CN114107408A - 一种高丝氨酸和苏氨酸生物合成途径的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高丝氨酸和苏氨酸非天然生物合成新途径的构建，属于工业生物技术领域。所述非天然生物合成途径中包含甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶，该途径可以甲醇与丙酮酸为底物，合成高丝氨酸或苏氨酸。既可以通过构建体外多酶催化体系，也可以通过在微生物细胞体内通过途径组装，实现以甲醇与丙酮酸为碳源合成高丝氨酸或苏氨酸，而丙酮酸在微生物细胞体内可以葡萄糖为底物通过糖酵解合成，从而实现以甲醇与葡萄糖为碳源合成高丝氨酸或苏氨酸。本发明将高能量密度的甲醇一碳化合物引入高丝氨酸和苏氨酸合成途径中，理论上可实现200%的糖酸摩尔转化率，具有极大的应用前景。

Description

一种高丝氨酸和苏氨酸生物合成途径的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及氨基酸工业生产技术领域，具体涉及高丝氨酸和苏氨酸生物合成途径的构建方法及应用，更具体以甲醇/甲醛和葡萄糖/丙酮酸为共底物成产高丝氨酸和苏氨酸的方法，属于工业生物经济与制造领域。
背景技术
高丝氨酸和苏氨酸是具有重要用途的氨基酸，主要用于医药、农药前体、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。随着氨基酸市场需求的不断增加，行业竞争也日趋激烈。生产菌株是工业发酵的核心，各大苏氨酸生产企业都在积极地提升菌株发酵性能，降低生产成本，以保持市场的竞争力。如何利用现代合成生物学理念，设计和构建新的高效生产菌株，申请专利获得知识产权保护，将是现代氨基酸企业生存和发展的基本保障。
目前，高丝氨酸和苏氨酸生产菌株主要是基于大肠杆菌构建的细菌细胞工厂，高丝氨酸和苏氨酸的天然生物合成过程共利用一条途径，而且高丝氨酸是苏氨酸的前体。在大肠杆菌中，高丝氨酸和苏氨酸天然合成途径起始于糖酵解途径的磷酸烯醇式丙酮酸，它经过羧化反应固定一个二氧化碳，成为草酰乙酸，然后再经过三步反应生成天冬氨酸半醛，天冬氨酸半醛继而可以经过天冬氨酸激酶I、II（ThrA、MetL）参与的一步反应生成高丝氨酸，高丝氨酸则经过高丝氨酸激酶（ThrB）、苏氨酸合成酶（ThrC）参与的两步反应进一步生成苏氨酸。现有的高丝氨酸和苏氨酸工程菌株的构建就是基于这些天然生物合成途径，进行了一系列的代谢工程改造，主要的策略包括：去除旁路途径从而增强前体供应，增强氨基酸的转运，解除代谢物对酶的反馈抑制/阻遏，以及动态调控生长与目标代谢物的时序关系等。
通过经典的代谢工程和基因表达的动态调控，高丝氨酸和苏氨酸生物合成能力得到了很大的提升，然而我们也注意到，依赖于天然的生物合成途径，其提升空间正在逐步靠近理论极限。根据代谢流和计量学分析,苏氨酸天然途径最大理论摩尔得率在100-133%之间（Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine  production. Mol Syst Biol, 2007. 3: 149，），而在2020年发表的一篇文章中实际可达124%( Rebalancing microbial carbon distribution for L-threonine maximization  using a thermal switch system.Metab Eng, 2020. 61: 33-46，)。因此如何另辟蹊径，实现超越天然生物合成途径的理论极限，是未来氨基酸发酵行业的一个重要解决方案。
要实现这一目标，就必须打破原有的生物代谢途径框架，引入新的底物原料和设计新的非天然合成路径。苏氨酸天然合成途径的代谢特点在于：其天然途径中二氧化碳的固定反应及其后的还原反应是一个高能耗和高还原力消耗的过程。一分子葡萄糖如果转化成两分子苏氨酸，则额外需要四分子的NADPH和两分子的ATP，因此最大理论摩尔得率在100-133%之间。如果能够使用其它一碳原料替代低能的二氧化碳，那么就有可能减少对还原力和能量的需求，从而提高葡萄糖发酵生产苏氨酸的得率，解决苏氨酸微生物工业化生产的关键技术瓶颈问题。
另外，近期有研究涉及一种将甲醛掺入生物质中的方法，其中涉及一个7步反应的闭合的高丝氨酸循环。包括以下酶促催化步骤(1)丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)；(2)将由此产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)胺化以产生高丝氨酸；(3)由此产生的高丝氨酸转化为苏氨酸；(4)由此产生的苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛或乙酰辅酶A；(5)由此产生的甘氨酸与甲醛缩合产生丝氨酸；(6)将由此产生的丝氨酸进一步转化为丙酮酸，用作步骤(1)中的底物（WO2021165229A1，20210826）。该循环中高丝氨酸以及苏氨酸均属于中间过渡态，两种物质的目的以及作用在于作为中间过渡物质实将甲醛通过该循环进入生物质，因此两者在体内、体外均未实现累积，也将无法应用于苏基酸的生产制备。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明人进行了一系列的研究探索。甲醇可以经过酶催化反应可转变成多种其它一碳单位，继而被细胞同化利用。由于甲醛的高反应活性，它可以和多种含酮基的中间代谢物反应，从而合成高级代谢产物，由于酮基是胞内代谢产物最为常见的功能基团之一，所以甲醛引发的醛缩反应为本专利利用甲醇替代二氧化碳成为一碳单位提供了启发。本发明人尤其注意到在非天然途径高丝氨酸循环（Homoserine cycle）中（Metab Eng, 2020. 60: 1-13），甲醛可以和糖酵解终端产物丙酮酸进行醛缩反应（ACSCatal, 2017. 7(3): 1707-1711），生成4-羟基二酮丁酸，进而本发明认为这为解决利用二氧化碳的高能量消耗问题提供了研究思路。而且自然界众多一碳原料中甲烷、甲醇、甲醛、一氧化碳的能量密度都比二氧化碳明显高。综合比较，甲醇是一种比较理想的高能量的一碳原料：首先它是液态的，微生物对它的耐受浓度可达20-96 g/L（Improving the  Methanol Tolerance of an Escherichia coli Methylotroph via Adaptive  Laboratory Evolution Enhances Synthetic Methanol Utilization. FrontMicrobiol, 2021. 12(198),doi: 10.3389/fmicb.2021.638426）；而且容易从煤等化工原料廉价制取，因此是一种理想的替代原料。
  基于此，本发明提出了使用化工原料甲醇代替二氧化碳的策略并进行了深入研究，设计了一条非天然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径。在该条途径中，仍利用葡萄糖为主要碳源进行氨基酸发酵，同时使用甲醇做为一碳原料，通过甲醛与丙酮酸的醛缩反应，合成中间代谢产物4-羟基-2-酮丁酸，它再通过转氨反应合成高丝氨酸，高丝氨酸继而可以通过天然途径合成苏氨酸。其中这条途径中，甲醛-丙酮酸醛缩反应及4-羟基-2-酮丁酸转氨反应是非天然反应。预期在葡萄糖发酵的基础上引入甲醇一碳供给途径，可以减少氨基酸合成途径过程中对还原力和能量的需求，从而提高葡萄糖的摩尔转化率，这将会超越天然生物合成途径转化率极限。对于氨基酸工业生产与氨基酸制造经济具有深远意义。
本发明关键在于将在于甲醇这种高能量密度、价格低廉、液态易运输等特点的一碳单元为底物，代替低能的CO2引入苏氨酸合成途径中。 该途径最高可实现200%的糖酸理论摩尔转化，意义在于进一步解决目前苏氨酸天然途径的133%糖酸理论摩尔转化限制。本发明通过实验对上述研究分析的预期进行了验证：本发明以甲醇与丙酮酸为底物，利用新型途径通过体内与体外实验均实现了苏氨酸合成累积，为建立新一代高效的苏氨酸细胞工厂提供途径以及生产技术创新，对氨基酸工业生产将产生重要经济价值。因此本发明在氨基酸工业生产技术以及工业制造领域具有重要突破性。
因此，本发明提供了一种非天然合成途径的高丝氨酸的制备方法，以甲醇和丙酮酸为底物，以包含甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶三种酶的级联酶促催化反应，按下述反应过程进行：
1）甲醇脱氢酶催化甲醇生成甲醛；
2）醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸；
3）转氨酶在存在氨基供体条件下催化4-羟基-2-酮-丁酸生成高丝氨酸。
更进一步地，本发明还包括苏氨酸的制备方法，其上述三个步骤的基础上，进一步包括高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶，构成进一步的级联酶促催化反应，即还包括下述步骤：
4）高丝氨酸激酶与苏氨酸合成酶经过两步反应催化高丝氨酸生成苏氨酸。
通过以上五步反应的组合，构建了以甲醇/甲醛一碳化合物生物合成高丝氨酸进而合成苏氨酸的新型非天然合成途径。该新型途径创新性的将高能量密度的甲醇/甲醛一碳化合物代替低能的CO2引入苏氨酸合成途径中，从而实现200%的糖酸理论摩尔转化。基于该新型途径建立的苏氨酸微生物细胞工厂将突破天然途径的得率极限，降低工业生产成本。
由此，本发明提供一种体外多酶催化体系，该体系包含：甲醇脱氢酶， 醛缩酶，转氨酶,进一步优选地还包括高丝氨酸激酶与苏氨酸合成酶。
利用上述反应体系所提到的5个酶，以甲醇与丙酮酸为原料，谷氨酸为氨基供体，在一个反应器中进行级联酶促催化反应生成苏氨酸，具体反应过程为：
1）甲醇脱氢酶（EC: 1.1.1.6），催化甲醇生成甲醛；
2）醛缩酶（EC: 4.1.2.53），催化甲醛与丙酮酸缩合反应生成4-羟基-2-酮-丁酸；
3）转氨酶（EC: 2.6.1.1），在谷氨酸等氨基供体条件下，催化4-羟基-2-酮-丁酸生成高丝氨酸及α-酮戊二酸；
4）高丝氨酸激酶（EC: 2.7.1.39）与苏氨酸合成酶（EC: 4.2.3.1），催化高丝氨酸生成苏氨酸。
优选地，上述苏氨酸的非天然合成途径，所述多酶反应体系还含有以下各成分：辅酶NAD +，磷酸吡哆醛PLP, ATP，缓冲液和二价镁离子。优选地，上述苏氨酸的非天然合成途径，缓冲液为HEPES缓冲液。
优选地，上述HEPES缓冲液浓度为10 mM，pH值7.5；二价镁离子浓度为5 mM，NAD +浓度为10 mM, PLP浓度为2 mM，ATP浓度为10 mM。
由此，本发明提供所述的体外多酶反应体系以甲醇和丙酮酸为底物合成苏氨酸的方法如下：反应体系中含有HEPES，甲醇，丙酮酸，谷氨酸，甲醇脱氢酶所需辅酶NAD+;醛缩酶所需辅酶MgCl2;转氨酶所需辅酶磷酸吡哆醛PLP;高丝氨酸激酶所需辅酶ATP, 以及甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶，进行催化反应获得高丝氨酸，进一步还包括高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶，进行催化反应，获得苏氨酸。
优选地，反应体系中含有8-12 mM HEPES （pH = 7.5），0.4-0.6 M甲醇，80-120 mM丙酮酸，80-120 mM谷氨酸，甲醇脱氢酶所需辅酶NAD+:8-10 mM，醛缩酶所需辅酶MgCl2 ：4-6 mM,转氨酶所需辅酶磷酸吡哆醛PLP：1-3 mM, 高丝氨酸激酶所需辅酶ATP:8-12 mM, 20-40μM甲醇脱氢酶、3-8μM醛缩酶、3-8μM转氨酶、3-8μM高丝氨酸激酶、3-8μM苏氨酸合成酶，在28-37℃进行催化反应，反应时间为 12-20个小时。
更优选地，反应体系中含有10 mM HEPES（pH =  7.5），0.5 M甲醇，100 mM 丙酮酸，100 mM谷氨酸，甲醇脱氢酶所需辅酶NAD+：10mM，醛缩酶所需辅酶MgCl2 ：5mM,转氨酶所需辅酶磷酸吡哆醛PLP:2 mM,高丝氨酸激酶所需辅酶ATP:10 mM,30μM甲醇脱氢酶、5μM醛缩酶、5μM转氨酶、5μM高丝氨酸激酶、5μM苏氨酸合成酶，在28-32℃进行催化反应，反应时间为15个小时。
其中所述各酶通过构建重组菌株，例如大肠杆菌，并通过表达并纯化获得，纯化方法收集培养后的重组菌株的菌体，超声破碎后，使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
本发明进一步提供一种生产高丝氨基酸的基因工程重组菌株，所述重组菌在宿主细胞中过表达甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶，因而可以制备高丝氨酸。更进一步还包括在所述重组菌株中过表达高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶，因而可以制备苏氨酸。另外，过表达了苏氨酸转运蛋白，用于提高细胞苏氨酸转运能力。
在本发明的一种实施方式中，所述的甲醇脱氢酶MDH可以是吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型的甲醇脱氢酶、NAD依赖型的甲醇脱氢酶或甲醇氧化酶(AOX，alcohol oxidase)。
在本发明的一种实施方式中，所述的醛缩酶根据分类不同，可以是I类醛缩酶：2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶（EC: 4.1.3.16）、也可以为2-脱氢-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶（EC: 4.1.2.53）和5-酮-4脱氧-D-戊二酸醛缩酶（ EC: 4.1.2.20）等II型醛缩酶，以及其他以丙酮酸作为供体，甲醛为受体的醛缩酶。
在本发明的一种实施方式中，所述的转氨酶可以是具有底物广谱性天冬氨酸转氨酶( EC: 2.6.1.1)、支链氨基酸转氨酶（EC: 2.6.1.42）、丙氨酸转氨酶（EC: 2.6.1.2）、ω-转氨酶（EC: 2.6.1.18）以及其他催化氨基酸和α-酮酸之间的可逆转氨作用的转氨酶。
在本发明的一种实施方式中，所述的高丝氨酸激酶以及苏氨酸合成酶可以是宿主天然途径本底的活性酶，也可以是导入的两种活性酶增强对应的突变体。
在本发明的一种实施方式中，选用的宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamnicum）、谷草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、乳酸菌（Lactic acid bacteria）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、甲基营养菌（Methylorubrum extorquens）、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)等微生物细胞。优选大肠杆菌，更优选的是大肠杆菌W3110。
本发明的一种实施方式中，甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶以质粒pTrc99a为表达载体进行共表达。
在本发明的一种实施方式中，高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、苏氨酸转运蛋白以质粒pTrc33a为表达载体进行共表达。
在本发明的一种实施方式中，甲醇脱氢酶的核苷酸序列例如采用如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，醛缩酶的核苷酸序列例如采用如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，醛缩酶融合蛋白核酸序列例如采用如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，转氨酶例如采用来自大肠杆菌（Escherichia coli）的EcAspC（EC: 2.6.1.1)。
在本发明的一种实施方式中，高丝氨酸激酶例如采用来自大肠杆菌（Escherichia  coli）的EcthrB （EC: 2.7.1.39）。
在本发明的一种实施方式中，苏氨酸合成酶例如采用来自大肠杆菌（Escherichia  coli）的EcthrC（EC: 4.2.3.1）。
在本发明的一种实施方式中，苏氨酸转运蛋白例如采用来自大肠杆菌（Escherichia coli）EcRhtC （Gene ID: 948317）。
本发明进一步提供上述基因工程重组菌株在生产高丝氨酸，进一步生产苏氨酸的方法。
在本发明的一种实施方式中，采用本发明所述的重组菌以甲醇为底物生产高丝氨酸的方法如下：
1）种子培养：
根据质粒抗性向LB培养基添加羧苄霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL) 二氨基庚二酸DAP(0.25mM)，挑取单克隆接种至含LB培养基试管，37℃，220r/min过夜培养；
2）发酵培养：
过夜培养获得种子液，以初始OD600  =  0.1转接无机盐培养基，同时添加羧苄霉素(50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)、二氨基庚二酸 DAP(0.25 mM)、高丝氨酸（5 mM），待菌体OD600达到0.4-0.6时，添加0.1 mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续过夜培养。
3）全细胞转化：
离心收集菌体后用无机盐培养基洗涤3次后重悬，菌体浓度稀释为OD600  =  5，将30 mL重悬菌转移至无菌250 mL摇瓶中，同时添加羧苄霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)、二氨基庚二酸 DAP(0.25 mM)，添加初始浓度为0.5 M甲醇或4mM 甲醛，葡萄糖浓度为30 g/L，培养条件：37℃，220rpm，培养24h。
在一个实验中，结果表明添加4 mM甲醛可生成0.024 mM苏氨酸，添加0.5 M甲醇可生成0.011 mM苏氨酸。
本发明提供了一种新型苏氨酸非天然合成途径。该途径包含甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶五种酶元件，通过体外多酶反应体系，以及在重组菌在宿主细胞中过表达5种通路元件酶：甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶、高丝氨酸激酶苏氨酸合成酶两种方案，成功构建了甲醇到苏氨酸转化新型途径。因此，本发明创造性地将高能量密度的甲醇一碳化合物引入高丝氨酸和苏氨酸合成途径中，理论上可实现200%的糖酸摩尔转化率。基于该新型途径建立的高丝氨酸或苏氨酸微生物细胞工厂将突破天然生物合成途径的得率极限，构建的高丝氨酸或苏氨酸工业生产菌株具有非常大的应用价值。
附图说明
图1高丝氨酸/苏氨酸非天然合成途径。
图2本发明的苏氨酸合成新途径体外单步反应产物检测结果。
图3本发明的苏氨酸合成新途径体外多步反应产物检测结果。
图4菌株W3110△frmA△asd  PCR验证。
图5甲醇/甲醛为底物生物合成苏氨酸新途径重组菌株的发酵验证。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例,即不构成对本发明的限制。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
其中，本发明所采用的测定方法如下：
1）甲醛分析测定
采用乙酰丙酮显色法对甲醛进行分析测定，乙酰丙酮显色试剂(Nash)：2 M乙酸铵,50 mM 冰乙酸，20 mM 乙酰丙酮。 Nash试剂（100μL）与样品（100μL）于96孔板中混合，60℃条件下反应10 min, 冷却后，采用酶标仪检测，检测波长为414 nm。
2）4-羟基-2-酮丁酸分析测定
从反应混合物中取出样品并用去离子水稀释，得到3至50 mM的浓度范围。将稀释液(25μL)与O-苄基羟胺盐酸盐溶液(50μL，130mM储备溶液的吡啶：甲醇：水 ＝ 33：15：2)混合。25℃反应10分钟后，将样品用甲醇(500μL)稀释，离心过膜(0 .22μm)，利用配有120EC-C18色谱柱(2.7μm，3.0×150 mm)的HPLC分析。其中，流动相A：去离子水（ddH2O）中加入0.1％( v/v )三氟乙酸( TFA，trifluoroacetic acid)；流动相B：乙腈(CH3CN)中加入0.095％(v/v)TFA，流速1mL min-1，在215 nm检测，柱温30℃。洗脱条件：梯度洗脱，30 min内流动相(B)由8变化80％。
3）高丝氨酸与苏氨酸HPLC分析测定
从反应混合物中取出样品并用去离子水或相应培养基稀释，得到0.1mM-20 mM浓度范围。借助自动进样器将测定样品与邻苯二甲醛（1,2-Benzenedicarboxaldehyde,OPA）完成衍生化。利用配有AdvanceBio AAA C18色谱（4.6×100 mm，2.7 μm） HPLC分析。其中，流动相A含有10 mM Na2HPO4和10 mM Na2B4O7，pH值为8.2，而流动相B为乙腈、甲醇和水的混合溶液（45:45:10，v:v:v）， 流速：1.5 mL/min，柱温：40℃，检测波长：338 nm,使用梯度程序洗脱分析，洗脱程序：0-0.35 min, 流动相B维持2%, 0.35-13.4 min,流动相B由2%变为57%，13.4-13.5 min,流动相B由57%变为100%,13.5-15.7 min,流动相B维持100%,15.7-15.8 min，流动相B由100%变为2%，15.8 min-18 min 流动相B维持2%.。
4）高丝氨酸与苏氨酸LC-MS分析测定：
利用配有 SeQuant ZIC-HILIC 色谱柱(5 μm, 150 × 2.1 mm)的LC-MS对样品中的高丝氨酸与苏氨酸进行分析，其中，流动相A：（90%水，10%乙腈，10 mM甲酸铵）和流动相B：（10%水，90%乙腈，10 mM甲酸铵），柱温:30℃，洗脱条件：梯度洗脱，洗脱程序：0-17 min:流动相B由95%变为80%，17-25 min:流动相B由80%变为33%,25-26 min，流动相B由33%变为95%,26-30 min,流动相B维持95%，流速：0.2 mL/min，柱温：30℃。
本发明所采用的培养以及反应体系如下：
1）无机盐培养基：
基本成分包含（1L）：47.8 mM Na2HPO4,22 mM KH2PO4,8.6 mM NaCl,93 mM NH4Cl,2 mM MgSO4 100μM CaCl2;微量元素(1L): 134μM EDTA, 31μM FeCl3, 6.2μM ZnCl2,0.76μM CuCl2, 0.42μM CoCl2, 1.62μM H3BO3, 0.081μM MnCl2；葡萄糖：30 g/L，其他如抗生素、氨基酸等根据情况添加。
2）LB培养基（1L）：
蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母粉5 g，pH =7 .0。
3）酶反应体系缓冲液：
HEPES缓冲液（100 mM）：100 mM HEPES, 1500 mM KCl, 100 mM KH2PO4, pH =7.5。
本发明设计了利用甲醇为一碳单位来源新型合成高丝氨酸和苏氨酸非天然生物合成途径见图1，通路主要包含5种酶：甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶，涉及5步反应，其基本反应过程为：
1）甲醇首先通过甲醇脱氢酶催化氧化生成甲醛；
2）甲醛与糖酵解途径的末端产物丙酮酸通过醛缩酶催化反应生成非天然产物4-羟基-2-酮-丁酸；
3）4-羟基-2-酮-丁酸在氨基供体条件下由转氨酶催化生成高丝氨酸；
4）高丝氨酸经过高丝氨酸激酶与苏氨酸合成酶两步催化反应生成苏氨酸。
实施例一  合成途径的构建方案
该新型途径创新性的将高能量密度的甲醇/甲醛一碳化合物代替低能的CO2引入高丝氨酸、苏氨酸合成途径中，其仍利用葡萄糖为主要碳源进行氨基酸发酵，同时使用甲醇做为一碳原料，通过甲醛与丙酮酸的醛缩反应，合成中间代谢产物4-羟基-2-酮丁酸，它再通过转氨反应合成高丝氨酸，高丝氨酸继而可以通过天然途径合成苏氨酸。新途径路线见图1。该新途径其非天然性主要体现在前三步不同反应的设计和组合以生成高丝氨酸，而后两步是来则自于天然苏氨酸合成途径将高丝氨酸转化成苏氨酸。可以通过体外多酶催化体系或构建重组菌株来将甲醇与丙酮酸转化为苏氨酸。
实施例二  筛选甲醇脱氢酶
选择不同来源的甲醇脱氢酶进行酶动力学表征。主要包括已经报道的7个NAD依赖型甲醇脱氢酶及其两个突变体：来源于甲基营养型甲醇芽孢杆菌（Bacillus  methanolicus）的甲醇脱氢酶：BmMdh（SEQ ID NO.28）、BmMdh2（SEQ ID NO.29）、BmMdh3（SEQID NO.31）以及BmMdh2突变体：BmMdh2mut（SEQ ID NO.30）；来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（B.  stearothermophilus）的醇脱氢酶BsMdh（SEQ ID NO.32）；来源于甲基营养菌(Cupriavidus  necator)的乙醇脱氢酶CnMdh2（SEQ ID NO.33）以及其突变体CT4-1（SEQ ID NO.34）；来源于木聚糖赖氨酸杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)的甲醇脱氢酶LxMdh（SEQ IDNO.35）；来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum R)的甲醇脱氢酶CgMdh（SEQID NO.36）。将上述9种甲醇脱氢酶基因构建到表达载体pET16b上，获得相应载体：pET16b-BsMdh，pET16b-CgMdh，pET16b-BmMdh，pET16b-BmMdh2,pET16b-BmMdh2mut，pET16b-BmMdh3，pET16b-CnMdh2,pET16b-CT4-1，pET16b-LxMdh。
将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E .coli BL21(DE3)中，37℃培养至 OD600达到0.5时，添加0.1 mM IPTG诱导基因表达，16℃过夜诱导培养后收集菌体，超声破碎后，使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
纯化获得的上述甲醇脱氢酶进一步用于体外酶活测定，体外酶活测定体系包含10mM HEPES （pH = 7.5），0.5 M甲醇，5 mM MgSO4, 0.5 mM NAD+,以及纯化的上述9种醇脱氢酶，在28℃条件下反应，通过在340 nm波长检测NADH的生成实现对上述9种甲醇脱氢酶活性测定。实验结果如表1显示，BsMdh相对催化效率较高（k cat（s-1） = 0.035，K M（mM）=346），因此，在后续的实验中，选择BsMdh作为甲醇生物转化第一步的催化剂。
表1甲醇脱氢酶动力学参数
Enzyme <i>k</i><sub>cat </sub>(s<sup>-1</sup>) <i>K</i><sub>M </sub>(mM) <i>k</i><sub>cat</sub>/<i> K</i><sub>M </sub>(s<sup>-1</sup> M<sup>-1</sup>)
<i>Bs</i>Mdh 0.012 ± 0.0003 346 ± 36.8 0.035 ± 0.0038
<i>Cg</i>Mdh 0.015 ± 0.0004 632 ± 52.8 0.024 ± 0.0021
<i>Bm</i>Mdh1 0.001 ± 0.00004 709 ± 71.9 0.0014 ± 0.00015
<i>Bm</i>Mdh2 0.001 ± 0.0001 553 ± 191 0.0018 ± 0.00019
<i>Bm</i>Mdh2<sup>mut</sup> 0.005 ± 0.0004 1764 ± 236 0.0028 ± 0.00044
<i>Bm</i>Mdh3 0.006 ± 0.0004 1400 ± 223 0.0043 ± 0.00077
<i>Cn</i>Mdh2 0.005 ± 0.0004 1199 ± 196 0.0042 ± 0.00076
CT4-1 0.006 ± 0.0004 1774 ± 270 0.0034 ± 0.00056
<i>Lx</i>Mdh 0.0045 ± 0.0003 2293 ± 328 0.002 ± 0.00031
实施例三  筛选醛缩酶
选择不同类型的醛缩酶进行酶动力学表征。主要包括来源于大肠杆菌(Escherichia  coli)的2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶EcRhmA（II型醛缩酶），2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸醛缩酶EcYagE（EC:4.1.2.51 Gene ID:944925）和二氢吡啶二羧酸合成酶EcYjhH（SEQ ID NO. 37）。将上述3种醛缩酶构建到表达载体pET16b上，由于2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶EcRhmA存在包涵体问题，为此设计了以融合蛋白表达的MBP-RhmA方式：在RhmA序列N端连接麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP),最终获得相应载体：pET16b-EcRhmAMBP,pET16b-EcYagE,pET16b-EcYjhH。
然后，将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E .coli BL21(DE3)中，37℃培养至 OD600 =  0.5时，添加0.1 mM IPTG诱导基因表达，16℃过夜诱导培养后收集菌体，超声破碎后，使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
纯化获得的上述醛缩酶进一步用于体外酶活测定，体外酶活测定体系包含10 mMHEPES （pH=7.5），5 mM MgCl2, 20 mM丙酮酸，不同浓度的甲醛，以及上述3种纯化的醛缩酶，每隔30s使用等体积的20%三氯乙酸进行终止反应，共监测5min。酶活测定使用乙酰丙酮显色法（Nash）对甲醛进行定量，根据甲醛随反应时间的消耗计算反应速率。实验结果如表2显示，活性最好的为II型醛缩酶EcRhmAMBP（k cat=92.8s-1），相应地其对甲醛的k cat /K M值为5.4×103 s-1 M-1。因此，在后续的实验中，选择EcRhmAMBP作为甲醇生物转化第二步的催化剂。
表2 醛缩酶动力学参数
Enzyme <i>k</i><sub>cat </sub>(s<sup>-1</sup>) <i>K</i><sub>M </sub>(mM) <i>k</i><sub>cat</sub>/<i> K</i><sub>M </sub>(s<sup>-1</sup> M<sup>-1</sup>)
<i>Ec</i>YagE 61.0 ± 4.9 13.8±2.1 (4.4±0.8)×10<sup>3</sup>
<i>Ec</i>YjhH 21.0± 1.4 6.1±1.1 (3.4±0.7)×10<sup>3</sup>
<i>Ec</i>RhmA<sup>MBP</sup> 92.8±12.2 17.2 ± 4.4 (5.4±1.6)×10<sup>3</sup>
实施例四  非天然途径每步生化反应的体外实现
选择来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus）的醇脱氢酶BsMdh编码基因(EC:1.1.1.6, SEQ ID NO.1)，来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶EcRhmA编码基因（EC:4.1.2.53, SEQ ID NO.2），以及进一步优化后的醛缩酶EcRhmAMBP编码基因( SEQ ID NO.3)，来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的天冬氨酸转氨酶EcAspC编码基因（EC:2.6.1.1,  Gene ID: 945553)，来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的高丝氨酸激酶EcThrB编码基因(EC:2.7.1.39, Gene ID: 947498)，来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的EC:4.2.3.1EcThrC编码基因(EC:4.2.3.1, GeneID: 945198 ) 构建到表达载体pET16b上，获得相应载体：pET16b-BsMdh,pET16b-EcRhmAMBP，pET16b-EcAspC,pET16b-EcThrB，pET16b-EcThrC。
将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E .coli BL21(DE3)中，37℃培养至 OD600 =  0.5时，添加0.1 mM IPTG诱导基因表达，16℃过夜诱导培养后收集菌体，超声破碎后，使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
通过表达纯化获得通路中5种活性蛋白酶，即甲醇脱氢酶BsMdh、醛缩酶EcRhmAMBP、转氨酶EcAspC、高丝氨酸激酶EcThrB以及苏氨酸合成酶EcThrC。进一步地，对通路中的每步反应进行了体外催化验证：
1）第一步反应：
反应体系包含10 mM HEPES （pH = 7.5），5 mM MgCl2，10 mM NAD+，以0.5 M甲醇为底物，10μM甲醇脱氢酶BsMdh作为催化剂，在30℃进行催化反应，分别在反应5 min、15 min、45 min时定点检测，然后利用乙酰丙酮显色法（Nash）对反应生成的甲醛进行定量分析。检测结果如图2中A，以0.5 M甲醇为底物，在添加10μM甲醇脱氢酶BsMdh条件下，反应迅速达到平衡，最终可生成40μM甲醛；而在未添加甲醇脱氢酶BsMdh参与催化反应的对照组中，未检测到甲醛累积。以上结果表明甲醇脱氢酶BsMdh可催化甲醇转化为甲醛。
2）第二步反应：
反应体系包含10 mM HEPES （pH = 7.5），5 mM MgCl2，添加等摩尔浓度底物丙酮酸钠和甲醛（133 mM），2μM醛缩酶作为催化剂,在30℃进行催化反应，反应时间为1h, 反应后添加10% TCA终止反应，离心取上清，并0.22 μM过滤膜过滤，制备样品进行液相检测。检测结果如图2中B，以丙酮酸钠和甲醛为底物，以醛缩酶EcRhmAMBP为催化剂，在30℃条件下反应1h后，醛缩酶EcRhmAMBP可高效催化两底物缩合反应转化为目标产物4-羟基-2-酮-丁酸,转化率达90%；结果表明醛缩酶EcRhmAMBP可有效催化丙酮酸与甲醛缩合生成4-羟基-2-酮-丁酸。
3）第三步反应：
反应体系包含10 mM HEPES （pH = 7.5），2 mM 磷酸吡哆醛PLP，添加1mM 4-羟基-2-酮-丁酸(HOB)作为底物，2mM谷氨酸作为氨基供体，2μM转氨酶EcAspC作为催化剂, 在30℃进行催化反应，反应时间为1h, 反应后添加10%TCA终止反应，离心取上清，并0.22 μM过滤膜过滤，制备样品进行液相检测。检测结果如图2中C，以谷氨酸作为氨基供体，30℃条件下反应1h，在未添加底物4-羟基-2-酮-丁酸或转氨酶EcAspC的对照组中均未检测到目标产物高丝氨酸，而在添加 4-羟基-2-酮-丁酸与转氨酶EcAspC的实验组，经反应后可检测到产物高斯氨酸；结果表明以谷氨酸为氨基供体，转氨酶可有效催化4-羟基-2-酮-丁酸合成高丝氨酸。
4）第四、五步反应：
反应体系包含10 mM HEPES （pH = 7.5），2 mM 磷酸吡哆醛PLP，5 mM ATP，5 mMMgCl2，添加2 mM 高丝氨酸（Homoserine, HOS）作为底物，2μM高丝氨酸激酶EcThrB、苏氨酸合成酶EcThrC作为两步反应催化剂，在30℃进行催化反应，反应时间为1h， 反应后添加10%TCA终止反应，离心取上清，并0.22μM过滤膜过滤，制备样品进行液相检测。检测结果如图2中D，在未添加底物高丝氨酸或高丝氨酸激酶EcThrB、苏氨酸合成酶EcThrC的对照组中均未检测到目标产物苏氨酸，而在添加物高丝氨酸或高丝氨酸激酶EcThrB、苏氨酸合成酶EcThrC的实验组，经反应后可检测到产物苏氨酸，转化率达90%以上；以上结果表明以高丝氨酸为底物，经过高丝氨酸激酶以及苏氨酸合成酶两步催化，可高效生成目标产物苏氨酸。
综上，通过表达纯化高丝氨酸/苏氨酸非天然合成途径中的每步功能元件，并进一步通过体外催化反应验证了途径中每步反应可行性见图2。
实施例五  体外多酶反应催化甲醇与丙酮酸合成苏氨酸
本实施例进一步地，将通路中地5步功能元件酶组合在一起，组建体外多酶反应体系，以甲醇以及丙酮酸为底物经过5步功能元件酶催化生成苏氨酸。体外多酶反应体系包含10 mM HEPES （pH = 7.5），5 mM MgCl2，10 mM NAD+，2 mM 磷酸吡哆醛PLP， 10 mM ATP，添加0.5 M甲醇与100 mM丙酮酸为底物，100 mM谷氨酸为氨基供体；添加30μM甲醇脱氢酶BsMdh、5μM醛缩酶EcRhmAMBP、5μM转氨酶EcAspC、5μM高丝氨酸激酶EcThrB、5μM苏氨酸合成酶EcThrC作为五步反应催化剂， 在30℃进行催化反应，反应时间为15h，反应后添加10% TCA终止反应，离心取上清，并0.22 μM过滤膜过滤，制备样品进行液相检测。检测结果如图3，实验结果表明以0.5 M甲醇为底物，经过通路5步元件酶催化反应，最终可生成0.24 mM苏氨酸，实现了苏氨酸非天然合成通路的体外搭建。
实施例六  高丝氨酸缺陷型菌株的构建
基于苏氨酸非天然合成途径体外成功搭建，为进一步将非天然合成途径引入胞内，我们在模式大肠杆菌W3110中敲除基因frmA以及基因asd，构建了功能性菌株W3110△ frmA△asd。其中，敲除基因frmA目的在于弱化细胞内存在的天然谷胱甘肽依赖性甲醛解毒系统（frm RAB）作用，该甲醛解毒途径会将胞内甲醛转化为甲酸和CO2，使得胞内甲醛累积微少，从而不利于非天然合成途径中甲醛利用；敲除基因asd目的在于阻断细胞内高丝氨酸、苏氨酸天然途径合成，排除高丝氨酸、苏氨酸天然途径合成对非天然途径测定的影响。
首先构建菌株W3110△frmA。以大肠杆菌W3110为出发菌，利用pCas/pTargetF系统在基因组水平敲除基因frmA。
1）构建基因frmA同源片段：
以大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655基因组为模板，利用引物FrmA-F1 与FrmA-R1（SEQ ID NO.4-5） PCR扩增基因frmA上游同源片段，利用引物FrmA-F2与FrmA-R2（SEQ ID NO.6-7） PCR 扩增基因frmA下游同源片段，将获得的基因frmA上下游同源片段通过overlap PCR扩增组装为大小1.2 Kb左右同源片段，同源片段命名为FrmA-D。
2）构建质粒pTargetF-frmA：
以质粒pTargetF为模板，利用引物pTargetF-frmA-F与pTargetF-R（SEQ ID NO 8-9） 进行PCR扩增，将PCR产物利用限制性内切酶 DpnⅠ（NEB）进行酶切，以去除 PCR 产物中的模板，酶切后PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，步骤参照 Axygen胶回收试剂盒中说明。纯化后的PCR产物进行Gibson组装连接。取连接产物10μL加到100μL DH5α感受态细胞中进行热激法化学转化，转化复苏后菌液涂布于LB固体培养基（Specr， 50μg/mL）,37℃ 培养过夜。挑取平板中的单菌落于含有壮观霉素LB液体培养基中,220 rpm/min 37℃振荡培养12h。提取质粒，步骤参照Axygen质粒小提试剂盒说明书进行，将质粒送至苏州金唯智股份有限公司进行测序。质粒命名为pTargetF-FrmA。
3）菌株W3110-pCas感受态制备：
将在液体培养基中过夜培养菌株W3110-pCas按1:100 接种到100 mL 新鲜液体LB培养基中（Kanr，50μg/mL）进行扩大培养，30℃、220 rpm/min 振荡培养到 OD600  =  0.3 左右时，加入L-阿拉伯糖（终浓度为 10 mM）诱导启动子表达 λ-Red 蛋白，培养至OD600  =0.6 左右时停止培养，进行感受态制备：将菌液置于冰中30 min，4℃ 4500 rpm/min离心10min，弃上清，用预冷的 30 mL含10%甘油的超纯水洗涤菌体，4℃ 4500 rpm/min 离心10min，弃上清，30 mL预冷10%甘油的超纯水进行二次洗涤，离心，弃上清，二次洗涤后用1mL预冷含10%甘油超纯水重悬菌体，100μL每管分装至1.5 mL离心管中，迅速贮存于-80°C 冰箱中，备用。
4）共转化敲除基因frmA:
100 ng pTargetF-frmA 质粒与400 ng上下游融合同源片段FrmA-D混 合后加入50μL制备的W3110-pCas感受态细胞中，轻弹混匀，加入预冷的电击杯（0.1 cm）中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪（Bio-Rad）的杯槽中，转化条件：电击后迅速加入1 mL LB液体培养基, 30℃ 静置培养 2h 进行复苏，5000 g/min离心 3 min，弃掉多余上清液，将菌体重悬后涂布于LB固体培养基，同时添加壮观霉素 (50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL),30℃ 过夜培养。转化子通过菌落 PCR（引物FrmA-F1与FrmA-R2（SEQ ID NO.4、7））验证缺失。（见图4）验证正确的菌株进行pCas质粒消除，最终获得菌株W3110△frmA。
然后构建功能性菌株W3110△frmA△asd。以大肠杆菌W3110△frmA为出发菌，利用pCas/pTargetF系统在基因组水平敲除基因asd。
1）构建基因asd同源片段：
以大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655基因组为模板，利用引物Asd-F1 与Asd-R1（SEQ ID NO.10-11）PCR扩增基因frmA上游同源片段，利用引物Asd-F2与Asd-R2（SEQ IDNO.12-13）PCR扩增基因asd下游同源片段，将获得的基因asd上下游同源片段通过overlapPCR扩增组装为大小1.2 Kb左右同源片段，同源片段命名为Asd-D。
2）构建质粒pTargetF-asd：
以质粒pTargetF为模板，利用引物pTargetF-asd-F与pTargetF-R（SEQ ID NO.14、9）进行PCR扩增，将PCR产物利用限制性内切酶 DpnⅠ（NEB）进行酶切，以去除PCR产物中的模板，酶切后PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，步骤参照 Axygen胶回收试剂盒中说明。纯化后的PCR产物进行Gibson组装连接。取连接产物10μL加到100μL DH5α感受态细胞中进行热激法化学转化，转化复苏后菌液涂布于LB固体培养基（Specr， 50μg/mL）,37℃ 培养过夜。挑取平板中的单菌落于含有壮观霉素LB液体培养基中,220 rpm/min 37℃ 振荡培养 12h。提取质粒，步骤参照Axygen质粒小提试剂盒说明书进行，将质粒送至苏州金唯智股份有限公司进行测序。质粒命名为pTargetF-asd。
3）菌株W3110△frmA -pCas感受态制备：
将在液体培养基中过夜培养菌株W3110△frmA-pCas按 1:100 接种到100 mL 新鲜液体LB 培养基中（Kanr，50μg/mL）进行扩大培养，30℃、220 rpm/min 振荡培养到 OD600  =  0.3 左右时，加入 L-阿拉伯糖（终浓度为 10 mM）诱导启动子表达λ-Red 蛋白，培养至OD600  =  0.6 左右时停止培养，进行感受态制备：将菌液置于冰中30 min，4℃ 4500 rpm/min离心 10 min，弃上清，用预冷的30 mL 含10%甘油的超纯水洗涤菌体，4℃ 4500 rpm/min 离心 10 min，弃上清，30mL预冷10%甘油的超纯水进行二次洗涤，离心，弃上清，二次洗涤后用1mL预冷含10%甘油超纯水重悬菌体，100μL 每管分装至 1.5 mL 离心管中，迅速贮存于-80℃冰箱中，备用。
4）共转化敲除基因asd:
100 ng pTargetF-asd 质粒与400 ng上下游融合同源片段asd-D混 合后加入 50μL制备的W3110△frmA-pCas感受态细胞中，轻弹混匀，加入预冷的电击杯（0.1 cm）中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪（Bio-Rad）的杯槽中，转化条件：电击后迅速加入1mL LB 液体培养基, 30℃静置培养 2h 进行复苏，5000 g/min离心3 min，弃掉多余上清液，将菌体重悬后涂布于LB固体培养基，同时添加壮观霉素 (50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、二氨基庚二酸 DAP(0.25 mM),30℃  过夜培养。转化子通过菌落 PCR（asd-F1与asd-R2（SEQ ID NO.10、13））验证缺失。验证正确的菌株进行pCas质粒消除，最终获得菌株W3110△frmA△asd, PCR验证结果见图4。
实施例七  苏氨酸新途径重组菌株的构建
苏氨酸新合成途径中涉及的5步反应主要包括：以甲醇为底物，经过甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶3步催化反应转化为高丝氨酸的非天然合成途径；以及高丝氨酸经过天然途径中高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶2步催化反应合成苏氨酸。由于上游非天然模块使用高拷贝质粒pTrc99a，下游天然模块基因使用低拷贝的pTrc33a。为此，将苏氨酸新合成途径中的5步元件基因以及苏氨酸转运蛋白基因加载至两个载体：1）甲醇转化为高丝氨酸非天然模块质粒pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC；2）高丝氨酸转化为苏氨酸天然模块质粒pTrc33a-EcRhtC-EcThrBC。
1）构建质粒pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC
首先构建质粒pTra99a-BaMdh:以大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组为模板，利用引物BsMdh-F与BsMdh-R（SEQ ID NO.15-16）进行PCR扩增获得包含质粒pTrc99a同源序列的BsMdh基因片段；然后与双酶切后载体pTra99a（Nco I/Sac I）进行Gibson组装连接，获得载体质粒pTra99a-BsMdh。
然后构建质粒pTrc99a-BsMdh-EcAspC：以大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组为模板，利用引物EcAspC-F与EcAspC-R（SEQ ID NO.17-18）进行PCR扩增获得包含质粒pTrc99a-BsMdh同源序列的EcAspC基因片段；然后与双酶切后载体pTra99a-BsMdh（BamH I/Sal I）进行Gibson组装连接，获得载体质粒pTra99a-BsMdh-EcAspC。
然后构建质粒pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC：以大肠杆菌(Escherichia  coli)MG1655基因组为模板，利用引物EcRhmA-F与MBP-EcRhmA-R（SEQ ID NO. 19-20）进行PCR扩增获得包含质粒pTra99a-BsMdh-EcAspC以及芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein，MBP)同源序列的EcRhmA基因片段；同时以质粒pSV272.1为模板，利用引物MBP-EcRhmA-F与EcRhmA-R（SEQ ID NO.21-22）进行PCR扩增获得包含质粒pTra99a-BsMdh-AspC以及基因EcRhmA同源序列的MBP基因片段；然后与双酶切后载体pTra99a-BsMdh-EcAspC（BamH I/Sac I）进行Gibson组装连接，获得载体质粒pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC。
2）构建质粒pTrc33a-EcRhtC-EcThrB/C
首先构建质粒pTra99a-EcRhtC: 以大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组为模板，利用引物EcRhtC-Fa、EcRhtC-Fb与EcRhtC-R（SEQ ID NO.23-25）进行PCR扩增获得包含质粒pTrc33a同源序列的EcRhtC基因片段；然后与双酶切后载体pTra33a（BamH I/Sac I）进行Gibson组装连接，获得载体质粒pTra99a-BsMdh-AspC。
然后构建质粒pTrc33a-EcRhtC-EcThrBC：以大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655基因组为模板，利用引物EcThrB/C-F与EcThrB/C-R（SEQ ID NO. 26-27）进行PCR扩增获得包含质粒pTrc33a-EcRhtC同源序列的EcThrB/C基因片段；然后与双酶切后载体pTra33a-EcRhtC（BamH I/Sal I）进行Gibson组装连接，获得载体质粒pTrc33a-EcRhtC-EcThrB/C。
3）构建重组菌株W3110△frmA△asd（pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC/pTrc33a-EcRhtC-EcThrB/C）
将含有甲醇脱氢酶基因BsMdh、醛缩酶基因EcRhmA MBP ,转氨酶基因EcAspC的质粒载体pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC，以及含有苏氨酸转运蛋白基因EcRhtC、高丝氨酸激酶基因EcthrB、苏氨酸合成酶基因EcthrC的质粒载体pTrc33a-EcRhtC-EcThrB/C共同转入功能性菌株W3110△frmA△asd中，获得重组菌株W3110△frmA△asd（pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC/pTrc33a-EcRhtC-EcThrB/C），抗性为羧苄霉素以及氯霉素。
实施例八  甲醇为底物重组菌株发酵合成苏氨酸
首先在平板上挑取菌株W3110△frmA△asd（pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC/pTrc33a-EcRhtC-EcThrB/C）单克隆至含4 mL LB培养基的试管中，添加羧苄霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL) 二氨基庚二酸 DAP(0.25 mM)，37℃条件下，220 rpm/min过夜培养获得种子液。
然后以初始OD600  = 0.1转接无机盐培养基，同时添加羧苄霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)、二氨基庚二酸 DAP(0.25 mM)、高丝氨酸（5 mM），待菌体OD600 = 0.5时，添加0.1 mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续过夜培养。
然后离心收集过夜菌体，用无机盐培养基洗涤3次后重悬，菌体浓度稀释为OD600 =5，将30mL重悬菌转移至无菌250 mL摇瓶中，同时添加羧苄霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)、二氨基庚二酸 DAP(0.25 mM)，添加初始浓度为0.5 M甲醇，葡萄糖浓度为30 g/L，37℃条件下，220 rpm培养24h，取1 mL样品，离心取上清，并0.22 μM过滤膜过滤，制备样品进行液相检测。检测结果如图5， 0.5 M甲醇可生成0.0 11mM苏氨酸，实现了苏氨酸非天然合成通路的体内合成。
实施例九  甲醛为底物重组菌株发酵合成苏氨酸
甲醛是新途径中的第二步反应底物，利用该工程菌株可以实现途径中每步底物如甲醇、甲醛、4-羟基-2酮-丁酸、高丝氨酸到苏氨酸的合成，相较于甲醛，同为一碳的甲醇具有低毒性，低成本等优势，对于新途径更具价值。
首先在平板上挑取菌株W3110△frmA△asd（pTrc99a-BsMdh-EcRhmAMBP-EcAspC/pTrc33a-EcRhtC-EcThrB/C）单克隆至含4 mL LB培养基的试管中，添加羧苄霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL) 二氨基庚二酸 DAP(0.25mM)， 37℃条件下，220 rpm/min过夜培养获得种子液。
然后以初始OD600 = 0.1转接无机盐培养基，同时添加羧苄霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)、二氨基庚二酸 DAP(0.25 mM)、高丝氨酸（5 mM），待菌体OD600 =  0.5时，添加0.1 mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续过夜培养。
然后离心收集过夜菌体，用无机盐培养基洗涤3次后重悬，菌体浓度稀释为OD600  =5，将30 mL重悬菌转移至无菌250 mL摇瓶中，同时添加羧苄霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)、二氨基庚二酸 DAP(0.25 mM)，添加初始浓度为4 mM甲醛，葡萄糖浓度为30 g/L，37℃条件下，220 rpm培养24h，取1 mL样品，离心取上清，并0.22 μM过滤膜过滤，制备样品进行液相检测。检测结果如图5，4 mM甲醛可生成0.024 mM苏氨酸，实现了苏氨酸非天然合成通路的体内搭建。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种高丝氨酸和苏氨酸生物合成途径的构建方法及应用
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<210> 1
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<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
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<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus
<400> 32
SDVLKQFVMPKTNLFGPGAIQEVGTRLNDLEVKKTLIVTDEGLHKLGLSEQIANIITAAGIDVAIFPKAEPNPTDQNIEDGIAVYHAENCDSIVSLGGGSAHDAAKGIGLIASNGGRIHDYEGVDKSQNPLVPLIAINTTAGTASEMTRFTIITDTARKVKMAIVDKHVTPLLSINDPELMIGLPPALTAATGLDALTHAIESFVSTNATPITDACAEKVLQLVPEYLPRAYANGADLEAREQMVYAQFLAGMAFNNASLGYVHAIAHQLGGFYNLPHGVCNAILLPHVCRFNLTARTERFARIAELLGENVEALSKRDAAEKAIVAIENLSRDLNIPSGFRELGAKDEDIEILAKNAMLDVCAATNPRKATLEEIKQIITNAMGPVAKKEESLEAVALS 400
<210> 33
<211> 390
<212> DNA
<213> Cupriavidus necator
<400> 33
MTHLNIANRVDSFFIPCVTLFGPGCARETGARARSLGARKALIVTDAGLHKMGLSEVVAGHIREAGLQAVIFPGAEPNPTDVNVHDGVKLFEREECDFIVSLGGGSSHDCAKGIGLVTAGGGHIRDYEGIDKSTVPMTPLISINTTAGTAAEMTRFCIITNSSNHVKMAIVDWRCTPLIAIDDPSLMVAMPPALTAATGMDALTHAIEAYVSTAATPITDACAEKAIVLIAEWLPKAVANGDSMEARAAMCYAQYLAGMAFNNASLGYVHAMAHQLGGFYNLPHGVCNAILLPHVSEFNLIAAPERYARIAELLGENIGGLSAHDAAKAAVSAIRTLSTSIGIPAGLAGLGVKADDHEVMASNAQKDACMLTNPRKATLAQVMAIFAAAM 390
<210> 34
<211> 390
<212> DNA
<213> Bacillus methanolicus
<400> 34
MTHLNIANRVDSFFIPCVTLFGPGCVRETGVRARSLGARKALIVTDAGLHKMGLSEVVAGHIREAGLQAVIFPGAEPNPTDVNVHDGVKLFEREECDFIVSLGGGSSHDCAKGIGLVTAGGGHIRDYEGIDKSTVPMTPLISINTTAGTAAEMTRFCIITNSSNHVKMVIVDWRCTPLIAIDDPSLMVAMPPALTAATGMDALTHAIEAYVSTAATPITDACAEKAIVLIAEWLPKAVANGDSMEARAAMCYAQYLAGMAFNNASLGYVHAMAHQLGGFYNLPHGVCNAILLPHVSEFNLIAAPERYARIAELLGENIGGLSAHDAAKAAVSAIRTLSTSIGIPAGLAGLGVKADDHEVMASNAQKDACMLTNPRKATLAQVMAIFAAAM 390
<210> 35
<211> 339
<212> DNA
<213> Lysinibacillus xylanilyticus
<400> 35
MKAAVVNEFKKALEIKEVERPKLEEGEVLVKIEACGVCHTDLHAAHGDWPIKPKLPLIPGHEGVGIVVEVAKGVKSIKVGDRVGIPWLYSACGECEYCLTGQETLCPHQLNGGYSVDGGYAEYCKAPADYVAKIPDNLDPVEVAPILCAGVTTYKALKVSGARPGEWVAIYGIGGLGHIALQYAKAMGLNVVAVDISDEKSKLAKDLGADIAINGLKEDPVKAIHDQVGGVHAAISVAVNKKAFEQAYQSVKRGGTLVVVGLPNADLPIPIFDTVLNGVSVKGSIVGTRKDMQEALDFAARGKVRPIVETAELEEINEVFERMEKGKINGRIVLKLKED 339
<210> 36
<211> 345
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 36
MTTAAPQEFTAAVVEKFGHEVTVKDIDLPKPGPNQALVKVLTSGICHTDLHALEGDWPVKPEPPFVPGHEGVGEVVELGPGEHDVKVGDIVGNAWLWSACGTCEYCITGRETQCNEAEYGGYTQNGSFGQYMLVDTRYAARIPDGVDYLEAAPILCAGVTVYKALKVSETRPGQFMVISGVGGLGHIAVQYAAAMGMRVIAVDIADDKLELARKHGAEFTVNARNEDPGEAVQKYTNGGAHGVLVTAVHEAAFGQALDMARRAGTIVFNGLPPGEFPASVFNIVFKGLTIRGSLVGTRQDLAEALDFFARGLIKPTVSECSLDEVNDVLDRMRNGKIDGRVAIRY 345
<210> 37
<211> 296
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 37
MNQTMKFSGAVCPSVIPLDDSGQIDLTGLEKHMARLSDSGINGILLSGTIGEFATMSVRERAMLILEARKMSDLPLIAHISSTVEEDMLYLADAAYDSGYDAVMVLPQYYYAQTSRQLLSYFRSLDRKLAGDWFIYNFPARTGCDVDAHLVRMLAESCPRFIGIKDTVDCASHTRAIVNAVTPLRKDFAVFAGFDEYFVPNLMNGGAGVLSGLNNVVPELFAQIMRAYRAGDLNEVAGLHKEIGRLSGIYAIGDDFVSTIKTAISRKYGYMTPVSRNHNGQLTADQADCLDKLFGL 296

Claims (10)

1.一种适宜于工业生产的氨基酸的制备方法，其特征在于，包含甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶三种酶，按下述反应过程进行：
1）甲醇脱氢酶催化甲醇生成甲醛；
2）醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸；
3）转氨酶在存在氨基供体条件下催化4-羟基-2-酮-丁酸生成高丝氨酸；
其中，甲醇脱氢酶是吡咯喹啉醌依赖型的甲醇脱氢酶、NAD依赖型的甲醇脱氢酶、或甲醇氧化酶；所述的醛缩酶是能够以丙酮酸作为供体，甲醛为受体的醛缩酶；所述转氨酶可催化氨基供体到4-羟基-2-酮-丁酸受体生成高丝氨酸转氨反应的转氨酶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进一步包括高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶，经级联酶促催化反应生成苏氨酸，由高丝氨酸生成苏氨酸按下述反应实现：
4）高丝氨酸激酶与苏氨酸合成酶经过两步反应催化高丝氨酸生成苏氨酸。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，以甲醇和丙酮酸为底物，通过体外多酶体系实现合成高丝氨酸或苏氨酸，或者通过过表达所述酶的重组菌株实现生物合成高丝氨酸或苏氨酸；所述重组菌株的出发菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamnicum）、谷草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、乳酸菌（Lactic  acid bacteria）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、甲基营养菌（Methylorubrum  extorquens）、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的醛缩酶是I类醛缩酶或II型醛缩酶更优选地，所述的醛缩酶为2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶、2-脱氢-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶和5-酮-4脱氧-D-戊二酸醛缩酶；所述转氨酶是天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、ω-转氨酶、或丙氨酸脱氢酶。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述通过过表达所述酶的重组菌株实现生物合成高丝氨酸或苏氨酸，是在重组菌株中过表达甲醇脱氢酶、醛缩酶和转氨酶而实现；更优选地，进一步过表达高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶;更进一步过表达氨基酸转运蛋白，用于提高细胞的转运能力。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，通过过表达所述酶的重组菌株实现生物合成高丝氨酸或苏氨酸，是将所述重组菌株，在甲醇和丙酮酸存在下进行发酵培养以生成目标氨基酸，以及分离目标氨基酸的步骤。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，通过体外多酶体系中含有HEPES，甲醇，丙酮酸，谷氨酸， NAD+，MgCl2，磷酸吡哆醛PLP，以及甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶，进行催化反应获得高丝氨酸；优选地，进一步还包括ATP，以及高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶，以进行催化反应获得苏氨酸。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，反应体系中含有8-12 mM HEPES pH =7.5，0.4-0.6 M甲醇，80-120 mM 丙酮酸，80-120 mM谷氨酸，8-10 mM NAD+，4-6 mM MgCl2 ,1-3 mM 磷酸吡哆醛PLP, 8-12 mM ATP；20-40μM甲醇脱氢酶、3-8μM醛缩酶、3-8μM转氨酶、3-8μM高丝氨酸激酶、3-8μM苏氨酸合成酶，在28-37℃进行催化反应，反应时间为 12-20个小时。
9.一种用于制备氨基酸的重组菌株，其特征在于，在重组菌株的宿主细胞中过表达甲醇脱氢酶、醛缩酶、转氨酶；所述重组菌株的出发菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamnicum）、谷草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、乳酸菌（Lactic acid bacteria）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、甲基营养菌（Methylorubrum extorquens）、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)；所述重组菌株制备的氨基酸为高丝氨酸；
优选地，在重组菌株的宿主细胞中进一步过表达高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶，所述重组菌株制备的氨基酸为苏氨酸；
更优选地，进一步过表达氨基酸转运蛋白，用于提高细胞的转运能力。
10.如权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，所述各种酶的表达是在质粒上，或者整合在染色体上。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109609426A (zh) * 2019-01-04 2019-04-12 北京化工大学 一种以甲醇/甲醛和葡萄糖为共底物生产1,3-丙二醇的方法
WO2021165229A1 (en) * 2020-02-17 2021-08-26 Scientist Of Fortune S.A. Method for the incorporation of formaldehyde into biomass

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