KR20040004495A

KR20040004495A - 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산(ｈｍｂｐａ)의 제조 방법 및 이를 위한 미생물

Info

Publication number: KR20040004495A
Application number: KR20037009570A
Authority: KR
Inventors: 테론 헤르만; 토마스 에이. 패터슨; 제니스 지. 페로; 알. 로저스 요쿰; 카이-우베 발데니우스; 크리스틴 베크
Original assignee: 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-19
Publication date: 2004-01-13
Also published as: WO2002057476A9; WO2002057476A2; CN1496400A; CA2434518A1; JP2005503758A; EP1377662A2; WO2002057476A3; AU2002241944A1

Abstract

본 발명은 변형된 판토테네이트 생합성 효소 활성을 갖는 미생물을 이용하여 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA") 및 α-히드록시이소발레레이트 ("α-HIV")를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 재조합 미생물 및 그를 배양하기 위한 조건을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 HMBPA를 포함하는 조성물 및 α-HIV를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.

Description

3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (ＨＭＢＰＡ)의 제조 방법 및 이를 위한 미생물 {Methods and Microorganisms for the Production of 3-(2-Hydroxy-3-Methyl-Butyrylamino)-Propionic Acid (HMBPA)}

<관련 출원>

본 발명은 2001년 1월 19일 출원되어 계류중인 가출원 제60/263,053호를 우선권으로 주장한다. 또한 본 발명은 2000년 9월 21일 출원되어 계류중인 미국 특허출원 제09/667,569호와 관련이 있으며, 이는 1999년 9월 21일 출원되어 포기된 미국 특허출원 제09/400,494호의 일부계속 출원이다. 미국 특허출원 제09/667,569호는 또한 2000년 6월 7일 출원된 가출원 제60/210,072호, 2000년 7월 28일 출원된 가출원 제60/221,836호 및 2000년 8월 24일 출원된 가출원 제60/227,860호를 우선권으로 주장한다. 상기 언급된 각 출원서의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.

화학 화합물을 합성하는 종래의 방법으로는 벌크 화학물질로부터의 합성을 통한 것이 있으며, 이 방법은 기질 이용가능성 및(또는) 비용, 생성물들의 복합 혼합물을 분리하는데 있어서의 어려움, 정제된 형태의 화합물을 다량으로 합성하는데 있어서의 복잡함, 및 키랄 화합물을 제조하는데 있어서의 어려움과 같은 원인에 의해 제한받는다. 따라서, 최근에 연구자들은 다양한 생합성 방법, 예를 들어 제약 화합물, 연구용 시약, 영양물질, 비타민, 영양 보충물질 및 항생제 화합물 등의 합성에 있어서 유용한 효소를 발현시키는 박테리아 또는 미생물 시스템을 주목하여 왔다. 특히, 생물전환 방법은 바람직한 화합물의 생산을 촉진시키는 수단으로 평가받아 왔으며, 최근에는 미생물을 이용한 직접적인 합성 방법이 제약 및 농업 분야에서 많은 연구의 중심이 되고 있다.

<발명의 요약>

본 발명은 미생물을 이용하여 본원에서 "β-알라닌 2-(R)-히드록시이소발레레이트," "β-알라닌 2-히드록시이소발레레이트," "β-알라닐-α-히드록시이소발레레이트," N-(2-히드록시-3-메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌 ("HMOBA") 및(또는) "판토테네이트"로 바꾸어 부르기도 하는 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 또는 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA")을 직접 합성하는 방법에 관한 것이다. 특히, 통상적으로 판토테네이트 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 생합성과 관련된 몇몇 효소를 과발현시키도록 조작된 미생물에서 판토테네이트 생합성의 주요 전구체, 즉 α-케토이소발레레이트 (α-KIV) 및 β-알라닌과 경쟁하는 다른 생합성 경로가 존재한다는 것이 본 발명에 이르러 밝혀졌다. α-KIV는 다양한 리덕타제 효소의 촉매 작용에 의해 α-히드록시이소발레레이트 (α-HIV)로 전환되며, 이후 α-HIV는 β-알라닌과 축합되어 HMBPA를 생성한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 증가된 케토 리덕타제 활성 또는 증가된 판토테네이트 신테타제 활성을 갖는 미생물을 과량의 α-케토이소발레레이트 및 과량의 β-알라닌의 존재하에 배양하여 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산(HMBPA)이 생산되도록 하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 증가된 케토 리덕타제 활성 및 증가된 판토테네이트 신테타제 활성을 갖는 미생물을 과량의 α-케토이소발레레이트 및 과량의 β-알라닌의 존재하에 배양하여 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 미생물은 변형된panE유전자, 예를 들어 변형된panE1유전자 및(또는) 변형된panE2유전자 (예를 들어,panE유전자는 과발현되거나, 탈조절 (deregulation)되거나, 또는 여러 카피수로 존재함)를 갖는다. 다른 실시양태에서, 미생물은 변형된panC유전자 (예를 들어,panC유전자는 과발현되거나, 탈조절되거나, 또는 여러 카피수로 존재함)를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 미생물은 증가된 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 활성을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 미생물을 과량의 α-케토이소발레레이트 및 과량의 β-알라닌의 존재하에 증가된 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 활성 조건에서 배양하여 HMBPA가 생산되도록 한다. 또 다른 실시양태에서, 미생물은 변형된ilvC유전자 (예를 들어,ilvC유전자는 과발현되거나, 탈조절되거나, 또는 여러 카피수로 존재함)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 미생물은 감소된 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성을 추가로 포함한다 (예컨대, 변형된panB유전자, 예를 들어 결실된panB유전자를 갖는다).

다른 측면에서, 본 발명은 감소된 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 미생물을 과량의 α-케토이소발레레이트 및 과량의 β-알라닌의 존재하에 배양하여 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법을 특징으로 한다. 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 미생물을 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA) 생산이 판토테네이트 생산에 비해 증가되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, HMBPA 생산을 판토테네이트 생산에 비해 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 PanE1 또는 PanE2를 과발현시키고 감소된 PanC 또는 PanD 활성을 추가로 갖는 미생물을 2-히드록시이소발레르산 (α-HIV)이 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, α-HIV의 제조 방법을 특징으로 한다. 다른 측면에서, 본 발명은serA또는glyA의 발현 또는 활성이 감소된 재조합 미생물을 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법을 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은serA및glyA의 발현 또는 활성이 감소된 재조합 미생물을 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법을 특징으로 한다. 상기 기재된 미생물의 배양을 위한 조건은 예를 들어 정상 상태 (steady state)의 글루코스가 증가된 조건, 정상 상태의 용존 산소가 감소된 조건 및(또는) 세린이 감소된 배양 조건을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 기술된 과정 및(또는) 방법에 따라 제조된 생성물을 특징으로 한다. 상기 기술된 방법에서 이용된 재조합 미생물도 본 발명의 특징을 구성한다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 화합물은 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어,HMBPA를 사용하여 HMG CoA 리덕타제 (II)의 저해제를 합성할 수 있다 (Gordon et al. Bio. Med. Chem. Lett. 1(3):161 (1991)). HMG CoA 리덕타제 (II)의 저해제는 콜레스테롤과잉혈증 및 관상동맥죽상경화증 진행의 치료에 있어서의 용도가 연구되어 왔다. 또한 HMG CoA 리덕타제의 저해제를 사용하여 심혈관계 질환의 위험이 있는 대상체에서 그러한 위험을 감소시키기도 하였다. 또한, HMBPA 전구체 2-히드록시이소발레레이트 (α-HIV)는 예를 들어 피부 노화의 예방에서 영양물질의 특성을 갖는 것으로 입증되었다. 특히, α-히드록시산, 예를 들어 α-HIV (또는 2-히드록시발린)을 사용하여 α-히드록시 에스테르를 합성할 수 있으며, 이 에스테르는 글루코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 콜라겐, 엘라스틴, 및 기타 피부 성분의 생합성을 증가시켜 피부 두께의 증가를 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 화합물을 사용하여 피부 질환, 예를 들어 검버섯 (age spot), 피부 주름, 주름, 광노화 및 노화를 치료할 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 특허청구의 범위로부터 분명해질 것이다.

도 1은 판토테네이트 및 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로의 개요도이다. 판토테네이트 생합성 효소들은 굵은 글씨로 나타내었으며, 이들의 상응하는 유전자들은 이탤릭체로 나타내었다. 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소들은 굵은 글씨의 이탤릭체로 나타내었고, 이들의 상응하는 유전자들은 이탤릭체로 나타내었다.

도 2는 비. 서브틸리스 (B. subtilis)에서 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA")을 형성하는 생합성 경로의 개요도이다.

도 3은 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA")의 구조를 나타내는 개요도이다.

도 4는 14 L 규모의 PA824 발효물 유래의 배지 샘플의 HPLC 크로마토그램이다.

도 5는 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산의 상대적 단일동위원소 질량을 나타내는 질량 스펙트럼이다.

도 6은 공지된 또는 추정된 PanB 단백질로부터의 C-말단 아미노산의 정렬을 나타낸다.

도 7은 플라스미드 pAN624의 구조를 나타내는 개요도이다.

도 8은 플라스미드 pAN620의 구조를 나타내는 개요도이다.

도 9는 플라스미드 pAN636의 구조를 나타내는 개요도이다.

도 10은 클로람페니콜을 사용하여 하나 또는 여러 카피수에 대하여 선별할 수 있는 플라스미드 pAN637의 구조를 나타내는 개요도이다.

도 11은P ₂₆ 프로모터로부터 비. 서브틸리스panE2를 과발현시키는 플라스미드 pAN238의 구조를 나타내는 개요도이다.

본 발명은 적어도 부분적으로는 박테리아에서 신규 생합성 경로, 즉 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA") 생합성 경로의 발견을 기초로 한다. 특히, 박테리아는 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로의 주요 생성물이자 판토테네이트 생합성 경로의 전구체인 α-케토이소발레레이트 (α-KIV)로부터 HMBPA를 생성시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 박테리아에서 HMBPA의 제조는 판토테네이트 생합성 효소 케토판토에이트 리덕타제 (panE1유전자 생성물) 및(또는) 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 (ilvC유전자 생성물)를 적어도 포함하며, α-KIV의 환원에 의해 형성된 2-히드록시이소발레르산 (α-HIV)과 β-알라닌의 축합반응에 의해 일어난 다음, 이후 판토테네이트 생합성 효소인 판토테네이트 신테타제 (panC유전자 생성물)에 의해 촉매된다. HMBPA 제조는 미생물에서 케토판토에이트 리덕타제 (예, PanE1) 및(또는) PanE2 및(또는) 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 활성 (예, IlvC)을 증가시킴으로써, 예를 들어 상기 효소들을 코딩하는 유전자들을 과발현시키거나 탈조절함으로써 달성한다. HMBPA의 최적의 제조는 미생물에서 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성 (panB유전자 생성물)을 감소시키거나 결실시킴으로써, 예를 들어 상기 미생물에서 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (예, PanB)를 코딩하는panB유전자를 변형시키거나 결실시키고, 임의로 케토판토에이트 리덕타제 및(또는) PanE2 및(또는) 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 활성을 증가시킴으로써 달성한다. 기질인 α-KIV 및 β-알라닌은 HMBPA의 제조에 필요하며, 후자는 예를 들어 β-알라닌 공급 및(또는) 증가된 아스파르테이트-α-데카르복실레이트 활성 (panD유전자 생성물)에 의해 제공된다. 기질 농도 (즉, α-KIV 및(또는) β-알라닌)를 증가시키면 HMBPA의 생산량이 더 증가된다. α-KIV 생산은ilvBNCD유전자 및(또는)alsS를 과발현시킴으로써 증가시킬수 있다. HMBPA 생산은 적절하게 조작된 미생물에서 세린의 이용가능성 또는 합성을 제한함으로써 더 증가시킬 수 있다.

본 발명을 보다 잘 이해하기 위해, 먼저 하기에서 몇가지 용어들에 대하여 정의하였다.

용어 "판토테네이트 생합성 경로"는 판토테네이트의 형성 또는 합성에 이용되는 판토테네이트 생합성 효소 (예, 생합성 효소-코딩 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드), 화합물 (예, 전구체, 기질, 중간체 또는 생성물) 및 보조인자 등을 포함하는 생합성 경로를 포함한다. 용어 "판토테네이트 생합성 경로"는 미생물 (예, 생체내)에서 판토테네이트의 합성을 일으키는 생합성 경로 및 시험관내에서 판토테네이트의 합성을 일으키는 생합성 경로를 포함한다.

용어 "판토테네이트 생합성 효소"는 판토테네이트 생합성 경로의 화합물 (예, 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 임의의 효소를 포함한다. 예를 들어, α-케토이소발레레이트 (α-KIV)로부터 판토에이트의 합성은 중간체인 케토판토에이트를 통해 진행한다. 케토판토에이트의 형성은 판토테네이트 생합성 효소인 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (panB유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 판토에이트의 형성은 판토테네이트 생합성 효소인 케토판토에이트 리덕타제 (panE유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 아스파르테이트로부터 β-알라닌의 합성은 판토테네이트 생합성 효소인 아스파르테이트-α-데카르복실라제 (panD유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 판토에이트 및 β-알라닌으로부터 판토테네이트의 형성 (예, 축합)은 판토테네이트 생합성 효소인 판토테네이트 신테타제 (panC유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 새로 발견된 HMBPA 생합성 경로를 기초로, 판토테네이트 생합성 효소는 본원에 기재된 HMBPA 생합성 경로에서 효소로서 다른 기능을 수행할 수도 있다.

용어 "판토테네이트"는 "판토텐산"으로 부르기도 하는 판토테네이트의 유리 산 형태 및 "판토테네이트염"으로 부르기도 하는 (예를 들어, 판토테네이트 또는 판토텐산의 산성 수소를 칼슘, 나트륨, 칼륨, 암모늄과 같은 양이온으로 치환함으로써 유도된) 그의 임의의 염을 포함한다. 용어 "판토테네이트"는 또한 판토테네이트의 알콜 유도체를 포함한다. 바람직한 판토테네이트염은 칼슘 판토테네이트 또는 소듐 판토테네이트이다. 바람직한 알콜 유도체는 판토테놀이다. 본 발명의 판토테네이트염 및(또는) 알콜은 통상의 방법에 의해 본원에 기재된 유리 산으로부터 제조된 염 및(또는) 알콜을 포함한다. 다른 실시양태에서, 칼슘 판토테네이트는 본 발명의 미생물에 의해 직접 합성된다. 유사하게, 본 발명의 판토테네이트염은 통상의 방법에 의해 판토테네이트 또는 판토텐산의 유리 산 형태로 전환시킬 수 있다.

용어 "이소루이신-발린 생합성 경로"는 피루베이트의 발린 또는 이소루이신으로의 전환의 형성 또는 합성에 이용되는 이소루이신-발린 생합성 효소 (예, 생합성 효소-코딩 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드), 화합물 (예, 전구체, 기질, 중간체 또는 생성물) 및 보조인자 등을 포함하는 생합성 경로를 포함한다. 용어 "이소루이신-발린 생합성 경로"는 미생물 (예, 생체내)에서 발린 또는 이소루이신의 합성을 일으키는 생합성 경로 및 시험관내에서 발린 또는 이소루이신의 합성을 일으키는 생합성 경로를 포함한다. 도 1은 이소루이신-발린 생합성 경로의 개요도를 포함한다. 이소루이신-발린 생합성 효소들은 굵은 글씨의 이탤릭체로 나타내었으며, 이들의 상응하는 유전자들은 이탤릭체로 나타내었다.

용어 "이소루이신-발린 생합성 효소"는 이소루이신-발린 생합성 경로의 화합물 (예, 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 임의의 효소를 포함한다. 도 1에 따라, 피루베이트로부터 발린의 합성은 중간체들인 아세토락테이트, α,β-디히드록시이소발레레이트 (α,β-DHIV) 및 α-케토이소발레레이트 (α-KIV)를 통해 진행한다. 피루베이트로부터 아세토락테이트의 형성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 아세토히드록시산 신테타제 (ilvBN유전자 생성물 또는alsS유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 아세토락테이트로부터 α,β-DHIV의 형성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 아세토히드록시산이소메로리덕타제 (ilvC유전자 생성물)에 의해 촉매된다. α,β-DHIV로부터 α-KIV의 합성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 디히드록시산 데히드라타제 (ilvD유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 또한, 발린 및 이소루이신은 분지쇄 아미노산 트랜스아미나제에 의해 이들 각각의 α-케토 화합물로 상호전환시킬 수 있다. 새로 발견된 HMBPA 생합성 경로를 기초로, 이소루이신-발린 생합성 효소는 본원에 기재된 HMBPA 생합성 경로에서 효소로서 다른 기능을 수행할 수도 있다.

용어 "3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA") 생합성 경로"는 HMBPA의 형성 또는 합성에 이용되는 판토테네이트 생합성 경로와 전통적으로 관련된 생합성 효소 및 화합물 (예, 기질 등)을 포함하는 다른 생합성 경로를 포함한다. 용어 "HMBPA 생합성 경로"는 미생물 (예, 생체내)에서 HMBPA의 합성을 일으키는 생합성 경로 및 시험관내에서 HMBPA의 합성을 일으키는 생합성 경로를 포함한다.

용어 "HMBPA 생합성 효소"는 HMBPA 생합성 경로의 화합물 (예, 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 임의의 효소를 포함한다. 예를 들어, α-케토이소발레레이트 (α-KIV)로부터 2-히드록시이소발레르산 (α-HIV)의 합성은panE1또는panE2유전자 생성물 (본원에서 케토판토에이트 리덕타제로 부르기도 하는 PanE1, 또는 판토테네이트 생합성에 유의하게 기여하지 않는 α-케토산 리덕타제인 PanE2)에 의해 촉매되고(되거나)ilvC유전자 생성물 (본원에서 아세토히드록시산 이소메로리덕타제로 부르기도 함)에 의해 촉매된다. β-알라닌 및 α-HIV로부터 HMBPA의 형성은panC유전자 생성물 (본원에서 판토테네이트 신테타제로 부르기도 함)에 의해 촉매된다.

용어 "3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA")"은 "3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피오네이트"로도 부르는 HMBPA의 유리 산 형태뿐 아니라, "3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산염" 또는 "HMBPA 염"으로도 부르는, 예를 들어 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 또는 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피오네이트의 산성 수소를 칼슘, 나트륨, 칼륨, 암모늄과 같은 양이온으로 치환하여 유도된 그의 임의의 염도 포함한다. 바람직한 HMBPA 염은 칼슘 HMBPA 또는 나트륨 HMBPA이다. 본 발명의 HMBPA 염은 통상의 방법을 통해 본원에 기재된 유리 산으로부터 제조된 염을 포함한다.본 발명의 HMBPA 염은 통상의 방법에 의해 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 또는 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피오네이트의 유리 산 형태로 유사하게 전환시킬 수 있다.

하기 서브섹션에는 본 발명의 다양한 측면들이 보다 상세히 기술되어 있다.

I. 다양한 판토테네이트 및(또는) 이소루이신-발린( ilv ) 및(또는) HMBPA 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 표적화

한 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트 및(또는) 이소루이신-발린(ilv) 및(또는) HMBPA 생합성 경로의 다양한 생합성 효소를 표적화하거나 변형시키는 것을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 상기 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 변형시키거나 변화시킴으로써 상기 경로와 관련된 다양한 효소 활성을 변화시키는 것을 특징으로 한다.

본원에 사용된 "유전자"라는 용어는 유기체내에서 유전자사이 DNA (즉, 유기체의 염색체 DNA에서 자연적으로 유전자를 플랭킹 (flanking)하고(하거나) 유전자들을 분리시키는 개입 또는 스페이서 DNA)에 의해 다른 유전자 또는 또다른 유전자로부터 분리될 수 있는 핵산 분자 (예, DNA 분자 또는 그의 단편)를 포함한다. 또는, 유전자는 다른 유전자와 약간 중첩될 수 있는데 (예를 들어, 제1 유전자의 3' 말단이 제2 유전자의 5' 말단과 중첩됨), 이러한 중첩성 유전자들은 개입 DNA에 의해 다른 유전자들로부터 분리된다. 유전자는 효소 또는 다른 단백질 분자의 합성을 지시하거나 (예를 들어, 단백질을 코딩하는 연속적인 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 같은 코딩 서열을 포함할 수 있음), 그 자체로 유기체내에서 기능적일 수 있다.유기체내의 유전자는 본원에 정의된 바와 같이 오페론내에 밀집될 수 있으며, 이 오페론은 개입 DNA에 의해 다른 유전자들 및(또는) 오페론들로부터 분리된다. 본원에 사용된 "단리된 유전자"라는 용어는 해당 유전자가 유도된 유기체의 염색체 DNA에서 유전자를 자연적으로 플랭킹하는 서열이 본질적으로 없으며 (즉, 제2의 또는 상이한 단백질을 코딩하는 인접 코딩 서열 또는 인접 구조 서열 등이 없음), 임의로 5' 및 3' 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열 및(또는) 종결 서열을 포함하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 유전자는 단백질에 대한 코딩 서열 (예를 들어, 바실러스 (Bacillus) 단백질을 코딩하는 서열)을 주로 포함한다. 다른 실시양태에서, 단리된 유전자는 단백질 (예를 들어, 바실러스 단백질)에 대한 코딩 서열 및 이 유전자가 유도된 유기체의 염색체 DNA로부터의 인접한 5' 및(또는) 3' 조절 서열 (예, 인접한 5' 및(또는) 3' 바실러스 조절 서열)을 포함한다. 바람직하게, 단리된 유전자는 해당 유전자가 유도된 유기체의 염색체 DNA에서 이 유전자를 자연적으로 플랭킹하는, 약 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.2 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp 또는 10 bp 미만의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

용어 "오페론"은 하나 이상의 유전자 또는 ORF의 5' 또는 3' 말단 서열에서 임의로 중첩하는 2개 이상의 인접한 유전자 또는 ORF를 포함한다. 용어 "오페론"은 프로모터 및 가능하게는 하나 이상의 인접한 유전자 또는 ORF (예, 생합성 효소와 같은 효소를 코딩하는 구조 유전자)와 관련된 조절 요소를 포함하는 통합된 유전자 발현 단위를 포함한다. 유전자 (예, 구조 유전자)의 발현은, 예를 들어 조절 요소에 결합하는 조절 단백질 또는 전사 종결 방지에 의해 통합적으로 조절될 수있다. 오페론으로 구성된 유전자 (예, 구조 유전자)가 전사되어 모든 단백질을 코딩하는 단일 mRNA를 제공할 수 있다.

본원에 사용된 "돌연변이를 포함하는 유전자" 또는 "돌연변이 유전자"는 이 돌연변이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질이 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질과 상이한 활성을 나타내도록 하나 이상의 변화 (예, 치환, 삽입, 결실)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 돌연변이를 포함하는 유전자 또는 돌연변이 유전자는 예를 들어 유사한 조건하에 분석했을 때 (예를 들어, 동일한 온도에서 배양된 미생물에서 분석했을 때) 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 증가된 활성을 나타내는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 본원에 사용된 바와 같이, "증가된 활성" 또는 "증가된 효소 활성"은 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 적어도 5％ 더 높은 활성, 바람직하게는 적어도 5 내지 10％ 더 높은 활성, 보다 바람직하게는 적어도 10 내지 25％ 더 높은 활성, 보다 더 바람직하게는 적어도 25 내지 50％, 50 내지 75％, 또는 75 내지 100％ 더 높은 활성이다. 상기 언급된 수치에 대한 중간 범위, 예를 들어 75 내지 85％, 85 내지 90％, 90 내지 95％도 본 발명에 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "증가된 활성" 또는 "증가된 효소 활성"은 또한 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 적어도 1.25배 더 높은 활성, 바람직하게는 적어도 1.5배 더 높은 활성, 보다 바람직하게는 적어도 2배 더 높은 활성, 보다 더 바람직하게는 적어도 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그보다 더 높은 활성을 포함할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 돌연변이를 포함하는 유전자 또는 돌연변이 유전자는 예를 들어 유사한 조건하에 분석했을 때 (예를 들어, 동일한 온도에서 배양된 미생물에서 분석했을 때) 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 감소된 활성을 나타내는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 또한 돌연변이 유전자는 폴리펩티드를 전혀 코딩하지 않거나, 야생형 폴리펩티드를 감소된 수준으로 생산할 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "감소된 활성" 또는 "감소된 효소 활성"은 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 적어도 5％ 더 낮은 활성, 바람직하게는 적어도 5 내지 10％ 더 낮은 활성, 보다 바람직하게는 적어도 10 내지 25％ 더 낮은 활성, 보다 더 바람직하게는 적어도 25 내지 50％, 50 내지 75％, 또는 75 내지 100％ 더 낮은 활성이다. 상기 언급된 수치에 대한 중간 범위, 예를 들어 75 내지 85％, 85 내지 90％, 90 내지 95％도 본 발명에 의해 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "감소된 활성" 또는 "감소된 효소 활성"은 결실되거나 "녹아웃 (knocked out)"된 활성 (예를 들어, 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 대략 100％ 더 적은 활성)을 포함할 수도 있다.

활성은 특정의 대상 단백질의 활성을 측정하기 위한, 충분히 허용되는 임의의 분석법에 따라 결정할 수 있다. 활성은 예를 들어 세포 또는 미생물로부터 단리 또는 정제된 단백질의 활성을 측정함으로써 직접 측정하거나 분석할 수 있다. 또는, 활성은 세포 또는 미생물내에서 또는 세포외 배지에서 측정하거나 분석할 수있다. 예를 들어, 돌연변이 유전자 (즉, 감소된 효소 활성을 코딩하는 상기 돌연변이)에 대한 분석은, 예를 들어 온도 감응성 효소를 포함하는 돌연변이 미생물과 같은 미생물에서 돌연변이된 유전자를 발현시키고 이 돌연변이 유전자를 효소 활성에 대하여 온도 감응성 (Ts) 돌연변이를 보완하는 능력에 대하여 분석함으로써 달성할 수 있다. "증가된 효소 활성"을 코딩하는 돌연변이 유전자는, 예를 들어 Ts 돌연변이를 상응하는 야생형 유전자보다 더 효과적으로 보완하는 것일 수 있다. "감소된 효소 활성"을 코딩하는 돌연변이 유전자는, 예를 들어 Ts 돌연변이를 상응하는 야생형 유전자보다 덜 효과적으로 보완하는 것이다.

당업자라면 핵산 또는 유전자 서열에서 하나만 치환되더라도 (예를 들어, 상응하는 아미노산 서열에서 하나의 아미노산의 변화를 코딩하는 염기 치환) 상응하는 야생형 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질의 활성에 크게 영향을 줄 수 있다는 것을 알 것이다. 본원에 정의된 바와 같이, 돌연변이 유전자 (예를 들어, 돌연변이 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩함)는 이 돌연변이 유전자가 야생형 유전자를 발현시키는 상응하는 미생물에 비해 상기 돌연변이 유전자를 발현시키거나 상기 돌연변이 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 미생물 (즉, 돌연변이 미생물)에서 상이하거나 다른 표현형으로서 임의로 관찰가능한 변화된 활성을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩한다는 점에서 단백질 상동체 (homologue)를 코딩하는 핵산 또는 유전자와는 쉽게 구별될 수 있다. 이와는 달리, 단백질 상동체는 미생물에서 생산되는 경우 야생형 유전자를 발현시키는 상응하는 미생물에 비해 동일하거나 실질적으로 유사한 활성, 임의로는 표현형으로는구별할 수 없는 활성을 나타낸다. 따라서, 상동체와 돌연변이를 구별짓는 역할을 하는 것은 예를 들어 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드 사이의 서열 동일성 정도가 아니라, 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드의 활성인데, 상동체는 예를 들어 낮은 (예를 들어, 30 내지 50％의 서열 동일성) 서열 동일성을 갖지만 실질적으로 동등한 기능적 활성을 나타내며, 돌연변이는 예를 들어 99％의 서열 동일성을 갖지만 크게 다르거나 변화된 기능적 활성을 나타낸다.

또한 당업자라면 본 발명에 이용되는 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드가 HMBPA 생합성 경로,ilv생합성 경로 또는 판토테네이트 생합성 경로를 포함하는 임의의 미생물로부터 유도될 수 있음을 알 것이다. 당업자라면 상동성 스크리닝 및 서열 비교 등과 같은 공지된 기술을 이용하여 상기 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드를 확인하고, (예를 들어, 본원에 기재되어 있고 당업계에 공지되어 있는 기술에 따라, 적절한 프로모터, 리보좀 결합 부위, 발현 또는 통합 벡터를 사용하고, 전사가 증가되도록 유전자 서열을 변화시키는 방법에 의해 (바람직한 코돈의 사용을 고려함)) 상기 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드가 재조합 미생물에서 발현 또는 생산되도록 하는 방식으로 변형시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 그람 (Gram) 양성 미생물 유기체 (예를 들어, 미생물을 둘러싸는 그람-양성 세포벽의 존재로 인해 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)과 같은 염기성 염료를 보유하는 미생물)로부터 유도된다. 용어 "~로부터 유도된" (예를 들어, 그람 양성 미생물"로부터 유도된")이란 미생물에 자연적으로 존재하는 (예를 들어, 그람 양성 미생물에 자연적으로 존재하는) 유전자를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 바실러스, 코리네박테리움 (Corynebacterium) (예, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)), 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코사이 (Lactococci) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속 (genus)에 속하는 미생물로부터 유도된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 바실러스 속에 속하는 미생물로부터 유도된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 렌티모르부스 (Bacillus lentimorbus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실러스 판토텐티쿠스 (Bacillus pantothenticus), 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 시르쿨란스 (Bacillus circulans), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans), 및 다른 그룹 1 바실러스 종, 예를 들어 16S rRNA 타입을 특징으로 하는 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유도된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 유전자는 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis) 또는 바실러스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus)로부터 유도된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유도된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 유전자는 바실러스 서브틸리스로부터 유도된다 (예를 들어, 바실러스 서브틸리스에서 유래함). "바실러스 서브틸리스로부터 유도된" 또는 "바실러스 서브틸리스에서 유래하는"과 같은 용어는 바실러스 서브틸리스 미생물내에 자연적으로 존재하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 범위내에는 바실러스에서 유래하는 유전자 (예, 바실러스 서브틸리스에서 유래하는 유전자), 예를 들어 바실러스 또는 비. 서브틸리스coaX유전자,serA유전자,glyA유전자,coaA유전자,pan유전자 및(또는)ilv유전자가 포함된다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 그람 음성 (염기성 염료를 배제하는) 미생물로부터 유도된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 살모넬라 (Salmonella) (예, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)), 에세리키아 (Escherichia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 세라티아 (Serratia) 및 프로테우스 (Proteus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물로부터 유도된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 에세리키아 속의 미생물로부터 유도된다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli)로부터 유도된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 사카로마이세스 (예, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae))로부터 유도된다.

II. 재조합 핵산 분자 및 벡터

본 발명은 추가로, 본원에 기재된 유전자 (예, 단리된 유전자), 바람직하게는 바실러스 유전자, 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 유전자, 보다 더 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 판토테네이트 생합성 유전자 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 유전자 및(또는) HMBPA 생합성 유전자를 포함하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 DNA 분자)를 특징으로 한다. 용어 "재조합 핵산 분자"는 이 재조합 핵산 분자가 유도된 천연 또는 자연 핵산 분자와 뉴클레오티드 서열에서 차이가 있도록 (예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 치환에 의해) 변화, 변형 또는 조작된 핵산 분자 (예, DNA 분자)를 포함한다. 바람직하게, 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 DNA 분자)는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 단리된 유전자를 포함한다. 구절 "조절 서열(들)에 작동가능하게 연결된"은 대상 유전자의 뉴클레오티드 서열이 유전자의 발현 (예를 들어, 증대되거나, 증가되거나, 구성적이거나, 기초적이거나, 약화되거나, 감소되거나 또는 억제된 발현), 바람직하게는 (예를 들어, 재조합 핵산 분자가 본원에 정의된 바와 같이 재조합 벡터내에 포함되거나 미생물내로 도입되는 경우) 유전자에 의해 코딩된 유전자 생성물의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되어 있는 것을 의미한다.

용어 "조절 서열"은 다른 핵산 서열 (즉, 유전자)의 발현에 영향을 주는 (예를 들어, 조정 또는 조절하는) 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 조절 서열은 그가 자연에서 예를 들어 천연의 위치 및(또는) 방향에서 나타나는 것으로 조절 서열 및 특정의 대상 유전자에 대해 관찰되는 바와 같이 특정 대상 유전자에 대해 유사하거나 동일한 위치 및(또는) 방향으로 재조합 핵산 분자내에 포함된다.예를 들어, 대상 유전자는 천연 유기체에서 대상 유전자를 동반하거나 그에 인접하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 (예를 들어, "천연" 조절 서열 (예를 들어, "천연" 프로모터)에 작동가능하게 연결됨) 재조합 핵산 분자내에 포함될 수 있다. 또는, 대상 유전자는 천연 유기체에서 또다른 (예를 들어, 상이한) 유전자를 동반하거나 그에 인접하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 분자내에 포함될 수 있다. 또는, 대상 유전자는 또다른 유기체로부터의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 분자내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다른 미생물로부터의 조절 서열 (예를 들어, 다른 박테리아 조절 서열 및 박테리오파지 조절 서열 등)은 특정의 대상 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

한 실시양태에서, 조절 서열은 비-천연 또는 비-자연 발생적인 서열 (예를 들어, 화학적으로 합성된 서열을 포함하여 변형, 돌연변이, 치환, 유도체화, 결실된 서열)이다. 바람직한 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 종결 신호, 종결방지 신호 및 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 리프레서 또는 인듀서가 결합되는 서열 및(또는) 예를 들어 전사된 mRNA에서 전사 및(또는) 번역 조절 단백질에 대한 결합 부위)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 (Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 기재되어 있다. 조절 서열은 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들 (예를 들어, 구성적 프로모터 및 강력한 구성적 프로모터), 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 유도가능한 발현을 지시하는것들 (예를 들어, 유도가능한 프로모터, 예컨대 자일로스 유도가능한 프로모터), 및 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 약화시키거나 억제하는 것들 (예를 들어, 약화 신호 또는 리프레서 서열)을 포함한다. 또한 조절 서열을 제거하거나 결실시킴으로써 대상 유전자의 발현을 조절하는 것도 본 발명의 범위내에 포함된다. 예를 들어, 전사의 네가티브 조절에 관여하는 서열은 대상 유전자 발현의 증대를 위해 제거할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 프로모터 또는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 박테리아 유전자 생성물 (예를 들어, 판토테네이트 생합성 효소, 이소루이신-발린 생합성 효소 및(또는) HMBPA 생합성 효소)을 코딩하는 핵산 서열 또는 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 프로모터로는 바실러스 프로모터 및(또는) 박테리오파지 프로모터 (예를 들어, 바실러스를 감염시키는 박테리오파지)가 포함된다. 한 실시양태에서, 프로모터는 바실러스 프로모터, 바람직하게는 강력한 바실러스 프로모터 (예를 들어, 바실러스에서 생화학적 하우스키핑 (housekeeping) 유전자와 관련된 프로모터 또는 바실러스에서 해당작용 경로의 유전자와 관련된 프로모터)이다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 박테리오파지 프로모터이다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 박테리오파지 SP01으로부터의 프로모터이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 예를 들어 하기 각각의 서열을 포함하는P ₁₅ ,P ₂₆ 또는P _veg 로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 프로모터로는 바실러스 (예, 바실러스 서브틸리스)에서 높은 수준의 발현을 촉진시키는tef(전사 연장 인자 (TEF) 프로모터) 및pyc(피루베이트 카르복실라제 (PYC) 프로모터)가 포함된다. 예를 들어 그람 양성 미생물에 이용되는 다른 바람직한 프로모터로는amy및 SPO2 프로모터를 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어 그람 음성 미생물에 사용되는 다른 바람직한 프로모터로는cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIQ, T7, T5, T3,gal, trc, ara, SP6, λ-PR 또는 λ-PL을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 종결 서열 또는 종결 서열들 (예, 전사 종결 서열)을 포함한다. 용어 "종결 서열"은 mRNA의 전사를 종결시키는 작용을 하는 조절 서열을 포함한다. 또한 종결 서열 (또는 일렬로 존재하는 전사 종결자)은 예를 들어 누클레아제에 대하여 (예를 들어, 이 구조를 mRNA에 부가함으로써) mRNA를 안정시키는 작용을 할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 상기 서열을 포함하는벡터의 검출을 허용하는 서열 (즉, 검출가능한 및(또는) 선택가능한 마커), 예를 들어 항생제 내성을 코딩하는 유전자 또는 영양요구주 돌연변이를 극복하는 서열, 예를 들어trpC, 형광 마커, 약물 마커 및(또는) 비색 마커 (예를 들어,lacZ/β-갈락토시다제)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 인공 리보좀 결합 부위 (RBS) 또는 인공 RBS로 전사되는 서열을 포함한다. "인공 리보좀 결합 부위 (RBS)"라는 용어는 mRNA 분자 (예를 들어 DNA 내에서 코딩됨) 내에서 리보좀이 결합 (예를 들어 이러한 결합을 통해 번역을 개시함)하는 부위를 포함하는 것로서, 천연 RBS (예를 들어 자연 발생 유전자에서 발견되는 RBS)와는 1개 이상의 뉴클레오티드가 다르다. 바람직한 인공 RBS에는 천연 RBS (예를 들어 대상 유전자의 천연 RBS, 예를 들어 천연panBRBS또는 천연panDRBS와 약 1 내지 2개, 3 내지 4개, 5 내지 6개, 7 내지 8개, 9 내지 10개, 11 내지 12개, 13 내지 15개 이상의 뉴클레오티드가 상이한, 약 5 내지 6개, 7 내지 8개, 9 내지 10개, 11 내지 12개, 13 내지 14개, 15 내지 16개, 17 내지 18개, 19 내지 20개, 21 내지 22개, 23 내지 24개, 25 내지 26개, 27 내지 28개, 29 내지 30개 이상의 뉴클레오티드가 포함된다.

상이한 뉴클레오티드가 치환되어, 비교를 위해 최적으로 정렬했을 때 이들이 이상적인 RBS의 뉴클레오티드 하나 이상과 동일하게 되는 것이 바람직하다. 이상적인 RBS로는

등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 인공 RBS는 특정 유전자와 관련있는 자연 발생 또는 천연 RBS를 대신하여 사용할 수 있다. 인공 RBS는 바람직하게는 특정 유전자의 번역을 증가시킨다. 바람직한 인공 RBS (예를 들어 바실러스 서브틸리스panB등과 같은panB의 번역을 증가시키기 위한 RBS)로는

등이 있다. 바람직한 인공 RBS (예를 들어 바실러스 서브틸리스panD등과 같은panD의 번역을 증가시키기 위한 RBS)로는

(서열 19) 등이 있다.

본원에 기재한 바와 같이, 본 발명은 핵산 분자 (예를 들어 상기 유전자를 포함하는 유전자 또는 재조합 핵산 분자)를 포함하는 벡터 (예를 들어 재조합 벡터)를 추가의 특징으로 한다. "재조합 벡터"라는 용어는 변화, 변형 또는 조작되어 이것이 유래한 천연 또는 자연 핵산 분자에 포함되어 있는 핵산 서열보다 더 많거나, 더 적거나 또는 이와는 상이한 핵산 서열을 함유하는 벡터 (예를 들어 플라스미드, 파지, 파스미드, 바이러스, 코스미드 또는 다른 정제된 핵산 벡터)를 포함한다. 상기 재조합 벡터는 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열, 종결 서열 및(또는) 본원에서 정의한 인공 리보좀 결합 부위 (RBS)에 작동가능하게 연결된 상기 유전자를 포함하는 생합성 효소-코딩 유전자 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 박테리아에서의 복제를 증대시키는 서열 (예를 들어 복제-증대 서열)을 포함한다. 한 실시양태에서, 복제-증대 서열은 이. 콜라이에서 유래한다. 다른 실시양태에서, 복제-증대 서열은 pBR322에서 유래한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 항생제 내성 서열을 포함한다. "항생제 내성 서열"이라는 용어는 숙주 유기체 (예를 들어 바실러스)에 항생제에 대한 내성을 부여하거나 이를 촉진시키는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항생제 내성 서열은cat(클로람페니콜 내성) 서열,tet(테트라사이클린 내성) 서열,erm(에리쓰로마이신 내성) 서열,neo(네오마이신 내성) 서열,kan(카나마이신 내성) 서열 및spec(스펙티노마이신 내성) 서열로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명의 재조합 벡터는 상동성 재조합 서열 (예를 들어 숙주 유기체의 염색체 내로 대상 유전자가 재조합되도록 설계된 서열)을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 숙주 염색체 내로의 재조합에 대한 상동성 표적으로서bpr, vpr또는amyE서열을 사용할 수 있다. 추가로, 당업자라면 벡터의 설계가 유전적으로 조작될 미생물의 선택 및 원하는 유전자 생성물의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 맞춰질 수 있음을 알 것이다.

IV. 재조합 미생물

본원에 기재한 바와 같이, 본 발명은 벡터 또는 유전자 (예를 들어 야생형 및(또는) 돌연변이된 유전자)를 포함하는 미생물, 즉, 재조합 미생물을 추가의 특징으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 미생물"이라는 용어는 유전자적으로 변화, 변형 또는 조작 (예를 들어 유전적으로 조작)되어 그가 유래한 자연 발생적인 미생물에 비해 변화되거나, 변형되거나 또는 그와 상이한 유전자형 및(또는) 표현형 (예를 들어 유전적 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 미치는 경우)을 나타내는 미생물 (예를 들어 박테리아, 효모 세포, 진균 세포 등)을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 그람-양성 유기체 (예를 들어 미생물을 둘러싼 그람-양성 세포벽의 존재로 인해 크리스탈 바이올렛 등과 같은 염기성 염료로 착색되는 미생물)이다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 바실러스, 코리네박테리움 (예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰), 락토바실러스, 락토코커스 및 스트렙토마이세스로 구성된 군에서 선택된 속에 속하는 미생물이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 바실러스 속이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 렌티모르부스, 바실러스 렌투스, 바실러스 피르무스, 바실러스 판토텐티쿠스, 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스, 바실러스 세레우스, 바실러스 시르쿨란스, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀루스, 바실러스 투린기엔시스, 바실러스 할로두란스 및 다른 그룹 1 바실러스 종, 예를 들어 16S rRNA형을 특징으로 하는 종으로 구성된 군에서 선택된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 바실러스 브레비스 또는 바실러스 스테아로테르모필루스이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 푸밀루스로 구성된 군에서 선택된다.

다른 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 그람-음성 (염기성 염료로 착색되지 않음) 유기체이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 살모넬라 (예를 들어 살모넬라 티피무리움), 에세리키아, 클렙시엘라, 세라티아 및 프로테우스로 구성된 군에서 선택된 속에 속하는 미생물이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 에세리키아 속이다. 훨씬 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 이. 콜라이이다. 다른 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 사카로마이세스 (예를 들어 사카로마이세스 세레비지애)이다.

본 발명의 바람직한 "재조합" 미생물은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 또는 효소, 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로 또는 효소 및(또는) 탈조절된 HMBPA 생합성 경로 또는 효소를 보유하는 미생물이다. "탈조절된" 또는 "탈조절"이라는 용어는 미생물에서 생합성 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자를 변화 또는 변형시킴으로써, 미생물에서 상기 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변화 또는 변경되도록 하는 것을 포함한다. 바람직하게는 생합성 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자가 변화 또는 변형되어 유전자 생성물이 증대되거나 증가된다. 또한, "탈조절된 경로"라는 구절은 생합성 경로의 효소를 코딩하는 1종초과의 유전자가 변화 또는 변형되어 1종 초과의 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변화 또는 변경된 것을 포함할 수도 있다. 몇가지 경우에서, 미생물에서의 경로를 "탈조절"시키는 능력 (예를 들어 주어진 생합성 경로에서 1종 초과의 유전자를 동시에 탈조절시키는 능력)은, 1종 초과의 효소 (예를 들어 2 또는 3종의 생합성 효소)가 "오페론" (본원에서 정의됨)이라 불리는 유전자 물질의 연속적인 조각상에서 서로 인접하게 존재하는 유전자에 의해 코딩되는 미생물의 특정 현상으로부터 발생한다. 오페론에 포함된 유전자들의 통합된 조절로 인하여, 단일 프로모터 및(또는) 조절 요소의 변경 또는 변형이 상기 오페론에 의해 코딩되는 각 유전자 생성물의 발현을 변화 또는 변경시킬 수 있다. 조절 요소의 변화 또는 변형은, 내생성 프로모터 및(또는) 조절 요소(들)의 제거, 강력한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 복수개의 프로모터의 부가 또는 조절 서열의 제거를 통한 유전자 생성물 발현의 변화, 오페론의 염색체 위치 변형, 리보좀 결합 부위 등과 같이 오페론에 인접하거나 오페론에 포함된 핵산 서열의 변경, 오페론의 카피수의 증가, 오페론의 전사 및(또는) 오페론 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예를 들어 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성자 등)의 변형, 또는 유전자의 발현을 탈조절하는, 당업계에 흔한 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어 리프레서 단백질의 발현을 차단하기 위해 안티센스 핵산 분자를 사용하는 것이 포함되나 이에 제한되지는 않음) 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 탈조절은 수득될 1종 이상의 유전자의 코딩 영역 변화, 예를 들어 피드백 내성이거나, 특이적 활성이 더 낮거나 높은 효소도 포함한다.

다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소, 1종 이상의 이소루이신-발린 생합성 효소 및(또는) 1종 이상의 HMBPA 생합성 효소를 과발현하도록 설계되거나 조작된다. "과발현된" 또는 "과발현"이라는 용어는 유전자 생성물 (예를 들어 생합성 효소)의 발현 수준이 미생물 조작 전에 발현되던 수준에 비해, 또는 조작되지 않은 동등한 미생물에서 발현되는 수준에 비해 더 높은 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물은 유전적으로 설계되거나 조작되어, 유전자 생성물을 조작되지 않은 동등한 미생물에서 발현되는 수준보다 더 높은 수준으로 과발현시킬 수 있다.

유전공학적 조작은 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위의 변화 또는 변형 (예를 들어 강력한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 복수개 프로모터의 부가, 또는 조절 서열을 제거하여 발현이 구성적이 되도록 함), 특정 유전자의 염색체 위치 변경, 리보좀 결합 부위 등과 같이 특정 유전자에 인접한 핵산 서열의 변경, 특정 유전자의 카피수의 증가, 특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예를 들어 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성자 등)의 변형, 또는 특정 유전자의 발현을 탈조절하는, 당업계에 흔한 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어 리프레서 단백질의 발현을 차단하기 위해 안티센스 핵산 분자를 사용하는 것이 포함되나 이에 제한되지는 않음) 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 유전공학적 조작은 예를 들어 경로 차단 또는 리프레서의 제거 등과 같은 유전자 결실을 포함할 수도 있다. 결실된 유전자를 포함하는 미생물을 특징으로 하는 한 실시양태에서, 당업자라면 미생물의생존성이 손상되지 않도록 하기 위해 낮은 수준 이상의 여러 화합물이 배양 배지에 존재하거나 이러한 화합물들을 배양 배지에 첨가하는 것이 필요할 수 있음을 알 것이다. 흔히, 이러한 낮은 수준은 통상적으로 제조된 복합 배양 배지중에 존재한다. 또한, 상업적 또는 산업적으로 흥미로운 양의 생성물이 제조되도록 하는 조건하에 배양된, 결실된 유전자를 포함하는 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 방법에서, 배양 배지를 약간 증가된 수준의 여러 화합물들로 보충하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 결실된panB유전자를 포함하는 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 방법에서, 낮은 수준 이상의, 예를 들어 통상적으로 제조된 복합 배지 중에 존재하는 것과 같은 수준의 판토테네이트가 배지중에 존재해야 하지만, 예를 들어 상업적 또는 산업적으로 흥미로운 양의 HMBPA를 제조하기 위해서는 약간 증가된 수준의 판토테네이트가 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 상업적 또는 산업적으로 흥미로운 양의 HMBPA를 제조하기 위해서는 10 내지 30 mg/L의 판토테네이트가 배지에 첨가될 수 있다.

다른 실시양태에서, 미생물을 물리적으로 또는 환경적으로 조작하여, 유전자 생성물이 미생물 조작 전에 발현되던 수준에 비해, 또는 조작되지 않은 동등한 미생물에서 발현되는 수준에 비해 더 높은 수준으로 과발현될 수 있다. 예를 들어 미생물을 특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 생성물의 번역을 증가시킨다고 공지되어 있거나 그럴 것이라고 예상되는 물질로 처리하거나 상기 물질의 존재하에 배양하여 전사 및(또는) 번역을 증대 또는 증가시킬 수 있다. 별법으로, 미생물을 특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 생성물의 번역을 증가시키도록 선택된온도에서 배양하여 전사 및(또는) 번역을 증대 또는 증가시킬 수 있다.

V. 재조합 미생물의 배양 및 발효

"배양하는"이라는 용어는 본 발명의 살아있는 미생물을 유지시키고(시키거나) 성장 (예를 들어 배양물 또는 균주의 유지 및(또는) 성장)시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 액체 배지에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 고체 배지 또는 반고체 배지에서 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 미생물의 유지 및(또는) 성장에 필수적이거나 유익한 영양물질 (예를 들어 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 예를 들어 탄수화물, 탄화수소, 오일, 지방, 지방산, 유기산 및 알콜; 질소 공급원, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 육류의 추출물, 맥아 추출물, 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄; 인 공급원, 예를 들어 인산 및 그의 나트륨염 및 칼륨염; 미량 원소, 예를 들어 마그네슘, 철, 망간, 칼슘, 구리, 아연, 붕소, 몰리브덴 및(또는) 코발트염; 및 성장 인자, 예를 들어 아미노산, 비타민 및 성장 촉진제 등)을 포함하는 배지 (예를 들어 멸균된 액체 배지)에서 배양된다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 조절된 pH하에서 배양된다. "조절된 pH"라는 용어는 원하는 생성물 (예를 들어 HMBPA)이 생산되는 임의의 pH를 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물은 약 pH 7에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 미생물은 pH 6.0 내지 8.5 사이에서 배양된다. 원하는 pH는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 유지될 수 있다.

또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 조절된 폭기 (aeration)하에서 배양된다. "조절된 폭기"라는 용어는 원하는 생성물 (예를 들어 HMBPA)이 생산될 정도의 충분한 공기 (예를 들어 산소) 공급을 포함한다. 한 실시양태에서, 폭기는 배양물 중의 산소 수준 조절을 통해, 예를 들어 배양 배지내 용존 산소의 양 조절을 통해 제어한다. 바람직하게는, 배양물의 폭기는 배양물 교반을 통해 제어한다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반 장치를 통해, 배양 용기 (예를 들어 튜브 또는 플라스크)를 회전 또는 진탕시키거나, 또는 다양한 펌핑 장치를 사용하여 제공할 수 있다. 폭기는 멸균된 공기 또는 산소를 배지를 통해 (예를 들어 발효 혼합물을 통해) 통과시킴으로써 추가로 제어할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 과도한 거품생성이 없이 (예를 들어 소포제의 첨가를 통해) 배양된다.

더욱이, 본 발명의 미생물은 제어된 온도하에서 배양할 수 있다. "제어된 온도"라는 용어는 원하는 생성물 (예를 들어 HMBPA)이 생산되는 임의의 온도를 포함한다. 한 실시양태에서, 제어된 온도는 15℃ 내지 95℃ 사이의 온도를 포함한다. 다른 실시양태에서, 제어된 온도는 15℃ 내지 70℃ 사이의 온도를 포함된다. 바람직한 온도는 20℃ 내지 55℃ 사이이며, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 50℃ 사이이다.

미생물은 액체 배지에서 배양 (예를 들어 유지 및(또는) 성장)될 수 있으며, 바람직하게는 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양 (예를 들어 회전 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 폭기 스피너 배양 또는 발효와 같은 통상적인 배양 방법에 의해 연속적으로 또는 간헐적으로 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 미생물은 진탕 플라스크에서 배양된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 미생물은 발효기 (예를 들어 발효 공정)에서 배양된다. 본 발명의 발효 공정에는 배치 (batch), 공급형-배치 (fed-batch) 및 연속 발효 공정 또는 방법 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다. "배치 공정" 또는 "배치 발효"라는 구절은 배지, 영양물질, 보충 첨가물 등의 조성이 발효의 시작 시점에서 설정되어 발효 도중에 변경되지 않는 시스템을 지칭하지만, 배지의 과도한 산성화 및(또는) 미생물 사멸 방지를 위해서 pH 및 산소 농도와 같은 인자들을 제어하기 위한 시도가 수행될 수 있다. "공급형-배치 공정" 또는 "공급형-배치" 발효라는 구절은 발효가 진행됨에 따라 1종 이상의 기질 또는 보충물을 첨가 (예를 들어 증량하여 첨가하거나 연속적으로 첨가)하는 것을 제외하고는 배치 발효와 동일하다. "연속 공정" 또는 "연속 발효"라는 구절은 정해진 발효 배지를 연속적으로 발효기에 첨가하는 동시에, 사용된 배지 또는 "조정" 배지를 동량만큼 분리하여 바람직하게는 원하는 생성물 (예를 들어 HMBPA)을 회수하는 시스템을 지칭한다. 위와 같은 다양한 공정들이 개발되어 당업계에 공지되어 있다.

"원하는 화합물이 생산되는 조건하에서 배양하는"이라는 구절은 원하는 화합물을 생산하거나, 또는 생산될 특정 화합물을 원하는 수율로 수득하기에 적절하거나 충분한 조건 (예를 들어 온도, 압력, pH, 기간 등)하에서 미생물을 유지 및(또는) 성장시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 원하는 양의 화합물 (예를 들어 HMBPA)을 생산하기에 충분한 시간 동안 계속 배양한다. 바람직하게는, 화합물의 적합한 생산량에 실질적으로 도달하기에 충분한 시간 (예를 들어 HMBPA가 적합한 농도에 도달하기에 충분한 시간 또는 HMBPA:판토테네이트의 적합한 비율에 도달하기에 충분한 시간) 동안 계속 배양한다. 한 실시양태에서, 약 12 내지 24시간 동안 계속 배양한다. 다른 실시양태에서, 약 24 내지 36시간 동안, 36 내지 48시간 동안, 48 내지 72시간 동안, 72 내지 96시간 동안, 96 내지 120시간 동안, 120 내지 144시간 동안 또는 144시간 초과 동안 계속 배양한다. 다른 실시양태에서, 미생물은 약 5 내지 10 g/L 이상의 화합물이 약 36시간 내에 생산되는 조건, 약 10 내지 20 g/L 이상의 화합물이 약 48시간 내에 생산되는 조건 또는 약 20 내지 30 g/L 이상의 화합물이 약 72시간 내에 생산되는 조건하에 배양한다. 또다른 실시양태에서, 미생물은 적어도 1:10의 HMBPA:HMBPA+판토테네이트 비율 (즉, 10％ HMBPA 대 90％ 판토테네이트, 예를 들어 생성물 샘플을 HPLC에 의해 분석했을 때의 피크들을 비교하여 결정함), 바람직하게는 적어도 2:10의 비율 (20％ HMBPA 대 90％ 판토테네이트), 보다 바람직하게는 적어도 2.5:10의 비율 (25％ HMBPA 대 75％ 판토테네이트), 보다 바람직하게는 적어도 3:10 (30％ HMBPA 대 70％ 판토테네이트), 4:10 (40％ HMBPA 대 60％ 판토테네이트), 5:10 (50％ HMBPA 대 50％ 판토테네이트), 6:10 (60％ HMBPA 대 40％ 판토테네이트), 7:10 (70％ HMBPA 대 30％ 판토테네이트), 8:10 (80％ HMBPA 대 20％ 판토테네이트), 9:10 (90％ HMBPA 대 10％ 판토테네이트) 또는 그 이상의 비율이 달성되도록 하는 조건하에 배양한다.

본 발명의 방법은 원하는 화합물 (예를 들어, HMBPA)을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 원하는 화합물의 "회수"라는 용어는 배양 배지로부터 상기 화합물의 추출, 수거, 단리 또는 정제를 포함한다. 화합물의 회수는 통상적인 수지 (예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비이온성 흡착 수지 등)로의 처리,통상적인 흡착제 (예를 들어 활성 목탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로스, 알루미나 등)로의 처리, pH의 변화, 용매 추출 (예를 들어 알콜, 에틸 아세테이트 및 헥산 등과 같은 통상적인 용매를 사용함), 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정 및 동결건조 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 임의의 통상적인 단리 또는 정제 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 배양 배지로부터 회수하기 위해서는 우선 배지에서 미생물을 제거할 수 있다. 이어서, 배지를 양이온 교환 수지를 통해 또는 상기 수지상에 통과시켜 양이온을 제거한 후, 음이온 교환 수지를 통해 또는 상기 수지상에 통과시켜 무기 음이온 및 대상 화합물보다 산도가 더욱 강력한 유기산을 제거한다. 이후, 생성된 화합물은 본원에 기재된 바와 같이 염 (예를 들어 칼슘염)으로 전환될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 원하는 화합물을 "추출", "단리" 또는 "정제"하여 생성된 제제에 다른 배지 성분이 실질적으로 존재하지 않도록 (예를 들어 배지 성분 및(또는) 발효 부산물이 없음) 한다. "다른 배지 성분이 실질적으로 존재하지 않는"이라는 표현은 원하는 화합물이 자신이 생산된 배양물의 배지 성분 또는 발효 부산물로부터 분리된, 원하는 화합물의 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 제제는 원하는 화합물을 약 80％ (건조 중량％) 초과로 함유 (예를 들어 다른 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 20％ 미만임)하고, 더욱 바람직하게는 원하는 화합물을 약 90％ 초과로 함유 (예를 들어 다른 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 10％ 미만임)하고, 훨씬 더욱 바람직하게는 원하는 화합물을 약 95％ 초과로 함유 (예를 들어 다른 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 5％ 미만임)하며, 가장 바람직하게는원하는 화합물을 약 98 내지 99％ 초과로 함유 (예를 들어 다른 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 1 내지 2％ 미만임)한다. 원하는 화합물이 염으로 유도체화된 경우, 상기 화합물은 이러한 염의 형성에 관련되었던 화학적 오염물질도 없는 것이 바람직하다. 원하는 화합물이 알콜로 유도체화된 경우, 상기 화합물은 이러한 알콜의 형성과 관련되었던 화학적 오염물질도 없는 것이 바람직하다.

별법의 실시양태에서, 예를 들어 미생물이 생물학적으로 무해 (예를 들어 안전)할 경우에는 미생물로부터 원하는 화합물을 정제해내지 않는다. 예를 들어 전체 배양물 (또는 배양 상층액)을 생성물 (예를 들어 조 생성물)의 공급원으로서 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 배양물 (또는 배양 상층액)을 변형시키지 않은 채로 사용한다. 다른 실시양태에서, 배양물 (또는 배양 상층액)을 농축시킨다. 다른 실시양태에서, 배양물 (또는 배양 상층액)은 건조시키거나 동결건조시킨다.

바람직하게, 본 발명의 제조 방법은 원하는 화합물을 상당히 높은 수율로 생산한다. "상당히 높은 수율"이라는 구절은 충분히 높거나 유사한 제조 방법에 통상적인 수준보다 높은, 예를 들어 원하는 생성물의 상업적 제조 (예를 들어, 상업적으로 가능한 비용으로의 생성물의 제조)에 충분한 수준으로 증가된 생산 수준 또는 수율을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 미생물을 원하는 생성물 (예, HMBPA)이 2 g/L보다 더 높은 수준으로 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는 제조 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 미생물을 원하는 생성물 (예, HMBPA)이 10 g/L보다 더 높은 수준으로 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는 제조 방법을 특징으로 한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 미생물을 원하는 생성물 (예, HMBPA)이 20 g/L보다 더 높은 수준으로 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는 제조 방법을 특징으로 한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 미생물을 원하는 생성물 (예, HMBPA)이 30 g/L보다 더 높은 수준으로 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는 제조 방법을 특징으로 한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 미생물을 원하는 생성물 (예, HMBPA)이 40 g/L보다 더 높은 수준으로 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는 제조 방법을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 재조합 미생물을 충분히 증가된 수준의 화합물이 상업적으로 바람직한 기간내에 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, 원하는 화합물을 제조하는 제조 방법을 특징으로 한다.

생합성 효소 또는 조작된 생합성 효소들의 조합에 따라, 본 발명의 미생물에 1종 이상의 생합성 전구체를 제공 (예를 들어 공급)하여 원하는 화합물(들)이 생산되도록 하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. "생합성 전구체" 또는 "전구체"라는 용어는 미생물의 배양 배지에 제공되거나 상기 배지와 접촉하거나 상기 배지에 포함될 경우에 원하는 생성물의 생합성을 증대시키거나 증가시키는 기능을 하는 물질 또는 화합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 생합성 전구체 또는 전구체는 아스파르테이트이다. 다른 실시양태에서, 상기 생합성 전구체 또는 전구체는 β-알라닌이다. 아스파르테이트 또는 β-알라닌의 첨가량은 배양 배지 중의 농도가 미생물의 생산성을 증대시키기에 충분한 농도 (예를 들어 HMBPA의 생산을 증대시키기에 충분한 농도)가 되는 양인 것이 바람직하다. "과량의 β-알라닌"이라는용어는 β-알라닌 수준이 해당 미생물의 배양에 일상적으로 이용되는 수준보다 증가되거나 높다는 것을 포함한다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바실러스 미생물의 배양은 약 0 내지 5 g/L의 β-알라닌의 존재하에 수행되는 것이 일상적이다. 따라서, 과량의 β-알라닌 수준은 약 5 내지 10 g/L, 바람직하게는 약 5 내지 20 g/L의 β-알라닌 수준을 포함할 수 있다. 본 발명의 생합성 전구체는 농축된 용액 또는 현탁액 (예를 들어 물 또는 완충액 등과 같은 적합한 용매 중)의 형태로 첨가되거나 고체 형태 (예를 들어 분말 형태)로 첨가될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 생합성 전구체는 단일 분취액으로서, 연속적으로 또는 간헐적으로 주어진 시간에 걸쳐 첨가될 수 있다.

다른 실시양태에서, 생합성 전구체는 발린이다. 또다른 실시양태에서, 생합성 전구체는 α-케토이소발레레이트이다. 바람직하게는, 발린 또는 α-케토이소발레레이트는 목적 생성물 (예, HMBPA)의 제조에 충분한 배지 농도를 나타내는 양으로 첨가된다. 용어 "과량의 α-KIV"는 해당 미생물의 배양에 통상적으로 이용되는 수준보다 증가되거나 더 높은 α-KIV 수준을 포함한다. 예를 들어, 본 실시예에 기재된 바실러스 미생물을 배양하는 것은 α-KIV 약 0 내지 5 g/L의 존재하에 수행할 수 있다. 따라서, 과량의 α-KIV 수준은 약 5 내지 10 g/L, 보다 바람직하게는 약 5 내지 20 g/L의 수준을 포함할 수 있다. 용어 "과량의 발린"은 해당 미생물의 배양에 통상적으로 이용되는 수준보다 증가되거나 더 높은 발린 수준을 포함한다. 예를 들어, 본 실시예에 기재된 바실러스 미생물을 배양하는 것은 발린 약 0 내지 0.5 g/L의 존재하에 통상적으로 수행한다. 따라서, 과량의 발린 수준은 약 0.5 내지 5 g/L, 바람직하게는 약 5 내지 20 g/L의 발린 수준을 포함할 수 있다. 본원에서 생합성 전구체는 또한 "추가의 생합성 기질"이라고도 한다.

또한, 본 발명의 특정 측면은 정상 상태의 글루코스가 증가된 조건, 정상 상태의 용존 산소가 감소된 조건 및(또는) 세린이 감소된 조건하에 미생물 (예, 재조합 미생물)을 배양하는 것을 포함한다. 용어 "정상 상태의 글루코스가 증가된"은 해당 미생물의 배양에 통상적으로 이용되는 수준보다 증가되었거나 더 높은 정상 상태의 글루코스 수준을 포함한다. 예를 들어, 본 실시예에 기재된 바실러스 미생물을 배양하는 것은 통상적으로 정상 상태의 글루코스 약 0.2 내지 1.0 g/L의 존재하에 수행한다. 따라서, 정상 상태의 글루코스 수준의 증가는 약 1 내지 2 g/l, 약 2 내지 5 g/l, 및 바람직하게는 약 5 내지 20 g/L의 정상 상태의 글루코스 수준을 포함할 수 있다. 용어 "정상 상태의 용존 산소가 감소된"은 해당 미생물의 배양에 통상적으로 이용되는 수준보다 더 적거나 더 낮은 정상 상태의 용존 산소 수준을 포함하며, 예를 들어 정상 상태의 글루코스 수준의 증가와 역관계에 있다. 예를 들어, 본 실시예에 기재된 바실러스 미생물을 배양하는 것은 통상적으로 용존 산소가 약 10 내지 30％인 조건하에 수행한다. 따라서, 정상 상태의 용존 산소의 감소는 약 0 내지 10％, 바람직하게는 약 0 내지 5％의 정상 상태의 용존 산소 수준을 포함할 수 있다. 용어 "세린의 감소"은 해당 미생물의 배양에 통상적으로 이용되는 수준보다 더 낮은 범위의 세린 수준을 포함한다. 예를 들어, 본 실시예에 기재된 바실러스 미생물을 배양하는 것은 통상적으로 세린 약 0 내지 0.5 g/L의 존재하에 수행한다. 따라서, 감소된 세린 수준은 예를 들어 0 내지 0.1 g/L의 세린수준을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 본원에 기재한 재조합 미생물을 특징으로 하는 생물형질전환 방법을 특징으로 한다. 본원에서 "생물전환 방법"이라고도 지칭하는 "생물형질전환 방법"이라는 용어는, 적절한 기질 및(또는) 중간체 화합물을 원하는 생성물 (예, HMBPA)로 생산 (예를 들어 형질전환 또는 전환)하는 생물학적 방법을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 리덕타제 (예, PanE1, PanE2 및(또는) IlvC)를 과발현시키는 미생물을 적절한 기질 또는 전구체와, HMBPA가 생산되도록 하는 조건하에 접촉시키는 단계 및 상기 HMBPA를 회수하는 단계를 포함하는, 생물전환에 의한 HMBPA 제조 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 감소 또는 결실된 PanB 활성을 갖는 미생물을 적절한 기질 또는 전구체와, HMBPA가 생산되도록 하는 조건하에 접촉시키는 단계 및 상기 HMBPA를 회수하는 단계를 포함하는, 생물전환에 의한 HMBPA 제조 방법을 특징으로 한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 리덕타제를 과발현시키고 감소 또는 결실된 PanB 활성을 갖는 미생물을 적절한 기질 또는 전구체와, HMBPA가 생산되도록 하는 조건하에 접촉시키는 단계 및 상기 HMBPA를 회수하는 단계를 포함하는, 생물전환에 의한 HMBPA 제조 방법을 특징으로 한다. 상기 기술된 생물전환을 수행하는 바람직한 재조합 미생물은 본원에 기재된 재조합 미생물을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 α-HIV 및 β-알라닌을 단리 또는 정제된 PanC와, HMBPA가 생산되도록 하는 조건하에 접촉시키는 것을 포함하는 생물전환 반응을 특징으로 한다. α-HIV는 α-KIV를 정제 또는 단리된 리덕타제 (예, PanE1, PanE2 및(또는) IlvC) 및 환원성 등가물 공급원, 예를 들어 NADH와 접촉시켜 임의로 얻을 수 있다. α-HIV 또는 HMBPA가 생산되는 조건은 α-HIV 또는 HMBPA의 목적하는 생산을 각각 나타내는 임의의 조건을 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 PanE1 및(또는) PanE2, 및(또는) IlvC를 과발현시키고 감소 또는 결실된 PanC 또는 PanD를 갖는 (각각 HMBPA 또는 β-알라닌 합성을 감소시킴) 미생물을 α-HIV가 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는 α-HIV의 제조 방법을 포함한다.

생물형질전환 반응에 사용되는 미생물(들) 및(또는) 효소는 이들의 의도된 기능 (예를 들어 원하는 화합물의 생산)의 수행이 허용되는 형태로 존재한다 상기 미생물은 온전한 세포이거나, 또는 세포에서 단지 원하는 최종 결과물 수득에 필요한 부분만일 수도 있다. 미생물의 현탁 (예를 들어 완충 용액 또는 배지 등과 같은 적절한 용액 중에 현탁함), 헹굼 (예를 들어 미생물 배양물을 배지가 제거되도록 헹굼), 아세톤-건조, 고정화 (예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 또는 k-카라게난을 사용하여 고정시키거나, 또는 비드, 매트릭스 등의 합성 지지체 상에 고정시킴), 고정, 가교결합 또는 투과화 (예를 들어 투과화된 막 및(또는) 벽을 보유하여 기질, 중간체 또는 생성물 등의 화합물이 상기 막 또는 벽을 더욱 쉽게 통과할 수 있음)가 가능하다.

하기의 실시예를 통해 본 발명을 추가로 예시하지만, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 명세서에서 언급한 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허출원서의 전문은 본원에 참고로 도입된다.

실시예 I: [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA) 생합성 경로의 발견 및 특성화

판토테네이트의 제조를 위한 바실러스 균주를 개발하는데 있어서, 미국 특허출원 제09/400,494호 및 동 제09/667,569호에 기재된 바와 같은 판토테네이트 생합성 경로 및 이소루이신-발린 (ilv) 경로 (도 1)에 관여하는 효소들에 대하여 다양한 유전적 조작을 가하였다. 예를 들어, 탈조절된panBCD오페론을 포함하고(하거나) 탈조절된panE1을 포함하는 균주는 (β-알라닌 및 α-KIV의 존재하에 배양했을 때) 증가된 판토테네이트 생산을 나타내었다.ilvBNC및ilvD에 대하여 추가로 탈조절된 균주는 β-알라닌만 존재하는 조건하에서 증대된 판토테네이트 생산을 나타내었다. 또한,panD를 추가로 탈조절함으로써 β-알라닌 비의존성을 달성할 수 있었다.

전형적인 균주는 PA824, 트립토판 원영양체 (prototroph)로서, Spec 및 Tet 내성이고,panBCD유전자좌에서panBCD에 대해 탈조절되어 있고,panE1유전자좌에서panE1에 대해 탈조절되어 있고 (비. 서브틸리스 게놈내의 두 유전자들은 이. 콜라이panE,panE1및panE2에 대하여 상동성인데, 전자는 판토테네이트 생산에 관여하는 주요 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하지만,panE2는 판토테네이트 합성에 기여하지 않음 (미국 특허출원 제09/400,494호)),ilvD유전자좌에서ilvD에 대해 탈조절되어 있고,amyE유전자좌에서ilvBNC카세트를 과발현시키며,bpr유전자좌에서panD를 과발현시킨다.

PA824에 의한 판토텐산의 제조를 14 L 규모의 발효 용기에서 조사하였다. 배치 (batch) 및 피드 (feed) 배지의 조성은 다음과 같았다.

배치 배지의 최종 부피는 6 L이었다. 미량 원소 용액 SM-1000X의 조성은 다음과 같았다: Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.15 g, H₃BO₃2.5 g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.7 g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.25 g, MnCl₂ㆍ4H₂O 1.6 g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.3 g을 물에 용해시켰다 (최종 부피 1 L).

배치 배지에 쉐이크 플라스크 PA824 배양물 60 ml를 접종하였다 (SVY 배지 중 OD = 10: H₂O 740 ml 중 디프코 빌 주입 (Difco Veal Infusion) 브로쓰 25 g, 디프코 효모 추출물 5 g, 글루탐산 나트륨 5 g, (NH₄)₂SO₄2.7 g, 오토클레이브; 무균 1 M K₂HPO₄(pH 7) 200 ml 및 무균 50％ 글루코스 용액 60 ml 첨가 (최종 부피 1L)). 발효를 43 ℃의 온도, 12 L/min의 공기 유속에서 글루코스가 제한적으로 공급된 배치로서 수행하였다. 초기의 배치 글루코스 (2.5 g/L)는 기하급수적 성장 동안 소비되었다. 이후, 글루코스 농도는 다음과 같은 피드 (FEED) 용액의 지속적인 공급에 의해 0.2 내지 1 g/L 사이에서 유지되었다.

공급 속도가 가변적인 펌프는 컴퓨터로 제어되었으며, 알고리즘에 의해 탱크내의 글루코스 농도와 연관이 있었다. 이 실시예에서, 총 공급량은 6 L이었다.

발효 동안, pH는 7.2로 설정되었다. 제어는 컴퓨터 조절과 연계된 pH 측정에 의해 달성되었다. pH 값은 25％ NH₃-용액 또는 20％ H₃PO₄-용액을 공급하여 유지하였다. NH₃는 발효에서 N-공급원으로서 동시적으로 작용한다. 용존 산소 농도 [pO₂]는 교반 및 폭기 속도의 조절에 의해 30％로 설정되었다. 포말형성은 실리콘유의 첨가에 의해 조절되었다. 이 실시예에서 48시간 후에 공급 용액의 부가를 중단한 다음, [pO₂] 값이 95％에 도달할 때까지 발효를 계속하였다. 이어서, 미생물을 30분 동안 무균화하여 사멸시킴으로써 발효를 중단시켰다. 성공적인 무균화는 발효 브로쓰 샘플을 아가 플레이트상에 플레이팅함으로써 입증되었다. 발효 브로쓰 중 판토테네이트 역가는 무균화, 및 원심분리에 의한 세포의 제거 이후에 21.7 g/L이었다 (HPLC 분석에 의해 결정함).

HPLC 분석을 위해, 발효 브로쓰 샘플을 무균수로 희석시켰다 (1:40). 이 용액 5 ㎕를 HPLC 컬럼 (Aqua C18, 5 ㎛, 150 ×2.0 mm, Phenomenex (등록상표))상에 주입하였다. 컬럼의 온도를 40 ℃에서 유지하였다. 이동상 A는 14.8 mM H₃PO₃이었으며, 이동상 B는 100％ 아세토니트릴이었다. 유속은 0.5 mL/min으로 일정하였다. 하기와 같은 농도구배를 적용하였다:

시작:2％ 이동상 B

0 내지 3분3％ 이동상 B로 선형 증가

3 내지 3.5분20％ 이동상 B로 선형 증가

검출을 UV-검출기 (210 nm)로 수행하였다. 수행 시간은 7분이었으며, 추가로 3분 더 수행하였다. 판토텐산에 대한 보유 시간은 3.9분이었다. 상기 언급한 샘플에 대한 HPLC 크로마토그램은 도 4에 제시되어 있다.

4.7분의 보유 시간을 갖는 피크와 관련된 화합물의 확인

기술된 발효 조건하에, PA824는 통상적으로 판토테네이트 약 20 내지 30 g/L를 생산하였다. 상당량의 판토테네이트를 생산하는 것 이외에도, 이 시스템에서 대략 4.7분의 보유 시간으로 용출시켜 제2의 화합물을 발견하였다. 발효에서 형성된 제2의 주요 생성물은 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산(HMBPA) (본원에서 "β-알라닌 2-(R)-히드록시이소발레레이트," "β-알라닌 2-히드록시이소발레레이트" 및(또는) "β-알라닐-α-히드록시이소발레레이트"라고도 함)인 것으로 나타났다. 이는 역상 플래쉬 크로마토그래피 (이동상 10 mM KH₂PO₄, 아세토니트릴의 함량을 증가시킴 (1 내지 50％))에 의한 크로마토그래피 정제 이후 그의 질량 스펙트럼 (도 5; 상대적인 단일동위원소 질량 189),¹H- 및 13C-NMR (데이타는 나타내지 않음)에 의해 확인되었다.

화합물의 동일성을 확인하기 위해, 라세미 β-알라닌 2-히드록시이소발레레이트의 신중한 합성을 다음과 같이 수행하였다. β-알라닌 (2.73 g/30 mmol) 및 메톡시화나트륨 (메탄올 중 30％ 용액 5.67 g/31.5 mmol)을 메탄올 (40 mL) 중에 용해시켰다. 메틸 2-히드록시이소발레레이트 (2-히드록시-3-메틸부티르산 메틸 에스테르) (3.96 g/30 mmol)를 첨가하고, 18시간 동안 재환류하였다. 이어서, 메탄올을 회전증발기로 제거하고, tert-부탄올 (50 mL)로 대신하였다. tert-부톡시화칼륨 (50 mg)을 첨가하고, 26시간 동안 재환류하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔류물을 물 (50 mL)에 용해시키고, 강한 산성의 이온-교환 수지 (H+-형태의 Lewatite (등록상표) S 100 G1; 100 mL)를 통해 통과시켰다. 많은 물을 사용하여 이온 교환기를 세정하였다. 수성 용출물을 모으고, 물을 진공에서 제거하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카겔; 용출제로서 에틸 아세테이트 중 2％ 아세트산)로 처리하고, 생성물 분획을 증발시켜 고상 잔류물을 얻었다. 잔류물을 에틸 아세테이트/톨루엔 (각각 10 mL/20 mL)으로부터 재결정화하고, 분석학적으로순수한 HMBPA (β-알라닌 2-히드록시이소발레레이트)를 얻었으며, 이는 발효로부터 얻어진 생성물로서 질량 스펙트럼 및 동일한¹H-NMR 공명에서 190 (189 + H⁺)의 상대적인 단일동위원소 질량을 나타내었다.

HMBPA 생산을 초래하는 생합성 경로는 도 2에 기재되어 있다. [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)의 화학 구조는 도 3에 나타나 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, HMBPA는 PanC 효소에 의해 촉매되는, α-히드록시이소발레르산 (α-HIV)과 β-알라닌의 축합 생성물이다. α-HIV는 α-KIV의 환원반응에 의해 생성되는데, 이 반응은 리덕타제인 PanE (예, PanE1 및(또는) PanE2) 및(또는) IlvC에 의해 촉매된다.

화학적 구조, 및 HMBPA를 생산하는 생합성 경로를 기초로, 본 발명자들은 하기 모델을 조직하여 이미 알려진 판토테네이트 및 이소루이신-발린 (ilv) 경로 및 새로 특성화된 HMBPA 생합성 경로를 설명하였다. 하나 이상의 측면에서, 그러한 모델은 미생물에서 생합성 효소 PanB에 대한 기질인 α-KIV에 대하여 경쟁하는 적어도 2개의 경로, 즉 판토테네이트 생합성 경로 및 HMBPA 생합성 경로가 존재함을 나타낸다 (α-KIV에 대하여 경쟁하는 제3 및 제4 경로는 α-KIV로부터 발린 또는 루이신을 제조하는 경로이다. 예를 들어, 도 1 참조). 또한 판토테네이트 생합성 경로 및 HMBPA 생합성 경로는 적어도 효소 PanC에 대한 경쟁적 기질, 즉 α-HIV 및 판토에이트를 생산한다. 이 모델에 의해 PanB 활성 감소가 α-HIV 합성에 대한 α-KIV 이용가능성을 증가시키고 (결국 HMBPA를 합성) 미생물에 의해 합성된 판토에이트 및(또는) 판토테네이트의 양을 감소시킬 것으로 예상된다. 반대로, PanB 활성의 증가는 판토에이트/판토테네이트 합성에 대한 판토에이트 및 케토판토에이트의 이용가능성을 증가시킬 것이다. 하기 실시예는 상기 모델에 대한 실험적 지지를 제공하며, 이 모델에 기초하여 HMBPA의 생산을 증가시키는 방법을 추가로 예시한다.

실시예 II 내지 VI:

실시예 II 내지 VI의 경우, 판토테네이트 및(또는) HMBPA의 정량을 다음과 같이 수행하였다. 발효 배지 분획을 1:100으로 희석시키고, 시험관 배양물의 분획을 물 또는 5％ 아세토니트릴 중에서 1:10으로 희석시킨 다음, Phenomenex Aqua (등록상표) 5 μC18 HPLC 컬럼 (250 x 4.60 mm, 125A) 상에 주입하였다. 이동상으로는 A가 5％ 아세토니트릴, 50 mM 모노소듐 포스페이트 완충액으로, 인산을 사용하여 pH 2.5로 조정하였으며; B는 95％ 아세토니트릴, 5％ H₂0이었다.

선형 농도구배는 다음과 같았다.

추가의 파라메타 및 장치는 다음과 같았다: 유속 = 1.0 ml/min; 주입 부피= 20 ㎕; 검출기 = 휴렛 팩커드 (Hewlett Packard) 1090 시리즈 DAD UV 검출기-3014, 시그널 A = 197 nm, 레퍼런스 = 450 nm, 펌웨어 (Firmware) 개정 E; 컬럼 히터 = 오븐 온도 40 ℃; 하드웨어 = 휴렛 팩커드 케이아크 (Kayak)(등록상표) XA; 및 소프트웨어 = 휴렛 팩커드 켐스테이션 플러스 (Chemstation Plus)(등록상표) 패밀리 개정 A.06.03[509].

이러한 발효 조건하에, PA824는 통상적으로 판토테네이트 약 30 내지 40 g/L를 생산하였다. HMBPA는 이 시스템에서 약 13분에 용출하였다.

실시예 II: 케토판토에이트 리덕타제는 HMBPA의 생산에 기여하며, 바실러스에서 케토판토에이트 리덕타제 활성을 증가시키게 되면 HMBPA 생산이 증가한다

실시예 I에서 설명한 바와 같이, HMBPA에 상응하는 새로운 HPLC 피크는panE1을 과발현시키는 미생물에서 관찰되었으며, 이는 증가된 케토판토에이트 리덕타제가 (판토테네이트의 생산뿐 아니라) HMBPA의 생산에도 기여함을 암시한다. 앞서 언급한 바와 같이, 비. 서브틸리스 게놈에서 두 유전자는 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하는 이. 콜라이panE유전자에 상동성이며,panE1및panE2로 명명되었다. 바실러스에서,panE1유전자는 판토테네이트 생산에 관여하는 주요 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하지만,panE2는 판토테네이트 합성에 기여하지 않는다. 실제로,P ₂₆ 프로모터로부터의panE2의 과발현은 판토테네이트 역가의 감소를 초래한다 (예를 들어, 미국 특허출원 제09/400,494호 참조).

따라서, HMBPA의 제조에 필요한 상당한 비율의 α-HIV가panE1유전자 생성물에 의해 생산가능한지의 여부 이외에,panE2유전자 생성물에 의해 생산가능한지의 여부에 대하여도 시험하였다.panE2유전자 생성물은 α-KIV를 α-HIV로 환원시킬 수 있지만, 케토판토에이트를 판토에이트로 유의하게 환원시킬 수는 없는 효소라는 가설이 세워졌다.

이 가설을 시험하기 위해, 균주 PA248 (△panE2::cat)(서열 24로서 기재됨. 작제에 대하여는 미국 특허출원 제09/400,494호를 참조)의 염색체 DNA로부터의△panE2::cat카세트로 형질전환시키는 방법으로panE2를 판토테네이트 생산 균주인 PA824로부터 (실시예 I에 기재됨) 결실시켜 균주 PA919을 얻었다. PA919의 3가지 단리물을 PA824와, SVY + β-알라닌에서 배양한 시험관 배양물 중에서 판토테네이트 및 HMBPA 생산에 대하여 비교하였다.

표 1의 데이타에 나타낸 바와 같이, PA919의 3가지 단리물은 모두 PA824보다 약 4배 더 적은 HMBPA를 생산하였으며, 이는panE2유전자 생성물이 HMBPA 합성에대하여 강하게 기여함을 입증한다. 또한, 단순히panE2를 과발현시킴으로써 HMBPA 생산에 있어서 상당한 증가를 달성할 수 있다.panE2의 과발현을 위한 전형적인 플라스미드는 pAN238으로 명명되며, 서열 25 (도 10)에 기재되어 있다.

실시예 III. 미생물에서 PanB 활성의 감소에 의한 HMBPA 생산의 증가

P ₂₆ panBCD카세트에 대하여 결실되고,vpr유전자좌에서 증폭된P ₂₆ panC*D카세트 및bpr유전자좌에서 증폭된 야생형P ₂₆ panB카세트 (PA666) 또는P ₂₆ △panB카세트 (PA664)를 포함하는 PA365로부터 유도된 균주 (PA377의 RL-1 계통 등가물, 미국 특허출원 제09/667,569호에 기재)를 다음과 같이 형성시켰다. 공지 또는 추정의 PanB 단백질의 C-말단 아미노산의 정렬은 도 6에 나타나 있다. 보존 또는 반-보존된 아미노산 잔기를 갖는 것으로 확인된, 1, 2 및 3으로 불리는 3개의 영역들을 도면의 상단에 화살표로 표시하였다. 비. 서브틸리스 PanB 단백질 (RBS02239)에는 밑줄을 그었다. PanB 단백질들 중 2가지 (RCY14036 및 CAB56202.1)는 영역 3이 없지만, 후자 PanB 단백질은 또한 영역 2가 없으며 영역 1을 차지하는 비-보존적 아미노산 잔기를 갖는다.

영역 1, 2 및 3이 없는 비. 서브틸리스 PanB 변이체를 생성하였다. 비. 서브틸리스panB유전자를 증폭시키는 3' PCR 프라이머를 설계하여 영역 3, 영역 2 및 3, 또는 모든 영역들이 최종 생성물로부터 결실되도록 함으로써 목적하는 변이체를 생성시켰다. PCR 생성물을 생성시키고, 이. 콜라이 발현 벡터 pASK-1BA3에 클로닝하여 플라스미드 pAN446, pAN447 및 pAN448을 각각 생성시켰다. 이후,panB6돌연변이를 포함하는 이. 콜라이 균주 SJ2를 상기 플라스미드로 형질전환시켜 보완성에 대하여 시험하였다. 영역 3이 없는 pAN446만이 보완할 수 있었다. 이로부터, 영역 3은 비. 서브틸리스 PanB 활성에 대하여 필수적이 아니지만 영역 2는 활성 또는 안정성을 위해 필요함을 알 수 있다.

이 분석의 다음 단계에서panB유전자를 pAN446로부터 비. 서브틸리스 발현 벡터로 전달한 다음, 이를 코딩된 PanB 단백질의 활성을 비. 서브틸리스에서 시험하기에 적합한 균주로 도입하였다. 이를 위해,P ₂₆ panBCD오페론이 결실된 균주를 먼저 생성시켰다. 이 과정은 먼저cat유전자를panB RBS의 인접 상류에 위치한BseRI 부위와panD에 위치한Bg/II 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pAN624 (도 7)를 생성시키는 방식으로 수행하였다. pAN624의 서열은 서열 20에 기재되어 있다.panB및panC가 모두 제거된 생성된 결실-치환 돌연변이 (△panBCD::cat624)를 형질전환에 의해 PA354에 넣고, 1 mM 판토테네이트를 보충한 플레이트상에서 클로람페니콜에 대한 내성에 대하여 선별하였다. 형질전환체들 중 하나를 보존하여 PA644로 명명하였다. PA644로부터 단리된 염색체 DNA는 PCR에 의해 분석하였으며, 결실-치환 돌연변이를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 예상된 바와 같이, PA644는 성장을 위해 판토테네이트를 필요로 하지만, PA354에 원래 존재하는P ₂₆ panE1유전자뿐만 아니라 조작된ilv유전자 (P₂₆ ilvBNCP₂₆ ilvD)도 보유한다. 따라서, 이 균주는 PanB를 제외하고 판토에이트 합성에 관여하는 과생산되는 모든 효소를 갖는다. 가장 짧은panB결실을 포함하는 유전자를 비. 서브틸리스 발현 벡터 pOTP61 (미국특허출원 제09/667,569호에 기재됨)에 삽입하여 플라스미드 pAN627을 생성시켰다. 동시에, 야생형panB조절 유전자를 pOTP61에 삽입하여 플라스미드 pAN630을 생성시켰다. 이. 콜라이 벡터 서열이 결여된, 각 플라스미드의NotI 단편들을 라이게이션하고 PA644를 형질전환시켰으며, 테트라사이클린 내성에 대하여 선별하였다.

각 형질전환으로부터의 하나의 형질전환체를 보존하고, PA628으로부터의 염색체 DNA로 추가로 형질전환시키고, Pan⁺에 대하여 선별하였다. PA628은vpr유전자좌에서 통합된 여러 카피수의 P₂₆ panC*D발현 플라스미드 (pAN620)를 포함한다.panB유전자 돌연변이의 판토테네이트 생산에 대한 직접적인 효과를 결정하기 위해, 서열 21에 기재되어 있고 도 8에 개요도가 나타나 있는 플라스미드 pAN620이 판토테네이트 합성에 필요한 나머지 2가지 효소 (PanC 및 PanD)를 제공한다. 각 형질전환으로부터의 4가지 형질전환체를 단리하고, 10 g/L의 아스파르테이트를 포함하는 SVY 배지에서 48시간 동안 배양시킨 다음, 판토테네이트 생산에 대하여 분석하였다. 3' 결실된panB유전자를 갖는 형질전환체는 PA664로 명명되었으며, 야생형 유전자를 포함하는 것은 PA666로 명명하였다. 데이타는 PA664에서 3' 결실된panB유전자가 크게 감소된 활성을 갖는 PanB 단백질을 코딩한다는 것을 보여주었다. HMBPA 생산에 대하여 시험하기 위해, PA365, PA666 및 PA664의 시험관 배양물을, 첨가된 α-KIV 또는 판토에이트가 있거나 없는 SVY + 아스파르테이트 배지에서 48시간 동안 배양한 다음, 앞서 설명한 바와 같이 HMBPA 및 판토테네이트에 대하여 분석하였다.

표 2에 제시된 데이타는 보충물의 부재하에 PA664가 대부분의 HMBPA를 생산하였지만 PA666은 이를 최소로 생산하였음을 입증하며, 이로서 PanB 활성과 HMBPA 생산이 서로 역관계에 있음을 알 수 있다. 이는 상기 두 경로가 PanB에 대한 기질인 α-KIV와 경쟁하며 PanC에 대한 경쟁적 기질을 생산한다는 것을 예상하는 모델과 일치하며, 저하된 PanB 활성은 α-HIV 합성에 대한 α-KIV 이용가능성을 증가시키고 HMBPA 생산을 증가시키며, 따라서 합성된 판토에이트의 양을 감소시키는 것으로 예상된다. α-KIV를 배지에 첨가했을 때, 3가지 균주들은 모두 상당히 더 많은 HMBPA를 생산하였다. 이러한 결과는 α-KIV가 도 2에 기재된 바와 같이 HMBPA에 대한 전구체이며, 과량의 α-KIV가 HMBPA 생산을 촉진시킴을 입증한다. 또한 이러한 결과는 HMBPA의 합성이 적어도 부분적으로는 과량의 α-KIV 생산의 과다한 효과로 인한 것임을 시사한다. 판토에이트를 배지에 첨가했을 때, HMBPA는 3가지 균주들 모두에서 대략 50 퍼센트까지 감소되었다. 반대로, 각각의 균주들은 판토테네이트를 상당히 더 많이 생산하였다. 이러한 결과는 또한 상기 2가지 경로가 PanC에 대한 경쟁적 기질 (α-HIV 및 판토에이트)을 생산하는 모델과 일치한다. 종합하면, 상기 결과는 판토에이트 합성을 감소시키는 것이 HMBPA 생산을 촉진시키는 것뿐 아니라, 판토테네이트 수준을 감소시키는데 있어서도 유리하다는 것을 추가로 암시한다.

실시예 IV. HMBPA:판토테네이트 수준을 조절하는 방법

실시예 I 및 II에서 입증된 바와 같이, PanE1 및(또는) PanE2는 감소된 PanB 활성과 마찬가지로 HMBPA 생산 증가에 기여한다. 이 실시예는 PanE1의 과발현이 HMBPA 생산을 판토테네이트 생산에 비해 증가시키지만 PanB의 과발현은 HMBPA 생산을 판토테네이트 생산에 비해 감소시킨다는 것을 입증한다. 또한, HMBPA 생산은 IlvC를 과발현시키는 균주에서 증가한다.

PA668은vpr또는panB유전자좌에서 증폭된 여러 카피수의 P₂₆ panB를 포함하는 PA824의 유도체이다. 클로람페니콜을 사용하여 여러 카피수를 선택할 수 있는panB발현 벡터 (pAN636)를 사용하여 PA668을 형성시켰다. pAN636의 서열은 서열 22에 기재되어 있으며, 벡터의 개요도는 도 9에 나타나 있다. 이. 콜라이 벡터 서열이 없는 pAN636NotI제한 단편을 라이게이션한 다음, 이를 사용하여 PA824를 형질전환시키고, 클로람페니콜 5 ㎍/ml을 포함하는 플레이트상에서 선별하였다. 클로람페니콜 30 ㎍/ml에 대해 내성이 있는 형질전환체를 단리하고, 48시간 시험관 배양물에서 판토테네이트 생산에 대하여 스크리닝하였다. 나타낸 단리물은 PA824보다 더 적은 HMBPA를 생산하였다 (반대로 PA824보다 약 10 퍼센트 더 많은 판토테네이트를 생산함).vpr또는panE1유전자좌에서 증폭된 여러 카피수의P ₂₆ panE1을 갖는 PA824로서, PA669로 불리는 제2의 균주를 형성시켰다. PA824를 플라스미드 pAN637의 셀프-라이게이션된NotI단편으로 형질전환시켜 균주 PA669를 형성시키고, 클로람페니콜에 대한 내성에 대하여 선별하였다. pAN637의 서열은 서열 23에 기재되어 있으며, 벡터의 개요도는 도 10에 나타나 있다. PA669의 2가지 단리물을 추가의 연구를 위해 선택하였고, PA669-5는 상기 두 균주들로부터 얻은 전체 세포 추출물을 SDS-PAGE 분석에 의해 판단한 바로는 PA669-7보다 더 적은 PanE1을 생산한다.

균주 PA824, PA668-2, PA668-24의 시험관 배양물 및 PA669의 2가지 단리물 (PA669-5 및 PA669-7)을 3가지 다른 배지 (SVY, SVY + 아스파르테이트, 및 SVY + 아스파르테이트 + 판토에이트)에서 48시간 동안 배양한 다음, 판토테네이트, HMBPA, 및 β-알라닌에 대하여 분석하였다 (표 3).

상기 어떤 균주도 SVY 배지에서 검출가능한 양의 HMBPA를 생산하지 않았다. 모든 균주는 대략 동등한 양의 판토테네이트 및 적은 양의 β-알라닌을 생산하였으며, 이는 β-알라닌이 이들 배양물에서 판토테네이트 및 HMBPA 합성 둘 다에 대해 제한적이며 β-알라닌이 이들 두 화합물에 대한 전구체라는 것을 암시한다. SVY + 아스파르테이트 배지에서 배양했을 때, 2가지 PA669 단리물은 PA824보다 더 많은 HMBPA를 생산하였지만 PA668 단리물은 PA824보다 더 적은 HMBPA를 생산하였다. 대부분의 PanE1을 생산하는 균주 (PA669-7)가 대부분의 HMBPA (및 최소한의 판토테네이트)를 생산하였다는 것은 주목할만하다. 이는 높은 수준의 PanE1이 더 적은 판토테네이트 합성을 희생하여 HMBPA 생산을 촉진시킨다는 것을 시사한다. 또한, PA668-24 및 PA668-2 균주들로부터의 추출물에 대한 SDS-PAGE 분석 결과 이들이 대략 동등한 수준의 PanB를 생산하는 것으로 밝혀졌음에도 불구하고, PA668-24가PA668-2보다 더 많은 HMBPA를 생산하였다는 것은 흥미로운 일이다. SDS-PAGE 분석은 또한 PA668-24가 PA668-2보다 훨씬 더 많은 IlvC를 생산한다는 것을 보여주었다. 이러한 데이타를 기초로, IlvC는 정상 상태의 α-KIV 수준을 증가시키고(시키거나) α-KIV로부터 α-HIV의 형성을 촉매함으로써 HMBPA 합성에 영향을 준다는 것이 제안됨에 따라, HMBPA의 생산하는 쪽으로 진행하는 것에 대한 관찰 결과가 설명되기에 이르렀다.

표 3 데이타의 마지막 세트는 판토에이트를 배양 배지에 첨가하자, 예를 들어 합성을 판토테네이트 방향으로 진행시킴으로써 앞서 검출가능한 수준을 생산했던 모든 균주에 의한 HMBPA 생산이 감소되었음을 보여준다. 이러한 내용은 α-HIV 및 판토에이트가 PacC에 대한 경쟁적 기질인 모델을 추가로 지지한다.

실시예 V: 세린 이용가능성의 제한에 의한 HMBPA 생산 증가

HMBPA 생산에 대한 판토테네이트의 비율은 또한 미생물 배양물에서 세린 또는 메틸렌 테트라히드로폴레이트의 이용가능성을 조절함으로써 제어될 수 있다는 가설을 세웠다. 특히, 세린의 이용가능성을 감소시키면 HMBPA 생산을 판토테네이트 생산에 비해 증가시킬 수 있지만 세린의 이용가능성을 증가시키면 HMBPA 생산은 판토테네이트 생산에 비해 감소하게 될 것이라고 제안되었다. 이러한 방법은 PanB 기질인 메틸렌테트라히드로폴레이트가 세린으로부터 유도된다는 이해에 기초한다. 따라서, 세린 수준을 조절하여 PanB 기질 수준을 효과적으로 조절하게 된다. 이러한 가설을 시험하기 위해, PA824를 SVY 글루코스 및 5 g/L β-알라닌 ±5 g/L 세린의 시험관 배양물에서 43 ℃에서 48시간 동안 배양하였다.

표 4에서 입증된 바와 같이, 세린의 첨가는 생산 수준을 감소시키지만, 반대로 판토테네이트 생산은 증가시킨다. HMBPA 생산 수준을 조절하기 위해 메틸렌 테트라히드로폴레이트 수준을 감소시키는 한가지 이상의 방법은 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 (glyA유전자 생성물)의 활성을 감소시킴으로써 적절하게 조작된 미생물에서 메틸렌 테트라히드로폴레이트 생합성을 감소시키는 방법이다. HMBPA 생산을 조절하기 위해 세린 수준을 감소시키는 한가지 이상의 방법은 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제 (serA유전자 생성물)의 활성을 감소시키는 것이다.

실시예 VI: 재조합 미생물에 대한 배양 조건의 변경에 의한 HMBPA 생산 증가

하나 이상의 발효 (발효 P162)에서, HMBPA 생산 수준은 35 g/L에 도달하였다. 요컨대, 균주 PA824의 발효는 실시예 I에 기재된 바와 같이 수행하되, 아래와같이 제조된 PFM-155 배지를 사용하였다.

그러나, 발효 동안 공정 조절의 상실로 인해, 용존 산소는 16시간 내지 17시간 사이에서 제한적으로 되어, 글루코스는 16시간 후부터 축적되기 시작하였다.

발효 조건에서의 이러한 변화는 16시간의 시점에서 또는 그 이후에 다음과 같은 유의한 결과를 나타냈다. 즉, HMBPA의 합성이 증가하기 시작하면서 판토테네이트 합성은 상응하게 감소하기 시작하였다. 4시간 간격으로 16시간 후 배양물은 7 g/l HMBPA를 생산하였으며, 그로부터 4시간 후 9.0 g/l를 생산하였다. 반대로, 판토테네이트는 12시간 내지 16시간 사이에는 10 g/l가, 16시간 내지 20시간 사이에는 6.0 g/l가 각각 생산되었다. 20시간 내지 36시간 사이에 HMBPA의 평균 합성 속도는 1.0 g/l hr 이었다. 전체적으로, 발효 P162는 36시간 후 HMBPA 35 g/l를 생산하였다.

따라서, 글루코스의 과잉공급 및(또는) 용존 산소의 제한 (예를 들어, 약 16시간 후 시작됨)은 HMBPA의 생산 증가를 초래하는 것으로 보인다. 따라서, HMBPA 생산을 (판토테네이트 생산에 비해) 증가시키는 2가지 방법은 정상 상태의 글루코스 수준을 증가시키고(시키거나) 정상 상태의 용존 산소 수준을 감소시키는 것이다.

등가물: 당업자라면 단지 통상의 실험을 이용하는 것만으로도 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 청구의 범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

미생물을 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 단계 및 상기 미생물에 의해 생산된 HMBPA를 검출하는 단계를 포함하는, HMBPA의 제조 방법.
미생물을 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 단계 및 상기 미생물에 의해 생산된 HMBPA를 단리하는 단계를 포함하는, HMBPA의 제조 방법.
증가된 케토 리덕타제 활성 또는 증가된 판토테네이트 신테타제 활성을 갖는 미생물을 과량의 α-케토이소발레레이트 및 과량의 β-알라닌의 존재하에 배양하여 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법.
증가된 케토 리덕타제 활성 및 증가된 판토테네이트 신테타제 활성을 갖는 미생물을 과량의 α-케토이소발레레이트 및 과량의 β-알라닌의 존재하에 배양하여 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 미생물이 변형된panE유전자를 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서,panE유전자가 과발현되거나, 탈조절되거나 (deregulated), 또는 여러 카피수로 존재하는 것인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 미생물이 변형된panE1유전자를 포함하는 것인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 미생물이 변형된panE2유전자를 포함하는 것인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 미생물이 변형된panE1유전자 및 변형된panE2유전자를 포함하는 것인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 미생물이 변형된panC유전자를 포함하는 것인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서,panC유전자가 과발현되거나, 탈조절되거나, 또는 여러 카피수로 존재하는 것인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 미생물이 증가된 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 활성을 추가로 갖는 것인 방법.
증가된 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 활성을 갖는 미생물을 과량의 α-케토이소발레레이트 및 과량의 β-알라닌의 존재하에 배양하여 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 단계를 포함하는, HMBPA의 제조 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 미생물이 변형된ilvC유전자를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기ilvC유전자가 과발현되거나, 탈조절되거나, 또는 여러 카피수로 존재하는 것인 방법.
제3항, 제4항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 감소된 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성을 추가로 갖는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 미생물이 변형된panB유전자를 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 미생물이panB유전자에 대해 결실된 것인 방법.
감소된 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 미생물을 과량의 α-케토이소발레레이트 및 과량의 β-알라닌의 존재하에 배양하여 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법.
재조합 미생물을 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA) 생산이 판토테네이트 생산에 비해 증가되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, HMBPA 생산을 판토테네이트 생산에 비해 증가시키는 방법.
PanE1 또는 PanE2를 과발현시키고 감소된 PanC 또는 PanD 활성을 추가로 갖는 미생물을 2-히드록시이소발레르산 (α-HIV)이 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, α-HIV의 제조 방법.
serA또는glyA의 발현 또는 활성이 감소된 재조합 미생물을 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법.
serA및glyA의 발현 또는 활성이 감소된 재조합 미생물을 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)이 생산되도록 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, HMBPA의 제조 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물을 정상 상태 (steady state)의 글루코스가 증가된 조건하에 배양하는 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물을 정상 상태의 용존 산소가 감소된 조건하에 배양하는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물을 세린이 감소된 조건하에 배양하는 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 생성물.
증가된 리덕타제 활성을 나타내는 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자에서의 변형 및 감소된 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는panB유전자에서의 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)의 제조를 위한 재조합 미생물.
제28항에 있어서, 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하는 유전자가panE유전자인 재조합 미생물.
제29항에 있어서, 상기panE유전자가panE1인 재조합 미생물.
제29항에 있어서, 상기panE유전자가panE2인 재조합 미생물.
제28항에 있어서,panE1및panE2에서의 변형을 포함하는 재조합 미생물.
제28항에 있어서, 증가된 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 활성을 나타내는ilvC에서의 변형을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
증가된 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 활성을 나타내는ilvC에서의 변형 및 감소된 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는panB유전자에서의 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA)의 제조를 위한 재조합 미생물.
제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스 (Bacillus) 속 (genus)에 속하는 재조합 미생물.
제35항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)인 재조합 미생물.