CN116478896A - 一种多酶级联转化富马酸生产d-泛酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多酶级联转化富马酸生产D‑泛酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过双质粒表达、表达质粒的启动子和翻译起始区改进和基因复制策略实现各酶的平衡表达，减少了中间产物的积累。更进一步地，在将中间产物转化为D‑泛酸的过程中利用ATP再生系统增强细胞内ATP供应，实现了ATP的免添加，降低反应成本，提高整体转化效率。并从反应的催化剂浓度、pH、温度和补料方式对催化体系进行优化，可使得D‑泛酸产量达到128.6g/L，转化率达到97.3％。从而大大降低了的底物成本和环境污染等问题，为D‑泛酸的工业化生产和绿色生产提供了新思路。

Description

一种多酶级联转化富马酸生产D-泛酸的方法
技术领域
本发明涉及一种多酶级联转化富马酸生产D-泛酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
D-泛酸(维生素B5)是活细胞中辅酶A合成的关键前体，也是生命必需的维生素。该化合物可以由微生物和植物合成，但不能由人类和其他动物合成，广泛应用于饲料和食品添加剂行业。此外，D-泛酸还是化妆品和药物中的活性成分，能帮助人体缓和多种抗生素副作用及毒性，减轻过敏症状。因此，D-泛酸作为一种重要精细化学品在医药和其他和工业领域中应用广泛，备受研究者的关注。
目前，D-泛酸主要通过加热含D-泛酰内酯和β-丙氨酸的甲醇或乙醇的混合物来生产。光学纯底物D-泛酰内酯通常通过DL-泛酰内酯的化学或酶促拆分获得，它可以很容易地从异丁醛和甲醛合成，通过醛醇缩合，然后在酸性条件下加入氰化氢和皂化。β-丙氨酸主要通过丙烯腈或丙烯酸的氨化作用或β-氨基丙腈的羟基化作用产生。但是这类工艺方法存在原料成本高，工艺条件苛刻，纯化复杂等问题；同时大量使用有机溶剂易造成环境污染。
有专利报道以富马酸为底物，以大肠杆菌工程菌为催化剂，高效合成β-丙氨酸；经全细胞转化合成的β-丙氨酸再经一系列化学反应，以氧化钙、D-泛酰内酯和甲醇为底物，生成D-泛酸钙。但该技术技术仅通过全细胞实现了富马酸到β-丙氨酸的转化，要实现到D-泛酸还需要进过复杂的化学反应且需用到甲醇和其他有机试剂，仍存在环境污染问题。
生物法合成D-泛酸具有成本低、反应条件温和、环境污染少等特点，具有广阔的工业化开发前景。生物法包括发酵法和生物转化法。近年来，已经报道了一系列关于D-泛酸在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中生物合成的研究。以大肠杆菌为宿主，强化D-泛酸生物合成途径，通过引入用于氧化还原调节的群体感应系统和一系列的发酵策略，最终在5L发酵罐中的产量为48.2g/L，但发酵法生产D-泛酸产量水平仍相对较低。生物转化法也取得了一定进展。在大肠杆菌中表达来自谷氨酸棒状杆菌的高活性泛酸合成酶，在发酵的早期对数阶段向含有该酶的大肠杆菌菌株中添加底物(D-泛解酸和β-丙氨酸)，最终32h产生97.1g/L的D-泛酸，但该D-泛酸合成方法需要通过边发酵边转化且底物D-泛解酸的成本较高，工业化受限。
发明内容
本发明提供了一种高效生产D-泛酸的方法，并构建了以大肠杆菌为宿主的共表达工程菌,实现了低价可再生底物富马酸到D-泛酸的高效生产。
本发明通过在大肠杆菌细胞中表达合成D-泛酸的路径酶：L-天冬氨酸酶、L-天冬氨酸-α-脱羧酶和泛酸合成酶；通过双质粒表达、表达质粒的启动子和翻译起始区改进和基因复制策略优化三种酶的表达，解决了级联反应协同性差的问题。随后，引入ATP循环再生系统实现了ATP的免添加。最后，通过全细胞催化体系的优化，实现了D-泛酸的高效生产。本研究为开发大规模生产D-泛酸及相关化合物的生物转化系统提供了借鉴。
本发明的第一个目的是提供一种高效生产D-泛酸的重组大肠杆菌，双质粒表达系统表达L-天冬氨酸酶基因CgAspA、L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因BsPanDE56S、泛酸合成酶基因BbPanC和多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK。
在一种实施方式中，所述L-天冬氨酸酶基因CgAspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CgAspA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因BsPanDE56S的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述BsPanDE56S编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述泛酸合成酶基因BbPanC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述BbPanC编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述PaPPK编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一种实施方式中，以pETDuet-1质粒表达CgAspA、BbPanC和PaPPK基因，以pET-28a(+)质粒表达BsPanDE56S基因。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主为Escherichia coli BL21(DE3)。
本发明的第二个目的是提供构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)将基因以BbPanC、PaPPK和CgAspA的顺序连接至质粒pETDuet-1上，得到重组质粒1；
(2)将基因BsPanDE56S的三个拷贝连接至翻译起始区优化后的质粒pET-28a(+)上，得到重组质粒2；所述翻译起始区优化是以TIR-1替换TIR；所述TIR-1的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；所述TIR的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
(3)将步骤(1)、(2)构建的重组质粒1、2转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种全细胞生产D-泛酸的方法，将所述重组大肠杆菌的湿菌体加入含有富马酸的催化体系中进行反应。
在一种实施方式中，所述催化体系包括30-40g/L全细胞催化剂、70-80/L富马酸、50-60mM Tris-HCl、10-15mMAMP、100-120mM六偏磷酸钠和600-700mM D-泛解酸制备液；所述D-泛解酸制备液由D-泛酰内酯和等摩尔量的氢氧化钠水溶液反应制得。
在一种实施方式中，所述转化的pH为7.0。
在一种实施方式中，所述转化的温度为35℃。
在一种实施方式中，所述转化的时间为至少30h。
在一种实施方式中，转化过程中进行补料，将富马酸浓度控制在14g/L以内。
本发明还提供了所述重组大肠杆菌，构建所述重组大肠杆菌的方法，或生产D-泛酸的方法在制药、食品或化工领域中生产D-泛酸或D-泛酸盐的应用。
有益效果：
本发明构建了一种大肠杆菌重组菌，用于催化生产D-泛酸。该大肠杆菌重组菌同时表达四种酶，分别为L-天冬氨酸酶、L-天冬氨酸-α-脱羧酶、泛酸合成酶和多磷酸依赖性AMP激酶，本发明所述的生产方法通过双质粒表达、表达质粒的翻译起始区改进和基因复制策略实现各酶的平衡表达，减少了中间产物的积累。更进一步地，在将中间产物转化为D-泛酸的过程中利用ATP再生系统增强细胞内ATP供应，实现了ATP的免添加，降低反应成本，提高整体转化效率。并从反应的催化剂浓度、pH、温度和补料方式对催化体系进行优化，可使得D-泛酸产量达到128.6g/L，转化率达到97.3％，转化产物中残留富马酸的含量<1.0g/L，加快了酶转化法生产D-泛酸的工业化进程。
附图说明
图1所示为D-泛酸生物合成路径示意图；
图2所示为调整PanD/AspA和PanD/PanC的质量比对产量和转化率的影响；
图3所示为三酶质粒构建示意图；
图4所示为菌株的生物转化能力随着底物浓度的增加的变化情况；a：PL-01菌株的转化性能；b：PL-02菌株的转化性能；
图5所示为pET-28a(+)表达质粒的不同改进和不同PanD重复数对每单位细胞酶活的影响；a：PL-(02-07)六种菌株CgAspA、BsPanDE56S和BbPanC的酶活性变化情况；b：PL-04和PL-(08-10)四种菌株CgAspA、BsPanDE56S和BbPanC的酶活性变化情况；
图6所示为pET-28a(+)表达质粒的不同改进和PanD重复数对0.4M底物产生的D-泛酸产量的影响；a：PL-(02-07)菌株的转化性能；b：PL-04和PL-(08-10)菌株的转化性能；
图7所示为PL-11菌株的质粒示意图；
图8所示为全细胞转化时不同菌株在不同条件下产量随时间的变化情况；
图9所示为菌株PL-11的生物转化能力随着底物浓度的增加的变化情况；
图10所示为对PL-11生物转化条件的优化；a：全细胞催化剂浓度优化；b：pH值优化；c：温度优化；d：补料方式优化。
具体实施方式
基因来源：本发明所涉及到的L-天冬氨酸酶基因CgAspA来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，NCBI Sequence ID：CP025533.1，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因BsPanD来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，NCBI Sequence ID：CP053102.1，将其所编码的氨基酸序列第56位由谷氨酸突变为丝氨酸，得到BsPanDE56S，编码所述BsPanDE56S的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；泛酸合成酶基因BbPanC来源于短芽孢杆菌(Bavibacillus brevis)，NCBI Sequence ID：CP030117.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，NCBI Sequence ID：LR657304.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
质粒pETDuet-1和pET-28a(+)质粒来自实验室；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、prime STAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。标样购自SIGMA。实验材料均从商业途径可得。
诱导培养重组菌：挑取重组菌株接种至含相应抗性的LB培养基中，200rpm、37℃培养10-12h，以体积比5％的接种量接种至含相应抗性TB培养基中，200rpm、37℃培养至OD600为0.6-0.8时加入0.1g/L终浓度IPTG诱导，诱导温度为25℃，诱导时间12h后以6,000×g离心10min收集细胞，-40℃冻存细胞并用于后续的转化。
全细胞转化：
D-泛解酸制备液：由D-泛酰内酯和等摩尔量的氢氧化钠水溶液于37℃下反应3h制得。
富马酸向D-泛酸的转化的初步尝试：30g/L湿细胞、50mM Tris-HCl、pH 7.0和37℃，转化总时长为36h，向反应体系中加入底物富马酸、ATP和D-泛解酸制备液，同时富马酸、ATP与D-泛解酸制备液的分子量比为1：1：1。通过定时补充纯氨水，将生物转化体系的pH值控制在7.0。
HPLC测定：
底物富马酸，中间产物L-天冬氨酸、β-丙氨酸和产物D-泛解酸的浓度采用AgilentLC1260 HPLC系统测定。
样品预处理：取转化液12000rpm离心10min收集上清液，并以富马酸、L-天冬氨酸、β-丙氨酸和D-泛酸作为标准品，分别配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法分别测定富马酸、L-天冬氨酸、β-丙氨酸和D-泛酸。
富马酸检测所需的流动相为5mM H2SO4溶液。色谱条件为：Aminex糖分析柱(7.8×300mm，Bio-Rad，USA)，55℃，0.6mL/min，210nm。
L-天冬氨酸、β-丙氨酸检测所需的流动相为A相和D相。A相为0.023％三乙胺(0.1M乙酸钠和0.5％四氢呋喃，pH 7.2)，D相为40％甲醇和40％乙腈(0.15M乙酸钠，pH 7.2)。氨基酸的HPLC分析通过OPAFMOC在线衍生化确定。色谱条件为：C18色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent，USA)，40℃，1mL/min，338nm，A和D相梯度洗脱。
D-泛酸检测所需的流动相为95％50mM NH4H2PO4缓冲液(用磷酸调节pH至3.0)和5％的乙腈，色谱条件为：C18色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent，USA)，25℃，0.5mL/min，210nm。
酶活检测方法：
(1)L-天冬氨酸酶AspA的酶活定义为：37℃下每分钟产生1μmol L-天冬氨酸钠所需的L-天冬氨酸酶的酶量为一个酶活力单位(U)。测定体系(2mL)：适量纯酶液、50mmol·L- 1Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)、50mmol·L-1MgCl2和0.1mol·L-1富马酸。检测开始前，在37℃预热除酶液外的其他组分，加入酶液后在37℃孵育10min，使用40％三氯乙酸终止反应，离心后的上清液适当稀释用于HPLC检测产物生成。
(2)L-天冬氨酸-α-脱羧酶PanD的酶活定义为37℃下每分钟产生1μmolβ-丙氨酸所需的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的酶量为一个酶活力单位(U)。测定体系(1mL)：适量纯酶液、90mmol·L-1的磷酸盐缓冲液和38mmol·L-1天冬氨酸(用NaOH调节pH到7.0)。在37℃预热除酶液外的其他组分，加入酶液后在37℃孵育20min，使用40％三氯乙酸终止反应，处理反应样品，离心后的上清液适当稀释用于HPLC检测产物生成。
(3)泛酸合成酶PanC的酶活定义为：37℃下每分钟产生1μmol D-泛酸所需的泛酸合成酶的酶量为一个酶活力单位(U)。测定体系(1.1mL)：适量纯酶液、50mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)、10mmol·L-1MgCl2、15mmol·L-1KCl、25mmol·L-1D-泛解酸钠盐、25mmol·L-1β-丙氨酸和4.5mmol·L-1ATP。检测开始前，在37℃预热除酶液外的其他组分，加入酶液后在37℃孵育20min，使用40％三氯乙酸终止反应，离心后的上清液适当稀释用于HPLC检测产物生成。
以牛血清蛋白(1mg·mL-1)为标样，将稀释至不同浓度的蛋白与Bradford反应测定吸光度绘制标曲。测定纯酶液蛋白吸光度，通过标准曲线计算蛋白浓度。
本申请所构建的重组菌与对应的质粒如下：
实施例1D-泛酸生物合成途径的体外验证和优化
(1)重组菌株的构建：
分别以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列为模板，以NdeI-CgAspA-F/NheI-CgAspA-R、NdeI-BsPanDE56S-F/NheI-BsPanDE56S-R和NdeI-BbPanC-F/NheI-BbPanC-R为引物(表1)，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得添加同源臂的CgAspA、BsPanDE56S和BbPanC基因片段。将上述基因片段纯化后与经NdeI和NheI酶切的线性化质粒pET-28a(+)进行同源重组连接，体系为20μL，条件为37℃，30min。连接产物转化至BL21感受态细胞，挑取单菌落利用引物T7/T7-Term(表1)进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，证明单基因表达载体pET-28a(+)-CgAspA、pET-28a(+)-BsPanDE56S、pET-28a(+)-BbPanC构建成功，含所述表达载体的重组菌分别为BL21-pET-28a(+)-CgAspA、BL21-pET-28a(+)-BsPanDE56S、BL21-pET-28a(+)-BbPanC。
表1引物序列
(2)体外验证级联可行性：
酶的诱导表达和纯化：
分别将步骤(1)中重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-CgAspA、E.coli BL21/pET28a-BsPanDE56S、E.coli BL21/pET28a-BbPanC于抗性(Kan)平板划线，37℃培养箱中培养12h，挑取单菌落，接种于10mL LB液体培养基，置于37℃摇床中震荡培养10-12h，将500μL菌液转接至50mL LB液体培养基中，于37℃摇床中震荡培养1.75h，待菌液浓度(OD600)增长至0.8左右时，加入IPTG，之后转移至16℃培养箱继续培养10-12h，诱导蛋白表达。
结束诱导后，使用冷冻离心机在8000r·min-1、4℃条件下收集菌体，弃上清，以Tris-HCl缓冲液(50mmol·L-1，pH 8.0)重悬菌体，离心后再次悬浮并重复上述步骤两次，最终用5mL缓冲液重悬后转移至10mL EP管中，置于冰水中并固定，设定程序(破碎1s，停止3s，总时长15min)进行超声破碎，完成后于12000r·min-1、4℃离心20min分离粗酶液和沉淀。
用0.22μm无菌滤膜过滤粗酶液，滤液4℃保藏备用。在4℃低温条件下，向镍离子亲和层析柱里注入超纯水以充分冲洗柱子(约需10倍柱体积超纯水)，然后加入10mL的结合液A(20mmol·L-1Tris-HCl，500mmol·L-1NaCl，pH 7.4)以平衡柱子，当柱子的流出液与注入柱子的结合液ApH值相同时(约需5倍柱体积结合液A)，将经过预处理的粗酶液注入柱子。首先用结合液A冲洗柱子至基线平衡以去除杂蛋白，然后利用洗脱液B(20mmol·L-1Tris-HCl，500mmol·L-1NaCl，500mmol·L-1咪唑，pH 7.4)冲洗柱子以洗脱目的蛋白。将收集的吸收峰处的洗脱液保存，从而获得纯的目标蛋白，进一步测定酶活和转化反应中使用。
体外级联验证：
将所得纯酶在25mM富马酸、25mM泛解酸制备液(1M泛酰内酯和1M氢氧化钠室温下反应3h)、25mMATP存在下以1：1：1的质量比(BsPanDE56S活性控制在15U/mL)在体外混合6h，得到了4.6mM D-泛酸。结果证实，设计的D-泛酸生物合成三酶级联反应系统能够将富马酸和泛解酸转化为D-泛酸。
(3)确定体外最适酶活比：
为了有效优化该体外系统，调节了三种酶的浓度和比例。首先，以30g/L(即258mM)富马酸为底物，将CgAspA与BsPanDE56S的不同酶质量比(从120：1到10：1)组合，同时将BsPanDE56S活性控制在15U/mL。结果，当BsPanDE56S/CgAspA的质量比达到1：50(即酶活比为1.56：1)左右时，获得了21.0g/L的最高β-丙氨酸产量和91.2％的转化率，见图2(a)。使用类似的策略，使用34.4g/L L-天冬氨酸作为底物，而BsPanDE56S的活性控制在15U/mL然后确定了BsPanDE56S/BbPanC的最佳质量比1：40(即酶活比为1.47：1)，产生的最高的D-泛酸产量和转化率分别为40.7g/L和87.3％，见图2(b)。因此，CgAspA/BsPanDE56S/BbPanC的最佳质量比为50：1：40，对应的CgAspA/BsPanDE56S/BbPanC的最佳酶活性比为1.56：1：1.47。
实施例2D-泛酸生物合成途径的体内重建
(1)三酶单质粒表达：
构建pETDuet-1R-CgAspA质粒，以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，以NdeI-CgAspA-F和XhoI-CgAspA-R为引物(表2)，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得添加同源臂的CgAspA基因片段。纯化后与经NdeI和XhoI酶切的线性化质粒pETDuet-1，挑取单菌落利用引物Duet-F(表2)和T7-Term(表1)进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，证明单基因表达载体pETDuet-1R-CgAspA构建成功。
在此基础上，以质粒pET-28a(+)-BsPanDE56S为模板，利用引物PstI-BsPanDE56S-F/SalI-BsPanDE56S-R(表2)PCR扩增得到添加了同源臂的BsPanDE56S基因片段，连接到经PstI和SalI双酶切后的质粒pETDuet-1R-CgAspA上，利用引物Duet-F(表2)验证后得到pETDuet-1R-BsPanDE56S-CgAspA。
以质粒pET-28a(+)-BbPanC为模板，以HindIII-BbPanC-F/NotI-BbPanC-R为引物(表2)PCR扩增添加了同源臂的T7-BbPanC基因片段，连接到经HindIII和NotI双酶切后的质粒pETDuet-1R-BsPanDE56S-CgAspA上，验证后得到pETDuet-1R-BsPanDE56S-BbPanC-CgAspA质粒，见图3(a),将所得质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，构建菌株PL-01。
表2引物序列
在37℃下，全细胞催化剂保持在30g/L时，对PL-01菌株的转化性能进行了探索，见图4(a)。随着底物富马酸浓度的增加(0.1～0.3mM)，D-泛酸的滴度从15.6提高到39.0g/L。然而，在底物浓度>0.3mM时D-泛酸的产量并未随着底物的增加而增加。相反，随着底物浓度从0.1提高到0.6mM，级联中间体L-天冬氨酸的积累从3.9增加到58.2g/L。此外，通过测定单位细胞浓度下CgAspA、BsPanDE56S和BbPanC的酶活，结果显示CgAspA(728.6U/mg)、BsPanDE56S(0.2U/mg)和BbPanC(678.9U/mg)的活性比显示为36.0：1：33.5。这些结果表明，三种酶的活性的不平衡，导致了L-天冬氨酸的积累，从而阻断了富马酸向D-泛酸的持续转化。
(2)三酶双质粒表达：
以SEQ ID NO.6为模板，利用引物PstI-EcBbPanC-F/SalI BbPanC-R(表2)进行PCR扩增获得添加同源臂的BbPanC基因片段，纯化后与经PstI和SalI酶切的线性化质粒pETDuet-1进行同源重组连接，连接产物转化至BL21感受态细胞，挑取单菌落利用引物Duet-F(表2)和T7-Term(表1)进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，证明载体pETDuet-BbPanC构建成功。类似地，通过利用引物NdeI-CgAspA-F/XhoI-CgAspA-R(表2)同源重组将CgAspA基因片段插入至质粒pETDuet-BbPanC NdeI和XhoI位点之间，验证后获得pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA，将质粒pET-28a(+)-BsPanDE56S和pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，如图3(b)所示，构建菌株PL-02。
在37℃下，全细胞催化剂保持在30g/L时，对PL-02菌株的转化性能进行了探索，见图4(b)。随着底物浓度的增加(0.1～0.4mM)，D-泛酸的滴度从18.2g/L逐渐提高到55.7g/L。然而，在底物浓度>0.4mM时，D-泛酸的产量并未随着底物的增加而增加。相反，随着底物浓度从0.1提高到0.6mM，级联中间体L-天冬氨酸的积累从2.2g/L增加到51.0g/L。此外，CgAspA、BsPanDE56S和BbPanC的活性比为5.6：1：5.6，这表明双质粒共表达较单质粒表达缩小了BsPanDE56S的酶活性与CgAspA和BbPanC的差距，该改造有效。但是，三种酶的催化活性仍不平衡，在生物转化过程中积累了高水平的中间体L-天冬氨酸，还需要寻找一种有效的方法来平衡这三种酶的活性。
实施例3优化AspA/PanD/PanC比率以有效生产D-泛酸
(1)pET-28a(+)-BsPanDE56S表达质粒的改进：
将T7启动子恢复为T7pCONS:以pET-28a(+)-BsPanDE56S为模板，以T7pCONS-F/R(表3)为引物，利用标准的PCR扩增体系和程序进行扩增，将产物pET-28a(+)T7pCONS-BsPanDE56S转化至BL21感受态细胞，挑取单菌落利用引物T7/T7-Term(表1)进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，证明T7启动子改造成功，将所构建的质粒pET-28a(+)T7pCONS-BsPanDE56S和实施例2中构建的质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化至BL21感受态细胞，所得菌株命名为PL-03。
将翻译起始区(TIR)改造为TIR-1和TIR-2:以pET-28a(+)-BsPanDE56S为模板，分别以TIR-1-F/R和TIR-2-F/R为引物，利用标准的PCR扩增体系和程序进行扩增，分别将PCR产物pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S和pET-28a(+)TIR-2-BsPanDE56S转化至BL21感受态细胞，挑取单菌落利用引物T7/T7-Term(表1)进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，证明翻译起始区改造成功。将改造成功的质粒pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S和实施例2中构建的质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化至BL21感受态细胞，所得菌株命名为PL-04；将改造成功的质粒pET-28a(+)TIR-2-BsPanDE56S和实施例2中构建的质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化至BL21感受态细胞，所得菌株命名为PL-05。
同理，以pET-28a(+)T7pCONS-BsPanDE56S为模板重复上述操作，获得T7启动子和TIR同时改造的pET表达质粒pET-28a(+)TIR-1-T7pCONS-BsPanDE56S和pET-28a(+)TIR-2-T7pCONS-BsPanDE56S。将改造成功的质粒pET-28a(+)TIR-1-T7pCONS-BsPanDE56S和实施例2中构建的质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化至BL21感受态细胞，所得菌株命名为PL-06；将改造成功的质粒pET-28a(+)TIR-2-T7pCONS-BsPanDE56S和实施例2中构建的质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化至BL21感受态细胞，所得菌株命名为PL-07。具体引物如表3所示。
表3引物序列
在37℃下，全细胞催化剂保持在30g/L时，探究PL-(02-07)六种菌株在不同底物浓度(0.1～0.6M)下的最高产量。六种菌株均在底物浓度0.4M下表现出最高产量。其中，PL-04表现出最高的产量：相对于PL-02，CgAspA活性降低了2.27％，BbPanC活性降低了5.38％，BsPanDE56S活性提高了20.9％，见图5(a)，D-泛酸滴度的最大产量达到61.6g/L(是PL-02菌株的1.11倍)，但转化率仍然很低，为70.3％，见图6(a)。同时，CgAspA/BsPanDE56S/BbPanC的活性比从5.60：1：5.61变为4.52：1：4.39。
(2)基因复制修饰策略：
以pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S为模板，以NheI-copy-2-F和BamHI-copy-2-R为引物(表4)，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得添加NheI和BamHI酶切位点的TIR-1-BsPanDE56S基因片段，双酶切纯化后与经NheI和BamHI酶切的线性化质粒pET-28a(+)进行双酶连，体系为10μL，条件为16℃过夜连接。连接产物转化至BL21感受态细胞，挑取单菌落利用引物T7/T7-Term(表1)进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，证明表达载体pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S-BsPanDE56S构建成功。将改造成功的质粒pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S-BsPanDE56S和实施例2中构建的质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化至BL21感受态细胞，所得菌株命名为PL-08。
同样地，通过引物EcoRI-copy-3-F和SalI-copy-3-R、HindIII-copy-4-F和NotI-copy-4-R(表4)先后将TIR-1-BsPanDE56S基因片段插入EcoRI和SalI、HindIII和NotI位点，构建BsPanDE56S基因的拷贝数为3和4的质粒pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S-BsPanDE56S-BsPanDE56S和pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S-BsPanDE56S-BsPanDE56S-BsPanDE56S。将改造成功的质粒pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S-BsPanDE56S-BsPanDE56S和实施例2中构建的质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化至BL21感受态细胞，所得菌株命名为PL-09。将改造成功的质粒pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S-BsPanDE56S-BsPanDE56S-BsPanDE56S和实施例2中构建的质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA一起转化至BL21感受态细胞，所得菌株命名为PL-10。具体引物如表4所示。
表4引物序列
诱导表达菌株PL-(08-10)，经过酶学测定AspA/PanD/PanC的最终活性比分别为2.67：1：2.64、1.67：1：1.56和2.01：1：1.88，见图5(b)。然后，在37℃下，全细胞催化剂保持在30g/L时，使用PL-(07-10)菌株和0.4M底物进行全细胞转化实验，PL-09转化生成的D-泛酸滴度为82.2g/L，转化率为93.8％，中间产物L-天冬氨酸仅有3.3g/L的积累，见图6(b)。
实施例4引入基于多磷酸依赖性AMP激酶(PPK)的ATP再生系统
构建引入PaPPK基因的重组菌株：
构建pETDuet-1R-BbPanC-PaPPK-CgAspA质粒，以SEQ ID NO.8所示核苷酸序列为模板，分别以HindIII-PaPPK-F和NotI-PaPPK-R为引物，利用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获得添加同源臂的PaPPK基因片段。纯化后与经HindIII和NotI酶切的线性化质粒pETDuet-1R-BbPanC-CgAspA进行同源重组连接，体系为20μL，条件为37℃，30min。连接产物转化至BL21感受态细胞，挑取单菌落利用引物Duet-PPK-F/Duet-PPK-R(表5)进行PCR验证，阳性转化子进行测序，测序结果与理论序列一致，证明表达载体pETDuet-1R-BbPanC-PaPPK-CgAspA构建成功。将所述表达载体pETDuet-1R-BbPanC-PaPPK-CgAspA与实施例3中构建的pET-28a(+)TIR-1-BsPanDE56S-BsPanDE56S-BsPanDE56S一起转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，构建菌株PL-11，见图7。具体引物如表5所示。
表5引物序列
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在全细胞生物催化剂维持在30g/L时，使用不添加ATP和添加足量ATP的PL-09菌株作为对照，PL-11在0.4M底物进行全细胞转化实验，见图8。PL-11在转化30h时达到最高产量，D-泛酸产量为74.5g/L，转化率为84.9％，较改造前菌株最高产时间提前，且产量明显提高，说明改造有效。
为了确定ATP再生系统对不同底物浓度的转化体系是否都具有效果，我们设置不同底物浓度组，从0.4-0.8M共分为6组。在转化温度37℃，pH 7.0，全细胞生物催化剂维持30g/L时，对PL-11菌株的转化性能进行了探索。结果发现，随着底物富马酸和D-泛解酸的浓度增加，D-泛酸的最高产量从74.5逐渐提高到117.2g/L。但是，随着底物浓度的增加从0.4提高到0.8M，摩尔转化率并未随之增加，从84.9％下降至66.8％，并且级联中间体L-天冬氨酸的积累量从8.0提高到35.4g/L，见图9。综合考虑产量和摩尔转化率，选择底物浓度0.6M进行后续的体系优化。
实施例5转化富马酸生产D-泛酸的体系优化及放大生产
(1)全细胞转化体系优化：
测试了不同浓度的全细胞催化剂(PL-11)对D-泛酸合成的影响，见图10(a)。反应体系为0.6M富马酸、0.6M泛解酸制备液、50mM Tris-HCl、10mMAMP、100mM六偏磷酸钠、pH7.0、37℃，转化总时长为36h，每6h向反应体系中加入底物富马酸和D-泛解酸制备液，同时富马酸与D-泛解酸制备液的分子量比保持在1：1。通过定时补充纯氨水，将生物转化体系的pH值控制在7.0。随着PL-11菌体浓度(10～50g/L)的增加，D-泛酸产量从23.2g/L逐渐提高到106.5g/L。同时，可以发现，使用30g/L全细胞催化剂时，D-泛酸产量与PL-11浓度的最高比率(P/C比率)达到2.78g/g。
采用上述反应体系，使用30g/L全细胞催化剂时，测试了不同pH对D-泛酸合成的影响。比较在了pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0时的产量，发现在pH 7.0时，D-泛酸产量提高到最大值94.7g/L，见图10(b)。
此外，采用上述反应体系，使用30g/L全细胞催化剂，并控制pH 7.0时，测试了不同温度对D-泛酸合成的影响。发现转化温度为35℃时显示出最高的D-泛酸产量为106.8g/L，此时的转化率为81.2％，见图10(c)。
最后，在1L的反应体系中，在下述条件下进行反应：30g/L菌株PL-11、50mM Tris-HCl缓冲液、10mMAMP、100mM六偏磷酸钠、pH 7.0和35℃，30h内从70g/L富马酸生成110.8g/LD-泛酸，对应的转化率为83.8％，见图10(d)。然而，在生物转化结束时残留富马酸的量高达5.8g/L，从而影响了从富马酸到D-泛酸的有效转化。
为了解决这个问题，采用分批补料培养策略，将底物分5次加入，将富马酸浓度控制在14g/L以下。30h内，70g/L富马酸生成128.6g/L D-泛酸，转化率为97.3％，转化产物中检测到的残留富马酸含量<1.0g/L，见图10(d)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，过表达L-天冬氨酸酶基因CgAspA、L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因BsPanDE56S、泛酸合成酶基因BbPanC和多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述L-天冬氨酸酶基因CgAspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因BsPanDE56S的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述泛酸合成酶基因BbPanC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述多磷酸依赖性AMP激酶基因PaPPK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pETDuet-1质粒表达CgAspA、BbPanC和PaPPK基因，以pET-28a(+)质粒表达BsPanDE56S基因。
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的宿主为EscherichiacoliBL21(DE3)。
5.构建权利要求1～4任一所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基因以BbPanC、PaPPK和CgAspA的顺序连接至质粒pETDuet-1上，得到重组质粒1；
(2)将三个拷贝的基因BsPanDE56S连接至翻译起始区优化后的质粒pET-28a(+)上，得到重组质粒2；所述翻译起始区优化是以TIR-1替换TIR；所述TIR-1的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述TIR的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
(3)将步骤(1)、步骤(2)构建的重组质粒1、重组质粒2转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌。
6.一种全细胞生产D-泛酸的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述重组大肠杆菌的湿菌体加入含有富马酸的催化体系中进行反应。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述催化体系包括：30-40g/L全细胞催化剂、70-80g/L富马酸、50-60mMTris-HCl、10-15mMAMP、100-120mM六偏磷酸钠和600-700mMD-泛解酸制备液；所述D-泛解酸制备液由D-泛酰内酯和等摩尔量的氢氧化钠水溶液反应制得。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应的pH为7.0，温度为35℃。
9.根据权利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，反应过程中进行补料，将富马酸浓度控制在14g/L以内。
10.权利要求1～4任一所述重组大肠杆菌，或权利要求5所述方法，或权利要求6～9任一所述方法在制药、食品和化工领域中生产D-泛酸或D-泛酸盐的应用。
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