸酶法是以DL-2-氯丙酸为底物生产L或D-乳酸，该法底物较贵不易于工业化生产。因此需要开发一种投资成本低，转化率高，无污染的新型生产方式进行乳酸的生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-乳酸催化反应体系。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供应用上述L-乳酸催化反应体系的L-乳酸的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种L-乳酸催化反应体系，含有葡萄糖脱氢酶、二羟酸脱水酶、2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶、甘油醛脱氢酶和L-乳酸脱氢酶。
优选地，上述L-乳酸催化反应体系，每1mL反应体系中酶的添加量为：1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶。
上述L-乳酸催化反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换。
利用上述反应体系所提到的5个酶，以葡萄糖为原料，在一个反应器中进行级联酶促催化反应得到L-乳酸，具体反应过程为：
由葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase，EC 1.1.1.47)催化葡萄糖生成葡萄糖酸；
由二羟酸脱水酶(Dihydroxy acid dehydratase，EC 4.2.1.9)催化葡萄糖酸生成2-酮-3-脱氧葡萄糖酸；
由2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶(2-keto-3-desoxygluconate aldolase，EC4.1.2.14)将2-酮-3-脱氧葡萄糖酸转化为甘油醛和丙酮酸；
由甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde dehydrogenase，EC 1.2.1.3)催化甘油醛生成甘油酸；
由二羟酸脱水酶(Dihydroxy acid dehydratase，EC 4.2.1.9)催化甘油酸生成丙酮酸；
再由L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase，EC 1.1.127)催化丙酮酸生成L-乳酸。
优选地，上述L-乳酸的制备方法，所述多酶反应体系还含有以下各成分：辅酶NAD+，缓冲液和二价镁离子。
优选地，上述L-乳酸的制备方法，缓冲液为HEPES缓冲液。
优选地，上述HEPES缓冲液浓度为50-400mM，pH值7.0；二价镁离子浓度为5mM。
本发明的有益效果：
所述L-乳酸催化反应体系在一个多酶反应体系中，不需要添加ATP，通过体外多酶催化，将葡萄糖转化为L-乳酸。由于最后一步L-乳酸脱氢酶催化的反应为不可逆反应，理论上L-乳酸具有很高得率。我们通过过程优化，确定了多酶反应途径中酶和辅酶的用量，缓冲液的类型和浓度，使L-乳酸的得率接近理论值。所述L-乳酸的制备方法具有操作简便，原料利用率高、L-乳酸产率高，生产成本低，无污染等优点，可以实现L-乳酸的规模化生产。
附图说明
图1为葡萄糖转化生成L-乳酸的体外多酶催化途径的示意图；其中，GDH，葡萄糖脱氢酶；DHAD，二羟酸脱水酶；KDGA，2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶；ALDH，甘油醛脱氢酶；L-LDH，L-乳酸脱氢酶。
图2为SDS-PAGE检测酶的表达与纯化图，SDS-PAGE检测5个关键酶，其中，SsGDH葡萄糖脱氢酶来源于Sulfolobus solfataricus；SsDHAD二羟酸脱水酶来源于Sulfolobussolfataricus；SacKDGA 2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶来源于Sulfolobusacidocaldarius；TaALDH甘油醛脱氢酶来源于Thermoplasma acidophilum；TmLDH来源于Thermotoga maritima；T，大肠杆菌细胞裂解液；S，裂解液上清；H，经热处理的裂解液上清；Ni，经镍柱纯化的酶。
图3为乳酸以及中间产物的检测图，其中，Glucose，葡萄糖；Gluconate，葡萄糖酸；Glyceraldehyde，甘油醛；Glycerate，甘油酸；Pyruvate，丙酮酸；Lactate，乳酸。葡萄糖的出峰时间在9.346分钟，葡萄糖酸的出峰时间在9.322分钟，甘油醛的出峰时间在11.633分钟，甘油酸的出峰时间在11.031分钟，丙酮酸的出峰时间在9.818分钟，L-乳酸的出峰时间在12.971分钟。
图4为初始反应条件下L-乳酸的产量与产率。其中■代表葡萄糖含量随时间的变化；●代表乳酸的产量随时间的变化；
Figure BDA0001453131780000041
代表乳酸对葡萄糖的转化率。
图5为反应体系中所需酶添加量的优化。图A为葡萄糖脱氢酶添加比例的优化，图B为葡萄糖酸脱水酶添加比例的优化，图C为2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶添加比例的优化，图D为甘油醛脱氢酶添加比例的优化，图E为L-乳酸脱氢酶添加比例的优化。
图6为反应体系中所需辅酶NAD+添加量的优化。
图7为反应体系中所需缓冲液浓度的优化。
图8为反应体系中所需缓冲液类型的优化。
图9为在优化的反应体系条件下L-乳酸的产量与产率。其中■代表葡萄糖含量随时间的变化；●代表乳酸的产量随时间的变化；
Figure BDA0001453131780000051
代表乳酸对葡萄糖的转化率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。
实验材料
D-glucose,Sigma aldrich公司产品，产品编号：V900392；
NAD+，Sigma aldrich公司产品，产品编号：N3014；
pET20b，pET28a载体，Novagen，Madison，WI；
大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；
本发明中的所有酶都可以按照基因工程方法通过原核表达获得；
实验例1.体外多酶催化将葡萄糖转化为L-乳酸
将葡萄糖脱氢酶、二羟酸脱水酶、2-酮-3脱氧葡萄糖酸醛缩酶、甘油醛脱氢酶、二羟酸脱水酶和L-乳酸脱氢酶进行组合建立L-乳酸催化反应体系。
通过L-乳酸催化反应体系将葡萄糖转化为L-乳酸(图1)，包括：(1)葡萄糖脱氢酶(GDH，EC 1.1.1.47)，催化葡萄糖生成葡萄糖酸；(2)二羟酸脱水酶(DHAD，EC 4.2.1.9)，催化葡萄糖酸生成2-酮-3-脱氧葡萄糖酸(3)2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶(KDGA，EC4.1.2.14)，催化2-酮-3-脱氧葡萄糖酸生成甘油醛和丙酮酸；(4)甘油醛脱氢酶(ALDH,EC1.2.1.3)，催化甘油醛生成甘油酸；(5)二羟酸脱水酶(DHAD，EC 4.2.1.9)，催化甘油酸生成丙酮酸；(6)L-乳酸脱氢酶(L-LDH,EC 1.1.1.27)，催化丙酮酸生成L-乳酸。由于最后一个酶反应是不可逆反应，所以该酶催化体系理论转化率能接近100％。
在本发明中葡萄糖脱氢酶来源于Sulfolobus solfataricus，基因在NCBI上的编号为AJ012093，二羟酸脱水酶来源于Sulfolobus solfataricus，基因在NCBI上的编号为CP011057，2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶来源于Sulfolobus acidocaldarius，基因在NCBI上的编号为CP006977，甘油醛脱氢酶来源于Thermoplasma acidophilum，基因在NCBI上的编号为TA_RS04170，L-乳酸脱氢酶来源于Thermotoga maritima,基因在NCBI上的编号为TM1687。这五个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过SimpleCloning的方法克隆至pET20b或pET28a载体(Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET28a-SsGDH，pET28a-SsDHAD，pET28a-SacKDGA，pET28a-TaALDH，pET20b-TmLDH。这些质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中进行蛋白表达，并进行蛋白的纯化，纯化结果如图2所示。
在一个1mL反应体系中含有100mM的HEPES缓冲液(pH7.0),5mM的二价镁离子，5mMNAD+，1U/mL的葡萄糖脱氢酶，1U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶，27.75mM的葡萄糖，在50℃进行催化反应，反应时间为20个小时。
L-乳酸的检测采用高效液相色谱(HPLC)进行检测。取反应样品65μL，加入35μL1.88mol/L的高氯酸进行处理，然后加入5mol/L的KOH调节pH至中性。离心取上清，加入终浓度为5mM的硫酸，采用HPLC检测L-乳酸的浓度。
在整个反应体系中的中间产物基本上都可以使用HPLC进行检测，如图3和表1所示，葡萄糖的出峰时间在9.346分钟，葡萄糖酸的出峰时间在9.322分钟，甘油醛的出峰时间在11.633分钟，甘油酸的出峰时间在11.031分钟，丙酮酸的出峰时间在9.818分钟，乳酸的出峰时间在12.971分钟。有物质出峰时间可知，HPLC可以很好的对乳酸进行定量分析。
Figure BDA0001453131780000071
葡萄糖的浓度可用酶法测定。葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD)作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)；然后过氧化物酶(POD)催化过氧化氢，色原物质生成红色醌亚胺类化合物，颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。通过测定吸光度来确定葡萄糖的浓度。
反应结束后，如图4所示，反应时间为12小时，L-乳酸的浓度为27.78mM，由于1mol的葡萄糖能够产生2mol的乳酸，对葡萄糖的转化率为50％。反应时间为20个小时，L-乳酸的终浓度是31.64mM，对葡萄糖转化率为57％。
实验例2.体外多酶催化将葡萄糖转化为L-乳酸(酶浓度的确定)
在一个1mL反应体系中含有100mM的HEPES缓冲液(pH7.0),5mM的二价镁离子，5mMNAD+，27.75mM的葡萄糖，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时。分别改变不同酶添加的比例，最终确定反应体系中所需酶的添加比例。
反应结束后，如图5所示。首先对葡萄糖脱氢酶进行添加量的优化，只改变葡萄糖脱氢酶的添加量，反应体系中其他组分的添加量不再改变，反应结束后，通过检测L-乳酸的浓度，确定葡萄糖脱氢酶的最优添加量确定为1U/mL。在确定葡萄糖脱氢酶的添加量之后，进行二羟酸脱水酶的添加量的优化。在其他组分添加量不变的前提下，通过改变二羟酸脱水酶的添加量，来检测乳酸的生成量，反应结束后，通过检测L-乳酸的浓度，确定二羟酸脱水酶的最优添加量确定为2U/mL。在确定葡萄糖脱氢酶的添加量为1U/mL，二羟酸脱水酶的添加量为2U/mL后，不改变反应体系其他组分的添加量，进行2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶添加的优化，反应结束后，通过检测L-乳酸的浓度，确定2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶的最优添加量确定为1U/mL。在确定葡萄糖脱氢酶的添加量为1U/mL，二羟酸脱水酶的添加量为2U/mL，2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶的添加量为1U/mL后，不改变反应体系其他组分的添加量，进行甘油醛脱氢酶添加量的优化。反应结束后，通过检测L-乳酸的浓度，确定甘油醛脱氢酶的最优添加量为1U/mL。在确定葡萄糖脱氢酶的添加量为1U/mL，二羟酸脱水酶的添加量为2U/mL，2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶的添加量为1U/mL，甘油醛脱氢酶的添加量为1U/mL后，不改变反应体系其他组分的添加量，进行L-乳酸脱氢酶添加量的优化。反应结束后，通过检测L-乳酸的浓度，确定L-乳酸脱氢酶的添加量为1U/mL。通过酶添加比例的优化，最终确定在1mL反应体系所需酶的添加量为1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶。反应12小时后，L-乳酸的终浓度是37.7mM，对葡萄糖转化率为68％。
实验例3.体外多酶催化将葡萄糖转化为L-乳酸(辅酶浓度的确定)
在确定反应体系中所需酶的添加量之后，进行辅酶NAD+浓度的优化。
在一个1mL反应体系中含有100mM的HEPES缓冲液(pH7.0),5mM的二价镁离子，27.75mM的葡萄糖，1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时。改变辅酶NAD+添加的比例为0-10mM，最终确定反应体系中所需辅酶的添加比例。
反应结束后，由图6可知，当辅酶NAD+的添加量为5mM后乳酸的产率并没有较大的增加。综合考虑，确定辅酶NAD+浓度为5mM。反应12小时后，L-乳酸的终浓度是37.6mM，对葡萄糖转化率为68％。
实验例4.体外多酶催化将葡萄糖转化为L-乳酸(缓冲液浓度的确定)
在确定反应体系中所需酶和辅酶的添加量之后，进行缓冲液浓度的确定。
在一个1mL反应体系中含有5mM的二价镁离子，5mM NAD+，27.75mM的葡萄糖，1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时。分别选择50-400mM的HEPES缓冲液。
反应结束后，由图7可知，当使用不同浓度的HEPES缓冲液时，乳酸的产率也不相同。综合考虑，确定使用HEPES缓冲液，浓度为200mM(pH7.0)。反应12小时后，L-乳酸的终浓度是44.1mM，对葡萄糖转化率为79％。
实验例5.体外多酶催化将葡萄糖转化为L-乳酸(缓冲液的类型)
在确定反应体系中所需酶和辅酶的添加量之后，进行缓冲液类型的确定。
在一个1mL反应体系中含有5mM的二价镁离子，5mM NAD+，27.75mM的葡萄糖，1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时。分别选择HEPES缓冲液，P I PES缓冲液，MOPS缓冲液，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，浓度全部为200mM(pH7.0)。
反应结束后，由图8可知，当使用不同类型的缓冲液时，乳酸的产率也不相同，其中使用MOPS缓冲液时，乳酸的产率最低，使用HEPES缓冲液时，乳酸的产率最高。综合考虑，确定使用HEPES缓冲液，浓度为200mM(pH7.0)。反应12小时后，L-乳酸的终浓度是43.3mM，对葡萄糖转化率为78％。
实验例6
通过反应体系的优化，最终确定反应体系所加的酶的比例为在1mL反应体系所需酶的添加量为1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶，辅酶的浓度为5mM,缓冲液为200mM HEPES(pH7.0)缓冲液，葡萄糖浓度为27.75mM，二价镁离子为5mM，50℃进行最终的反应，结果如图9所示。反应时间为12小时，L-乳酸的浓度为48.74mM,对葡萄糖的转化率为87％(由于和实验例5在反应时间12小时转化率有所差别，是因为在进行反应时使用了不同批次的酶，并且结果是平行样的平均值，导致结果有所差别)。反应时间为20h时，L-乳酸的终浓度是49.76mM，对葡萄糖转化率为90％。
上述参照实施例对该一种L-乳酸催化反应体系及L-乳酸的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种L-乳酸催化反应体系，其特征在于：含有葡萄糖脱氢酶、二羟酸脱水酶、2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶、甘油醛脱氢酶和L-乳酸脱氢酶,所述葡萄糖脱氢酶来源于Sulfolobus solfataricus，基因在NCBI上的编号为AJ012093，二羟酸脱水酶来源于Sulfolobus solfataricus，基因在NCBI上的编号为CP011057，2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶来源于Sulfolobus acidocaldarius，基因在NCBI上的编号为CP006977，甘油醛脱氢酶来源于Thermoplasma acidophilum，基因在NCBI上的编号为TA_RS04170，L-乳酸脱氢酶来源于Thermotoga maritima ,基因在NCBI上的编号为TM1687，其中，每1 mL反应体系中酶的添加量为：1 U/mL 的葡萄糖脱氢酶，2 U/mL的二羟酸脱水酶，1 U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1 U/mL的甘油醛脱氢酶，1 U/mL的L-乳酸脱氢酶。
2.一种L-乳酸的制备方法，其特征在于：利用权利要求1所述反应体系的5个酶，以葡萄糖为原料，在一个反应器中进行级联酶促催化反应得到L-乳酸，具体反应过程为：
由葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸；
由二羟酸脱水酶催化葡萄糖酸生成2-酮-3-脱氧葡萄糖酸；
由2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶将2-酮-3-脱氧葡萄糖酸转化为甘油醛和丙酮酸；
由甘油醛脱氢酶催化甘油醛生成甘油酸；
由二羟酸脱水酶催化甘油酸生成丙酮酸；
再由L-乳酸脱氢酶催化丙酮酸生成L-乳酸；
所述反应体系还含有以下各成分：辅酶NAD+，HEPES缓冲液和二价镁离子，所述HEPES缓冲液浓度为50-400 mM，pH值7.0；二价镁离子浓度为5 mM。
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