ES2491093T3 - Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos - Google Patents

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ES2491093T3 ES08769487.3T ES08769487T ES2491093T3 ES 2491093 T3 ES2491093 T3 ES 2491093T3 ES 08769487 T ES08769487 T ES 08769487T ES 2491093 T3 ES2491093 T3 ES 2491093T3
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Andrew C. Eliot
Lori Ann Maggio-Hall
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Abstract

Una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3-butanodiol en 2-butanona en la célula huésped en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona o 2-butanol, y adicionalmente en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO>=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO>=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.

Description

Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y la producción de alcoholes. Más específicamente, el 2-butanol se produce mediante fermentación industrial de un microorganismo recombinante. Los microorganismos recombinantes y procedimientos de la invención también pueden adaptarse para producir 2-butanona, un producto intermedio en las rutas biosintéticas de 2-butanol desveladas en el presente documento.
Antecedentes de la invención
El butanol es un producto químico industrial importante útil como aditivo para combustible, como materia prima química en la industria de los plásticos y como un extrayente de calidad alimentaria en la industria alimentaria y de los aromas. Cada año se producen 10 a 12 billones de libras de butanol por medios petroquímicos y la necesidad de este producto químico probablemente aumentará. La 2-butanona, también denominada metiletilcetona (MEK), es un disolvente ampliamente usado y es la cetona comercialmente producida más importante, después de la acetona. Se usa como disolvente para pinturas, resinas y adhesivos, además de un extrayente selectivo y activador de reacciones oxidativas.
Se conocen procedimientos para la síntesis química de la 2-butanona, tales como por deshidrogenación de 2butanol, o en un procedimiento en el que el butano líquido se oxida catalíticamente dando 2-butanona y ácido acético (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6ª edición, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, pág. 727-732). La 2-butanona también puede convertirse químicamente en 2-butanol mediante hidrogenación (Breen y col., J. of Catalysis 236: 270-281 (2005)). Los procedimientos para la síntesis química de 2-butanol son conocidos, tales como hidratación de n-buteno (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6ª edición, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, pág. 716-719). Estos procedimientos usan materiales de partida derivados de productos petroquímicos y generalmente son caros, y no son respetuosos con el medioambiente. La producción de 2-butanona y 2-butanol a partir de materiales de partida derivados de plantas minimizaría las emisiones de gases de efecto invernadero y representaría un avance en la materia.
También se conocen procedimientos para producir 2-butanol por biotransformación de otros productos químicos orgánicos. Por ejemplo, Stampfer y col. (documento WO 03/078615) describen la producción de alcoholes secundarios, tales como 2-butanol, por la reducción de cetonas que se catalizan por una enzima alcohol deshidrogenasa obtenida de Rhodococcus ruber. Similarmente, Kojima y col. (documento EP 0645453) describen un procedimiento de preparación de alcoholes secundarios, tales como 2-butanol, mediante reducción de cetonas que se cataliza por una enzima alcohol deshidrogenasa secundaria obtenida de Candida parapsilosis. Adicionalmente, Kuehnle y col. (documento EP 1149918) describen un procedimiento que produce tanto 1-butanol como 2-butanol por la oxidación de hidrocarburos por diversas cepas de Rhodococcus ruber. El procedimiento favoreció la producción de 1-butanol con una selectividad del 93,8 %.
También se conoce la producción de 2-butanol por ciertas cepas de Lactobacilli (Speranza y col., J. Agric. Food Chem. (1997) 45:3476-3480). El 2-butanol se produce por la transformación de meso-2,3-butanodiol. También se demostró la producción de 2-butanol a partir de acetolactato y acetoína por estas cepas de Lactobacilli. Sin embargo, no hay informes de un microorganismo recombinante diseñado para producir 2-butanol.
Existe la necesidad, por tanto, de procedimientos rentables medioambientalmente responsables para la producción de 2-butanol y 2-butanona. La presente invención trata esta necesidad mediante el descubrimiento de huéspedes de producción microbiana recombinantes que expresan rutas biosintéticas de 2-butanol y 2-butanona.
Resumen de la invención
La invención proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética del 2-butanol manipulada. También se proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética de la 2-butanona manipulada, que es la misma que la ruta biosintética del 2-butanol con omisión de la última etapa. Los microorganismos manipulados pueden usarse para la producción comercial de 2-butanol o 2-butanona. Por consiguiente, la invención proporciona una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en:
i) piruvato en alfa-acetolactato;
ii) alfa-acetolactato en acetoína;
iii) acetoína en 2,3-butanodiol;
iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y
v) 2-butanona en 2-butanol;
en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanol. En otra realización la invención proporciona una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos
una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; y
iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona.
En otra realización la invención proporciona un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende: 1) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que
codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato en acetoína, iii) acetoína en 2,3-butanodiol; iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;
en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y
2) poner en contacto la célula huésped de (1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones por las cuales se produce 2-butanol. Similarmente, la invención proporciona un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende: 1) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que
codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; y iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona;
en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y
2) poner en contacto la célula huésped de (1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones por las cuales se produce 2-butanona. En otra realización la invención proporciona una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos
una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3-butanodiol en 2-butanona en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona o 2butanol.
Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende: a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3butanodiol en 2-butanona y una fuente de 2,3-butanodiol; en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y
b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada se expresa y el 2,3-butanodiol se convierte en 2-butanona; y
c) opcionalmente recuperar la 2-butanona.
Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende:
a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3butanodiol en 2-butanona, actividad de butanol deshidrogenasa y una fuente de 2,3-butanodiol;
en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y
b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada se expresa y el 2,3-butanodiol se convierte en 2-butanona, y la 2-butanona se convierte en 2-butanol; y
c) opcionalmente recuperar el 2-butanol.
Además, se desvelan los siguiente puntos.
1.
Una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3butanodiol en 2-butanona en la célula huésped en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona o 2-butanol, y adicionalmente en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10,PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
2.
La célula huésped microbiana recombinante según el punto 1, en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276.
3.
La célula huésped microbiana recombinante según el punto 1 o la reivindicación 2 que comprende además una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa reactivasa independiente de B12.
4.
La célula huésped microbiana recombinante según el punto 3, en la que la reactivasa tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 278 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
5.
La célula huésped microbiana recombinante según el punto 3 o la reivindicación 4, en la que la reactivasa tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 278.
6.
Un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende:
a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3butanodiol en 2-butanona en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, y una fuente de 2,3-butanodiol;
en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y
b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada se expresa y el 2,3-butanodiol se convierte en 2-butanona; y
c) opcionalmente recuperar la 2-butanona.
7. Un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende:
a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3butanodiol en 2-butanona en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos
de proteínas, actividad de butanol deshidrogenasa y una fuente de 2,3-butanodiol; en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada
se expresa y el 2,3-butanodiol se convierte en 2-butanona, y la 2-butanona se convierte en 2-butanol; y c) opcionalmente recuperar el 2-butanol.
8.
La célula huésped microbiana recombinante de uno cualquiera de los puntos 1 a 5 que comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan la conversión de sustrato en productos: i) piruvato en alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol;
iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol.
9.
La célula huésped microbiana recombinante de uno cualquiera de los puntos 1 a 5 que comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan la conversión de sustrato en productos: i) piruvato en alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato en acetoína;
iii) acetoína en 2,3-butanodiol; y iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona.
10.
Uso de una célula huésped microbiana recombinante de uno cualquiera de los puntos 1 a 5, 8 ó 9 para la producción de 2-butanona o 2-butanol.
Breve descripción de las figuras, tablas y descripciones de secuencias
La invención puede entenderse más completamente a partir de la siguiente descripción detallada, figuras y las descripciones de secuencia adjuntas, que forman una parte de la presente solicitud.
La Figura 1 muestra cuatro rutas diferentes para la biosíntesis de la 2-butanona y 2-butanol.
La Figura 2 muestra un árbol filogenético de subunidades grandes de longitud completa de diol/glicerol deshidratasas con >95 % de secuencias idénticas eliminadas (excepto que se retengan todas las secuencias de función experimentalmente verificada) y una clave que enumera la identidad de cada secuencia en el árbol. Las secuencias con función experimentalmente determinada como diol o glicerol deshidratasas están resaltadas en gris oscuro o claro, respectivamente.
La Figura 3 muestra un árbol filogenético de subunidades medianas de longitud completa de diol/glicerol deshidratasas con >95 % de secuencias idénticas eliminadas y una clave que enumera la identidad de cada secuencia en el árbol. Las secuencias con función experimentalmente determinada como diol o glicerol deshidratasas están resaltadas en gris oscuro o claro, respectivamente.
La Figura 4 muestra un árbol filogenético de subunidades pequeñas de longitud completa de diol/glicerol deshidratasas con >95 % de secuencias idénticas eliminadas y una clave que enumera la identidad de cada secuencia en el árbol. Las secuencias con función experimentalmente determinada como diol o glicerol deshidratasas están resaltadas en gris oscuro o claro, respectivamente.
La Tabla 12 es una tabla de la subunidad grande alfa del perfil HMM para la enzima diol / glicerol deshidratasa. La Tabla 12 se entrega electrónicamente con la presente.
La Tabla 13 es una tabla de la subunidad mediana alfa del perfil HMM para la enzima diol / glicerol deshidratasa. La Tabla 13 se entrega electrónicamente con la presente.
La Tabla 14 es una tabla de la subunidad pequeña alfa del perfil HMM para la enzima diol / glicerol deshidratasa. La Tabla 14 se entrega electrónicamente con la presente.
Las siguientes secuencias se ajustan al artículo 37 del C.F.R. nº 1.821-1.825 (“Requisitos para Solicitudes de Patente que Contienen Descripciones de Secuencias de Nucleótidos y/o Secuencias de Aminoácidos – Reglas de
las Secuencias”) y están de acuerdo con norma ST. 25 (1998) de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (WIPO) y los requisitos de listados de secuencias de la OEP y PCT (Reglas 5.2 y 49.5(a-bis) y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones Administrativas). Los símbolos y formato usado para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos se ajustan a las reglas expuestas en el artículo 37 del C.F.R. nº 1.822.
Tabla 1
Resumen de números de SEC ID de ácidos nucleicos y proteínas
Descripción
SEC ID Ácido nucleico SEC ID Proteína
budA, acetolactato descarboxilasa de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955
1 2
alsD, acetolactato descarboxilasa de Bacillus subtilis
80 81
budA, acetolactato descarboxilasa de Klebsiella terrigena
82 83
budB, acetolactato sintasa de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955
3 4
alsS, acetolactato sintasa de Bacillus subtilis
76 77
budB, acetolactato sintasa de Klebsiella terrigena
78 79
budC, butanodiol deshidrogenasa de Klebsiella pneumoniae IAM1063
5 6
butanodiol deshidrogenasa de Bacillus cereus
84 85
butanodiol deshidrogenasa de Bacillus cereus
86 87
butB, butanodiol deshidrogenasa de Lactococcus lactis
88 89
pddA, subunidad alfa de butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca ATCC 8724
7 8
pddB, subunidad beta de butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca ATCC 8724
9 10
pddC, subunidad gamma de butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca ATCC 8724
11 12
pduC, subunidad grande de diol deshidratasa dependiente de B12 de Salmonella typhimurium
92 93
pduD, subunidad mediana de diol deshidratasa dependiente de B12 de Salmonella typhimurium
94 95
pduE, subunidad pequeña de diol deshidratasa dependiente de B12 de Salmonella typhimurium
96 97
pduC, subunidad grande de diol deshidratasa dependiente de B12 de Lactobacillus collinoides
98 99
pduD, subunidad mediana de diol deshidratasa dependiente de B12 de Lactobacillus collinoides
100 101
pduE, subunidad pequeña de diol deshidratasa dependiente de B12 de Lactobacillus collinoides
102 103
pddC, subunidad alfa de diol deshidratasa dependiente de adenosilcobalamina de Klebsiella pneumoniae
104 105
pddD, subunidad beta de diol deshidratasa dependiente de adenosilcobalamina de Klebsiella pneumoniae
106 107
pddD, subunidad gamma de diol deshidratasa dependiente de adenosilcobalamina de Klebsiella pneumoniae
108 109
ddrA, subunidad grande de factor de reactivación de diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca
110 111
ddrB, subunidad pequeña de factor de reactivación de diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca
112 113
pduG, subunidad grande de factor de reactivación de diol deshidratasa de Salmonella typhimurium
114 115
Resumen de números de SEC ID de ácidos nucleicos y proteínas
Descripción
SEC ID Ácido nucleico SEC ID Proteína
pduH, subunidad pequeña de factor de reactivación de diol deshidratasa de Salmonella typhimurium
116 117
pduG, subunidad grande de factor de reactivación de diol deshidratasa de Lactobacillus collinoides
118 119
pduH, subunidad pequeña de factor de reactivación de diol deshidratasa de Lactobacillus collinoides
120 121
sadH, butanol deshidrogenasa de Rhodococcus ruber 219
13 14
adhA, butanol deshidrogenasa de Pyrococcus furiosus
90 91
chnA, ciclohexanol deshidrogenasa de Acinetobacter sp.
71 72
yqhD, butanol deshidrogenasa de Escherichia coli
74 75
amina:piruvato transaminasa de Vibrio fluvialis (una acetoína aminasa)
144 codón opt. 122
amino alcohol cinasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
123 124
amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
125 126
budC, acetoína reductasa (butanodiol deshidrogenasa) de Klebsiella terrigena (ahora Raoultella terrigena)
133 134
subunidad alfa de glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae
145 146
subunidad beta de glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae
147 148
subunidad gamma de glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae
149 150
subunidad grande de glicerol deshidratasa reactivase de Klebsiella pneumoniae
151 152
subunidad pequeña de glicerol deshidratasa reactivase de Klebsiella pneumoniae
153 154
rdhtA butanodiol deshidratasa independiente de B-12 de Roseburia inulinivorans
277 276
rdhtB butanodiol deshidratasa reactivasa independiente de B-12 de Roseburia inulinivorans
279 278
glicerol deshidratasa independiente de B-12 de Clostridium butyricum
281 280
butanodiol deshidratasa reactivasa independiente de B-12 de Clostridium butyricum
283 282
sadB butanol deshidrogenasa de Achromobacter xylosoxidans
290 289
SEC ID Nº: 15 - 65 son las secuencias de nucleótidos de cebadores de PCR, clonación, cribado y secuenciación de oligonucleótidos usados en los ejemplos. SEC ID Nº: 66 es la secuencia de nucleótidos de la región delecionada del gen yqhD en la cepa MG1655 de E. coli ΔyqhCD, descrita en el Ejemplo 11. 5 SEC ID Nº: 67 es la secuencia de nucleótidos de una variante del promotor de glucosa isomerasa 1.6Gl. SEC ID Nº: 68 es la secuencia de nucleótidos del promotor 1.5Gl. SEC ID Nº: 69 es la secuencia de nucleótidos del operón de diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca. SEC ID Nº: 70 es la secuencia de nucleótidos del operón del factor de reactivación de diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca.
10 SEC ID Nº: 73 es la secuencia de nucleótidos de pDCQ2, que se describe en el Ejemplo 9. SEC ID Nº: 127 - 132 son las secuencias de nucleótidos de cebadores de PCR y de clonación de oligonucleótidos adicionales usados en los ejemplos. SEC ID Nº: 155 es una región codificante de codones optimizados para la amino alcohol cinasa de Erwinia
carotovora subsp. atroseptica. SEC ID Nº: 156 es una región codificante de codones optimizados para la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica. SEC ID Nº: 157-163 son las secuencias de nucleótidos de cebadores de PCR y de clonación de oligonucleótidos adicionales usados en los ejemplos. SEC ID Nº: 275 es la secuencia de nucleótidos de un operón de Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Tabla 2.
Subunidades grandes, medianas y pequeñas de glicerol y diol deshidratasa adicionales
aDescripción
bsubunidad SEC ID Proteínas
Subunidades correspondientes del mismo organismoc
Subunidad alfa de glicerol deshidratasa de Clostridium pasteurianum
G 135
Subunidad beta de glicerol deshidratasa de Clostridium pasteurianum
M 136
Subunidad gamma de glicerol deshidratasa de Clostridium pasteurianum
P 137
Subunidad alfa de glicerol deshidratasa de Escherichia blattae
G 138
Subunidad beta de glicerol deshidratasa de Escherichia blattae
M 139
Subunidad gamma de glicerol deshidratasa de Escherichia blattae
P 140
Subunidad alfa de glicerol deshidratasa de Citrobacter freundii
G 141
Subunidad beta de glicerol deshidratasa de Citrobacter freundii
M 142
Subunidad gamma de glicerol deshidratasa de Citrobacter freundii
P 143
Subunidad alfa de diol deshidratasa de Lactobacillus brevis
G 164
Subunidad beta de diol deshidratasa de Lactobacillus brevis
M 165
Subunidad gamma de diol deshidratasa de Lactobacillus brevis
S 166
Subunidad alfa de diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67
G 167
Subunidad beta de diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67
M 168
Subunidad gamma de diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67
P 169
Subunidad grande de propanodiol deshidratasa de Escherichia coli E24377A
G 170
Subunidad mediana de diol/glicerol deshidratasa de Escherichia coli E24377A
M 171
Subunidad pequeña de propanodiol deshidratasa de Escherichia coli E24377A
P 172
Subunidad grande de diol deshidratasa de Shigella sonnei Ss046
G 173
Subunidad mediana de diol deshidratasa de Shigella sonnei Ss046
M 174
Subunidad pequeña de diol deshidratasa de Shigella sonnei Ss046
P 175
Subunidad grande de propanodiol deshidratasa de Yersinia bercovieri ATCC 43970
G 176
proteína hipotética YberA_01000484 de Yersinia bercovieri ATCC 43970
M 177
Subunidad pequeña de propanodiol deshidratasa de Yersinia bercovieri ATCC 43970
P 178
Subunidad grande de propanodiol deshidratasa de Yersinia mollaretii ATCC 43969
G 179
proteína hipotética YmolA_01001292 de Yersinia mollaretii ATCC 43969
M 180
Subunidad pequeña de propanodiol deshidratasa de Yersinia mollaretii ATCC 43969
P 181
Subunidades grandes, medianas y pequeñas de glicerol y diol deshidratasa adicionales
aDescripción
bsubunidad SEC ID Proteínas
Subunidad grande de diol deshidratasa de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081
G 182
Subunidad mediana de diol deshidratasa de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081
M 183
Subunidad pequeña de diol deshidratasa de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081
P 184
Subunidad grande de propanodiol deshidratasa de Yersinia intermedia ATCC 29909
G 185
Subunidad mediana de diol/glicerol deshidratasa de Yersinia intermedia ATCC 29909
M 186
Subunidad pequeña de Propanodiol deshidratasa de Yersinia intermedia ATCC 29909
P 187
Subunidad grande de glicerol deshidratasa de Listeria welshimeri serovar 6b str. SLCC5334
G 188
Subunidad mediana de deshidratasa de utilización de propanodiol de Listeria welshimeri serovar 6b str. SLCC5334
M 189
Subunidad pequeña de deshidratasa de utilización de propanodiol de Listeria welshimeri serovar 6b str. SLCC5334
P 190
proteína hipotética lin1117 de Listeria innocua Clip11262
G 191
proteína hipotética lin1118 de Listeria innocua Clip11262
M 192
proteína hipotética lin1119 de Listeria innocua Clips 1262
P 193
proteína hipotética Imo1153 de Listeria monocytogenes EGD-e
G 194
proteína hipotética Imo1154 de Listeria monocytogenes EGD-e
M 195
proteína hipotética Imo1155 de Listeria monocytogenes EGD-e
P 196
Subunidad grande de glicerol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18
G 197
Subunidad mediana de diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18
M 198
Subunidad pequeña de diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18
P 199
Subunidad grande de glicerol deshidratasa putativa de Escherichia coli
G 200
Subunidad mediana de diol deshidratasa putativa de Escherichia coli
M 201
Subunidad pequeña de diol deshidratasa putativa de Escherichia coli
P 202
Subunidad grande de glicerol deshidratasa de Listeria monocytogenes str. 4b F2365
G 203
Subunidad mediana de deshidratasa de utilización de propanodiol de Listeria monocytogenes str. 4b F2365
M 204
Subunidad pequeña de deshidratasa de utilización de propanodiol de Listeria monocytogenes str. 4b F2365
P 205
Subunidad grande de glicerol deshidratasa pduC putativa de Streptococcus sanguinis SK36
G 206
Subunidad mediana de deshidratasa de utilización de propanodiol putativa de Streptococcus sanguinis SK36
M 207
Subunidad pequeña de diol deshidratasa dependiente de B12 putativa de Streptococcus sanguinis SK36
P 208
Subunidades grandes, medianas y pequeñas de glicerol y diol deshidratasa adicionales
aDescripción
bsubunidad SEC ID Proteínas
DhaB de Escherichia blattae
G 209
DhaC de Escherichia blattae
M 210
DhaE de Escherichia blattae
P 211
Subunidad grande de glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 de Clostridium perfringens str. 13
G 212
Subunidad mediana de glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 Clostridium perfringens str. 13
M 213
Subunidad pequeña de glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 Clostridium perfringens str. 13
P 214
Subunidad grande de propanodiol deshidratasa de Yersinia frederiksenii ATCC 33641
G 215
proteína hipotética YfreA_01000478 de Yersinia frederiksenii ATCC 33641]
M 216
Subunidad pequeña de propanodiol deshidratasa de Yersinia frederiksenii ATCC 33641
P 217
Glicerol deshidratasa de Thermoanaerobacter ethanolicus X514
G 218
Subunidad mediana de deshidratasa de Thermoanaerobacter ethanolicus X514
M 219
Subunidad pequeña de deshidratasa de Thermoanaerobacter ethanolicus X514
P 220
Subunidad grande de glicerol deshidratasa GldC de Lactobacillus hilgardii
G 221
Subunidad mediana de glicerol deshidratasa GldD de Lactobacillus hilgardii
M 222
Subunidad pequeña de glicerol deshidratasa GldE de Lactobacillus hilgardii
P 223
Glicerol deshidratasa de Lactobacillus reuteri JCM 1112
G 224
similar a subunidad gamma de diol deshidratasa de Lactobacillus reuteri JCM 1112
M 225
Subunidad pequeña de deshidratasa de utilización de propanodiol de Lactobacillus reuteri JCM 1112
P 226
Subunidad grande de glicerol deshidratasa GldC de Lactobacillus diolivorans
G 227
Subunidad mediana de glicerol deshidratasa GldD de Lactobacillus diolivorans
M 228
Subunidad pequeña de glicerol deshidratasa GldE de Lactobacillus diolivorans
P 229
Subunidad grande de propanodiol deshidratasa de Lactobacillus reuteri
G 230
Subunidad mediana de propanodiol deshidratasa de Lactobacillus reuteri
M 231
Subunidad pequeña de propanodiol deshidratasa de Lactobacillus reuteri
P 232
Subunidad grande de glicerol deshidratasa de Mesorhizobium loti MAFF303099
G+M 233
Subunidad pequeña de glicerol deshidratasa de Mesorhizobium loti MAFF303099
P 234
Glicerol deshidratasa de Mycobacterium vanbaalenii PIR-1
G+M 235
Subunidad pequeña de deshidratasa de utilización de propanodiol de Mycobacterium vanbaalenii PIR-1
P 236
Glicerol deshidratasa de Mycobacterium sp. MCS
G+M 237
Subunidad pequeña de deshidratasa de Mycobacterium sp. MCS
P 238
Subunidad grande de deshidratasa: subunidad mediana de deshidratasa de Mycobacterium flavescens PIR-GCK
G+M 239
Subunidad pequeña de deshidratasa de utilización de propanodiol de Mycobacterium flavescens PIR-GCK
P 240
Subunidades grandes, medianas y pequeñas de glicerol y diol deshidratasa adicionales
aDescripción
bsubunidad SEC ID Proteínas
Glicerol deshidratasa de Mycobacterium sp. JLS
G+M 241
Subunidad pequeña de deshidratasa de Mycobacterium sp. JLS
P 242
Subunidad grande de glicerol deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
G 243
Subunidad mediana de deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
M 244
Subunidad gamma de diol deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
P 245
Subunidades adicionales
subunidad grande de glicerol deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
G+M 246
subunidad grande de glicerol deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
G+M 247
subunidad pequeña de glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
P 248
subunidad pequeña de glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
P 249
subunidad mediana de diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150
M 250
subunidad pequeña de diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150
P 251
subunidad beta de glicerol deshidratasa de Clostridium perfringens SM101
M 252
subunidad gamma de glicerol deshidratasa de Clostridium perfringens SM101
P 253
PduC de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium
G 254
subunidad grande de glicerol deshidratasa de Listeria monocytogenes str. 4b H7858
G 255
DhaB de Escherichia blattae
G 256
DhaB de bacteria sin cultivar
G 257
DhaB de bacteria sin cultivar
G 258
Subunidad grande de glicerol deshidratasa GldC de Lactobacillus collinoides
G 259
PduD de bacteria sin cultivar
M 260
PduD de bacteria sin cultivar
M 261
DhaC de bacteria sin cultivar
M 262
DhaC de bacteria sin cultivar
M 263
DhaC de bacteria sin cultivar
M 264
subunidad mediana de glicerol deshidratasa dependiente de la coenzima B12 de Clostridium perfringens ATCC 13124
M 265
desconocida
M 266
subunidad beta de glicerol deshidratasa de Escherichia blattae
M 267
PduE de bacteria sin cultivar
P 268
PduE de bacteria sin cultivar
P 269
Subunidades grandes, medianas y pequeñas de glicerol y diol deshidratasa adicionales
aDescripción
bsubunidad SEC ID Proteínas
subunidad pequeña de deshidratasa de Listeria monocytogenes str. 1/2a F6854
P 270
DhaE de bacteria sin cultivar
P 271
DhaE de bacteria sin cultivar
P 272
DhaE de bacteria sin cultivar
P 273
subunidad pequeña de deshidratasa de Listeria monocytogenes FSL N1-017
P 274
aDescripción: de la anotación de Genbank de la secuencia y puede no estar corregido incluyendo la designación de glicerol o diol, o puede no incluir la información de la subunidad. bSubunidad: identificada por homología de secuencias con la subunidad grande, mediana o pequeña de la enzima Klebsiella oxytoca. cSe enumeran juntas las subunidades que son del mismo organismo y tienen anotaciones como la misma enzima, o tienen números de Genbank próximos juntos que indican proximidad en el genoma.
SEC ID Nº: 284 es la secuencia de un fragmento sintético que contiene regiones codificantes de diol deshidratasa y
reactivasa independiente de B12 de Roseburia inulinivorans. SEC ID Nº: 285-296, 302-307, 311-316, 319, 320, 322, 323 son las secuencias de nucleótidos de cebadores de PCR y de clonación de oligonucleótidos adicionales usados en los ejemplos.
SEC ID Nº: 297 es el terminador dual. SEC ID Nº: 298 es el terminador ADH1. SEC ID Nº: 299 es el terminador CYC1. SEC ID Nº: 300 es el terminador FBA. SEC ID Nº: 301 es el promotor GPM. SEC ID Nº: 308 es el promotor CUP1. SEC ID Nº: 309 es la región codificante de alsS de Bacillus subtilis. SEC ID Nº: 310 es la región codificante de ILV3 de S. cerevisiae. SEC ID Nº: 317 es el promotor GPD. SEC ID Nº: 318 es la región codificante del gen ILV5 de S. cerevisiae. SEC ID Nº: 321 es la región codificante de kivD de Lactococcus lactis.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para la producción de 2-butanol usando microorganismos recombinantes. La presente invención cumple varias necesidades comerciales e industriales. El butanol es un producto químico industrial importante con una variedad de aplicaciones, siendo particularmente significativo su potencial como combustible o aditivo para combustibles. Aunque es solo un alcohol de cuatro carbonos, el butanol tiene un contenido de energía similar al de la gasolina y puede mezclarse con cualquier combustible fósil. El butanol es preferido como combustible o aditivo para combustibles y que solo produce CO2 y poco o ningún SOx o NOx cuando se quema en el motor de combustión interna convencional. Adicionalmente, el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo para combustibles más preferido hasta la fecha.
Además de su utilidad como biocombustible o aditivo para combustibles, el butanol tiene la posibilidad de incidir en los problemas de distribución de hidrógeno en la emergente industria de las pilas de combustible. Hoy en día, las pilas de combustible están plagadas de cuestiones de seguridad asociadas con el transporte y la distribución de hidrógeno. El butanol puede reformarse fácilmente para su contenido de hidrógeno y puede distribuirse a través de estaciones de servicio existentes en la pureza requerida para tanto pilas de combustible como motores de combustión en vehículos.
Finalmente, la presente invención produce 2-butanol a partir de fuentes de carbono derivadas de plantas, evitando el impacto medioambiental negativo asociado a los procedimientos petroquímicos convencionales para la producción
de butanol.
La presente invención también proporciona microorganismos recombinantes y procedimientos para producir 2butanona, un producto intermedio en la ruta biosintética de los 2-butanoles desvelados en el presente documento. La 2-butanona, también conocida como metiletilcetona (MEK), es útil como disolvente en pinturas y otros recubrimientos. También se usa en la industria del caucho sintético y en la producción de cera de parafina.
Las siguientes definiciones y abreviaturas van a usarse para la interpretación de las reivindicaciones y la memoria descriptiva.
El término “invención” o “presente invención” como se usa en el presente documento es un término no limitante y no pretende referirse a ninguna realización individual de la invención particular, pero engloba todas las posibles realizaciones como se describen en la memoria descriptiva y las reivindicaciones.
El término “ruta biosintética del 2-butanol” se refiere a las rutas de enzimas para producir 2-butanol a partir de piruvato.
El término “ruta biosintética de la 2-butanona” se refiere a las rutas de enzimas para producir 2-butanona a partir de piruvato.
El término “acetolactato sintasa”, también conocido como “acetohidroxi sintasa ácida”, se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de dos moléculas de ácido pirúvico en una molécula de alfa-acetolactato. La acetolactato sintasa, conocida como EC 2.2.1.6 [anteriormente 4.1.3.18] (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego) puede ser dependiente del cofactor tiamina pirofosfato por su actividad. Están disponibles enzimas acetolactato sintasa adecuadas de varias fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank nº: secuencia de aminoácidos de NCBI (Centro Nacional para Información Biotecnológica) AAA22222 (SEC ID Nº: 77), secuencia de nucleótidos de NCBI L04470 (SEC ID Nº: 76)], Klebsiella terrigena [GenBank nº: AAA25055 (SEC ID Nº: 79), L04507 (SEC ID Nº: 78)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank nº: AAA25079 (SEC ID Nº: 4), M73842 (SEC ID Nº: 3)].
El término “acetolactato descarboxilasa” se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de alfa-acetolactato en acetoína. Las acetolactato descarboxilasas se conocen como EC 4.1.1.5 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus subtilis [GenBank nº: AAA22223 (SEC ID Nº: 81), L04470 (SEC ID Nº: 80)], Klebsiella terrigena [GenBank nº: AAA25054 (SEC ID Nº: 83), L04507 (SEC ID Nº: 82)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank nº: AAU43774 (SEC ID Nº: 2), AY722056 (SEC ID Nº: 1)].
El término “acetoína aminasa” se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de acetoína en 3-amino-2-butanol. La acetoína aminasa puede utilizar el cofactor piridoxal 5'fosfato o NADH (nicotinamida adenina dinucleótido reducido) o NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido). El producto resultante puede tener estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente de piridoxal fosfato puede usar un aminoácido tal como alanina o glutamato como donante de amino. Las enzimas dependientes de NADH y NADPH pueden usar amoniaco como segundo sustrato. Un ejemplo adecuado de una acetoína aminasa dependiente de NADH, también conocida como amino alcohol deshidrogenasa, se describe por Ito y col. (patente de EE.UU. nº 6.432.688). Un ejemplo de una acetoína aminasa dependiente de piridoxal es la amina:piruvato aminotransferasa (también llamada amina:piruvato transaminasa) descrita por Shin y Kim (J. Org. Chem. 67:2848-2853 (2002)).
El término “butanol deshidrogenasa” se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la interconversión de 2-butanona y 2-butanol. Las butanol deshidrogenasas son un subconjunto de una amplia familia de alcohol deshidrogenasas. La butanol deshidrogenasa puede ser dependiente de NAD o NADP. Las enzimas dependientes de NAD se conocen como EC 1.1.1.1 y están disponibles, por ejemplo, de Rhodococcus ruber [GenBank nº: CAD36475 (SEC ID Nº: 14), AJ491307 (SEC ID Nº: 13)]. Las enzimas dependientes de NADP se conocen como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus [GenBank nº: AAC25556 (SEC ID Nº: 91), AF013169 (SEC ID Nº: 90)]. Adicionalmente, una butanol deshidrogenasa está disponible de Escherichia coli [GenBank nº: NP_417484 (SEC ID Nº: 75), NC_000913 (SEC ID Nº: 74)] y una ciclohexanol deshidrogenasa está disponible de Acinetobacter sp. [GenBank nº: AAG10026 (SEC ID Nº: 72), AF282240 (SEC ID Nº: 71)].
El término “acetoína cinasa” se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de acetoína en fosfoacetoína. La acetoína cinasa puede utilizar ATP (adenosina trifosfato) o fosfoenolpiruvato como donante de fosfato en la reacción. Aunque no hay informes de enzimas que catalicen esta reacción sobre acetoína, hay enzimas que catalizan la reacción análoga sobre el sustrato similar dihidroxiacetona, por ejemplo, enzimas conocidas como EC 2.7.1.29 (Garcia-Alles y col. (2004) Biochemistry 43:13037-13045).
El término “acetoína fosfato aminasa” se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de fosfoacetoína en 3-amino-2-butanol O-fosfato. La acetoína fosfato aminasa puede usar el cofactor piridoxal 5'-fosfato, NADH o NADPH. El producto resultante puede tener estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente de piridoxal fosfato puede usar un aminoácido tal como alanina o glutamato. Las enzimas dependientes de NADH y NADPH pueden usar amoniaco como segundo sustrato. Aunque no hay informes
de enzimas que catalicen esta reacción sobre fosfoacetoína, hay una enzima dependiente de piridoxal fosfato que está propuesta para llevar a cabo la reacción análoga sobre el sustrato similar serinol fosfato (Yasuta y col. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:4999-5009).
El término “aminobutanol fosfato fosfo-liasa”, también llamada “amino alcohol O-fosfato liasa”, se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 3-amino-2-butanol Ofosfato en 2-butanona. La aminobutanol fosfato fosfo-liasa puede utilizar el cofactor piridoxal 5'-fosfato. No hay informes previos de enzimas que catalicen esta reacción sobre aminobutanol fosfato, aunque hay informes de enzimas que catalizan la reacción análoga sobre el sustrato similar 1-amino-2-propanol fosfato (Jones y col. (1973) Biochem J. 134:167-182). La presente invención describe una aminobutanol fosfato fosfo-liasa recientemente identificada (SEC ID Nº: 126) del organismo Erwinia carotovora, con la actividad demostrada en el Ejemplo 15 en el presente documento.
El término “aminobutanol cinasa” se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 3-amino-2-butanol en 3-amino-2-butanol O-fosfato. La aminobutanol cinasa puede utilizar ATP como donante de fosfato. Aunque no hay informes de enzimas que catalicen esta reacción sobre 3-amino-2butanol, hay informes de enzimas que catalizan la reacción análoga sobre los sustratos similares etanolamina y 1amino-2-propanol (Jones y col., arriba). La presente invención describe, en el Ejemplo 14, una amino alcohol cinasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (SEC ID Nº: 124). El término “butanodiol deshidrogenasa”, también conocida como “acetoína reductasa”, se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de acetoína en 2,3-butanodiol. Las butanodiol deshidrogenasas son un subconjunto de la amplia familia de alcohol deshidrogenasas. Las enzimas butanodiol deshidrogenasas pueden tener especificidad por la producción de estereoquímica (R) o (S) en el producto de alcohol. Las butanodiol deshidrogenasas específicas de
(S) se conocen como EC 1.1.1.76 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella pneumoniae (GenBank nº: BBA13085 (SEC ID Nº: 6), D86412 (SEC ID Nº: 5)). Las butanodiol deshidrogenasas específicas de (R) se conocen como EC 1.1.1.4 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus [GenBank nº. NP_830481 (SEC ID Nº: 85), NC_004722 (SEC ID Nº: 84); AAP07682 (SEC ID Nº: 87), AE017000 (SEC ID Nº: 86)] y Lactococcus lactis [GenBank nº. AAK04995 (SEC ID Nº: 89), AE006323 (SEC ID Nº: 88)].
El término “butanodiol deshidratasa”, también conocida como “diol deshidratasa” o “propanodiol deshidratasa”, se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 2,3butanodiol en 2-butanona. La butanodiol deshidratasa puede utilizar el cofactor adenosil cobalamina (también conocida como coenzima B12, o vitamina B12; aunque la vitamina B12 también puede referirse a otras formas de cobalamina que no son la coenzima B12). La enzimas dependientes de adenosil cobalamina se conocen como EC
4.2.1.28 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella oxytoca [GenBank nº: BAA08099 (subunidad alfa) (SEC ID Nº: 8), D45071 (SEC ID Nº: 7); BAA08100 (subunidad beta) (SEC ID Nº: 10), D45071 SEC ID Nº: 9); y BBA08101 (subunidad gamma) (SEC ID Nº: 12), D45071 (SEC ID Nº: 11) (obsérvese que las tres subunidades se requieren para la actividad)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank nº: AAC98384 (subunidad alfa) (SEC ID Nº: 105), AF102064 (SEC ID Nº: 104); GenBank nº: AAC98385 (subunidad beta) (SEC ID Nº: 107), AF102064 (SEC ID Nº: 106), (GenBank nº: AAC98386 (subunidad gamma) SEC ID Nº: 109), AF102064 (SEC ID Nº: 108)]. Otras diol deshidratasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, diol deshidratasas dependientes de B12 disponibles de Salmonella typhimurium [GenBank nº: AAB84102 (subunidad grande) (SEC ID Nº: 93), AF026270 (SEC ID Nº: 92); GenBank nº: AAB84103 (subunidad mediana) (SEC ID Nº: 95), AF026270 (SEC ID Nº: 94); GenBank nº: AAB84104 (subunidad pequeña) (SEC ID Nº: 97), AF026270 (SEC ID Nº: 96)]; y Lactobacillus collinoides [GenBank nº: CAC82541 (subunidad grande) (SEC ID Nº: 99), AJ297723 (SEC ID Nº: 98); GenBank nº: CAC82542 (subunidad mediana) (SEC ID Nº: 101); AJ297723 (SEC ID Nº: 100); GenBank nº: CAD01091 (subunidad pequeña) (SEC ID Nº: 103), AJ297723 (SEC ID Nº: 102)]; y enzimas de Lactobacillus brevis (particularmente las cepas CNRZ 734 y CNRZ 735, Speranza y col., arriba) y secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas correspondientes. Los procedimientos de aislamiento del gen diol deshidratasa son muy conocidos en la técnica (por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.686.276). Diol deshidratasas adicionales se enumeran en la Tabla 2.
El término “glicerol deshidratasa” se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol en 3-hidroxipropionaldehído. Las glicerol deshidratasas dependientes de adenosil cobalamina se conocen como EC 4.2.1.30. Las glicerol deshidratasas de EC 4.2.1.30 son similares a las diol deshidratasas en secuencia y en que tienen tres subunidades. Las glicerol deshidratasas también pueden usarse para convertir 2,3-butanodiol en 2-butanona. Algunos ejemplos de glicerol deshidratasas de EC 4.2.1.30 incluyen aquellos de Klebsiella pneumoniae (subunidad alfa, SEC ID Nº: 145, región codificante y SEC ID Nº: 146, proteína; subunidad beta, SEC ID Nº: 147, región codificante y SEC ID Nº: 148, proteína; y subunidad gamma SEC ID Nº: 149, región codificante y SEC ID Nº: 150, proteína); de Clostridium pasteurianum [GenBank nº: 3360389 (subunidad alfa, SEC ID Nº: 135), 3360390 (subunidad beta, SEC ID Nº: 136) y 3360391 (subunidad gamma, SEC ID Nº: 137)]; de Escherichia blattae [GenBank nº: 60099613 (subunidad alfa, SEC ID Nº: 138), 57340191 (subunidad beta, SEC ID Nº: 139) y 57340192 (subunidad gamma, SEC ID Nº: 140)]; y de Citrobacter freundii [GenBank nº: 1169287 (subunidad alfa, SEC ID Nº: 141), 1229154 (subunidad beta, SEC ID Nº: 142) y 1229155 (subunidad gamma, SEC ID Nº: 143)]. Obsérvese que las tres subunidades se requieren para la actividad. Glicerol deshidratasas adicionales se enumeran en la Tabla 2.
Las diol y glicerol deshidratasas pueden experimentar inactivación suicida durante la catálisis. Una proteína de factor
de reactivación, también denominada en el presente documento “reactivasa”, puede usarse para reactivar las enzimas inactivas (Mori y col., J. Biol. Chem. 272:32034 (1997)). Preferentemente, el factor de reactivación se obtiene de la misma fuente que la diol o glicerol deshidratasa usada. Por ejemplo, los factores de reactivación de diol deshidratasa adecuados están disponibles de Klebsiella oxytoca [GenBank nº: AAC15871 (subunidad grande) (SEC ID Nº: 111), AF017781 (SEC ID Nº: 110); GenBank nº: AAC15872 (subunidad pequeña) (SEC ID Nº: 113), AF017781 (SEC ID Nº: 112)]; Salmonella typhimurium [GenBank nº: AAB84105 (subunidad grande) (SEC ID Nº: 115), AF026270 (SEC ID Nº: 114), GenBank nº: AAD39008 (subunidad pequeña) (SEC ID Nº: 117), AF026270 (SEC ID Nº: 116)]; y Lactobacillus collinoides [GenBank nº: CAD01092 (subunidad grande) (SEC ID Nº: 119), AJ297723 (SEC ID Nº: 118); GenBank nº: CAD01093 (subunidad pequeña) (SEC ID Nº: 121), AJ297723 (SEC ID Nº: 120)]. Tanto la subunidad grande como pequeña se requieren para la actividad. Por ejemplo, están disponibles factores reactivantes de glicerol deshidratasa adecuados de Klebsiella pneumoniae (subunidad grande, SEC ID Nº: 151, región codificante y SEC ID Nº: 152, proteína; y subunidad pequeña, SEC ID Nº: 153, región codificante y SEC ID Nº: 154, proteína).
Las diol o glicerol deshidratasas también pueden funcionar independientemente de la coenzima B12. Tales deshidratasas se conocen frecuentemente como diol o glicerol deshidratasas independientes de B12. Éstas se describen adicionalmente en la descripción de la ruta 3 más adelante. El término “un anaerobio facultativo” se refiere a un microorganismo que puede crecer en tanto entornos aerobios como anaerobios.
El término “sustrato de carbono” o “sustrato de carbono fermentable” se refiere a una fuente de carbono que puede ser metabolizada por organismos huésped de la presente invención y particularmente fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de un carbono o mezclas de los mismos.
El término “gen” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que puede expresarse como una proteína específica, que incluye opcionalmente secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes en 5') y que siguen (secuencias no codificantes en 3') a la secuencia codificante. “Gen nativo” se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. “Gen quimérico” se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de un modo diferente al encontrado en la naturaleza. “Gen endógeno” se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen “extraño” o “heterólogo” se refiere a un gen normalmente no encontrado en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un “transgén” es un gen que se ha introducido en el genoma por un procedimiento de transformación.
Como se usa en el presente documento, un “fragmento de ácido nucleico aislado” o “molécula de ácido nucleico aislada” o “construcción genética” se usará indistintamente y significará un polímero de ARN o ADN que es mono- o bicatenario, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.
Un fragmento de ácido nucleico es “hibridable” con otro fragmento de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico o molécula de ARN, cuando una forma monocatenaria del fragmento de ácido nucleico pueda hibridarse con el otro fragmento de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica en disolución. La condiciones de hibridación y de lavado son muy conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch,
E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratorio Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente Capítulo 11 y Tabla 11.1 en su interior. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la “rigurosidad” de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para cribar fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homólogas de organismos distantemente relacionados) con fragmentos altamente similares (tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados). Los lavados post-hibridación determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones preferidas usa una serie de lavados a partir de 6X SSC, 0,5 % de SDS a temperatura ambiente durante 15 min, luego repetido con 2X SSC, 0,5 % de SDS a 45 ºC durante 30 min y luego repetido dos veces con 0,2X SSC, 0,5 % de SDS a 50 ºC durante 30 min. Un conjunto más preferido de condiciones rigurosas usa mayores temperaturas en las que los lavados son idénticos a los anteriores, excepto porque la temperatura de los dos lavados finales de 30 min en 0,2X SSC, 0,5 % de SDS aumentó a 60 ºC. Otro conjunto preferido de condiciones altamente rigurosas usa dos lavados finales en 0,1X SSC, 0,1 % de SDS a 65 ºC. Un conjunto adicional de condiciones rigurosas incluye, por ejemplo, hibridación en 0,1X SSC, 0,1 % de SDS, 65 ºC y lavados con 2X SSC, 0,1 % de SDS seguido de 0,1X SSC, 0,1 % de SDS.
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación son posibles desapareamientos entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables muy conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos que tienen aquellas secuencias. La
estabilidad relativa (correspondiente a mayor Tm) de hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud se han derivado las ecuaciones para calcular Tm (véase Sambrook y col., arriba, 9.50-9.51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los desapareamientos se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook y col., arriba, 11.7-11.8). En una realización, la longitud para un ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferentemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 15 nucleótidos; más preferentemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos; y lo más preferentemente el décimo es al menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, el experto reconocerá que la temperatura y la concentración de las sales de la disolución de lavado puede ajustarse, según sea necesario, según factores tales como la longitud de la sonda.
Una “porción sustancial” de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos es esa porción que comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, tanto por evaluación manual de la secuencia por un experto en la materia como por comparación e identificación de secuencias automatizada por ordenador usando algoritmos tales como BLAST (Altschul, S. F. y col., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)). En general, es necesaria una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos con el fin de identificar putativamente un polipéptido o secuencia de ácidos nucleicos como homóloga a una proteína o gen dado. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicas para genes que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos pueden usarse en procedimientos dependientes de secuencia de identificación de genes (por ejemplo, hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófagos). Además, pueden usarse oligonucleótidos cortos de 12-15 bases como cebadores de amplificación en PCR con el fin de obtener un fragmento de ácido nucleico particular que comprenda los cebadores. Por consiguiente, una “porción sustancial” de una secuencia de nucleótidos comprende suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente memoria descriptiva enseña la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos completa que codifica proteínas fúngicas particulares. El experto, que tiene el beneficio de las secuencias como se informa en el presente documento, puede ahora usar toda
o una porción sustancial de las secuencias desveladas para los fines conocidos para aquellos expertos en esta materia. Por consiguiente, la presente invención comprende las secuencias completas como se han informado en el listado de secuencias adjunto, además de porciones sustanciales de aquellas secuencias como se ha definido anteriormente.
El término “complementario” se usa para describir la relación entre bases de nucleótidos que pueden hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto a ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina.
Los términos “homología” y “homólogo” se usan indistintamente en el presente documento. Se refieren a fragmentos de ácido nucleico en los que cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar en la expresión génica o producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención tales como deleción o inserción de uno
o más nucleótidos que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con respecto al fragmento sin modificar inicial. Por tanto, se entiende, como apreciarán aquellos expertos en la materia, que la invención engloba más de las secuencias a modo de ejemplo específicas.
Además, el experto reconoce que las secuencias de ácidos nucleicos homólogas englobadas por la presente invención también se definen por su capacidad para hibridarse, bajo condiciones moderadamente rigurosas (por ejemplo, 0,5 X SSC, 0,1 % de SDS, 60 ºC), con las secuencias ejemplificadas en el presente documento, o con cualquier porción de las secuencias de nucleótidos desveladas en el presente documento y que son funcionalmente equivalentes a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos desveladas en el presente documento.
“Degeneración de codones” se refiere a la naturaleza en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin que resulte afectada la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El experto conoce muy bien la “preferencia codónica” mostrada por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por tanto, cuando se sintetiza un gen para la expresión mejorada en una célula huésped, se desea diseñar el gen de forma que su frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia de uso de codones preferida de la célula huésped.
El término “identidad en porcentaje”, como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, como se determina comparando las secuencias. En la materia, “identidad” también significa el grado de vinculación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, como pueda ser el caso, como se ha determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La “identidad” y “similitud” pueden calcularse fácilmente mediante procedimientos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
Procedimientos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la mejor coincidencia entre las secuencias probadas. Los procedimientos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los alineamientos de secuencias y cálculos de identidad en porcentaje pueden realizarse usando el programa MegAlign™ del paquete computacional bioinformático LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). El alineamiento múltiple de las secuencias se realiza usando el “procedimiento Clustal de alineamiento” que engloba varias variedades del algoritmo que incluye el “procedimiento Clustal V de alineamiento” correspondiente al procedimiento de alineamiento Clustal V marcado (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. y col., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) y encontrado en el programa MegAlign™ del paquete computacional bioinformático LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alineamientos múltiples, los valores por defecto se corresponden con PENALIZACIÓN POR HUECO=10 y PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=10. Los parámetros por defecto para alineamientos por parejas y el cálculo de identidad en porcentaje de las secuencias de proteínas usando el procedimiento Clustal son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN POR HUECO=3, VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. Para ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN POR HUECO=5, VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias usando el programa Clustal V es posible obtener una “identidad en porcentaje” visualizando la tabla de “distancias de secuencias” en el mismo programa. Adicionalmente, el “procedimiento Clustal W de alineamiento” está disponible y se corresponde con el procedimiento de alineamiento Clustal W marcado (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. y col., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191 (1992)) y encontrado en el programa MegAlign™ v6.1 del paquete computacional bioinformático LASERGENE (DNASTAR Inc.). Los parámetros por defecto para el alineamiento múltiple (PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,2, Delay Divergen Seqs(%)=30, peso de transición de ADN=0,5, matriz de pesos de proteínas=serie de Gonnet, matriz de pesos de ADN=IUB). Después del alineamiento de las secuencias usando el programa Clustal W es posible obtener una “identidad en porcentaje” visualizando la tabla de “distancias de secuencias” en el mismo programa.
Es bien entendido por un experto en la materia que muchos niveles de identidad de secuencias son útiles en identificar polipéptidos, de otras especies, en los que tales polipéptidos tienen la misma función o actividad o similar. Ejemplos útiles de porcentaje de identidades incluyen, pero no se limitan a: 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o cualquier porcentaje en número entero el 75 % al 100 % puede ser útil en describir la presente invención, tal como el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 %. Los fragmentos de ácido nucleico adecuados no solo tienen las homologías anteriores, sino que normalmente codifican un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, preferentemente al menos 100 aminoácidos, más preferentemente al menos 150 aminoácidos, todavía más preferentemente al menos 200 aminoácidos, y lo más preferentemente al menos 250 aminoácidos.
El término “software de análisis de secuencias” se refiere a cualquier algoritmo informático o programa de software que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El “software de análisis de secuencias” puede estar comercialmente disponible o desarrollarse independientemente. El software de análisis de secuencias típico incluirá, pero no se limita a: 1.) el paquete GCG de programas (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul y col., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY). Dentro del contexto de la presente solicitud se entenderá que si el software de análisis de secuencias se usa para el análisis, que los resultados del análisis se basarán en los “valores por defecto” del programa referenciado, a menos que se especifique de otro modo. Como se usa en el presente documento, “valores por defecto” significará cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el software cuando se inicializa por primera vez.
Como se usa en el presente documento, el término “secuencia codificante” o “CDS” se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos específica. “Secuencias reguladoras adecuadas” se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas en la dirección 5' (secuencias no codificantes en 5'), dentro de, o en la dirección 3' (secuencias no codificantes en 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias conductoras de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilación, sitio de procesamiento de ARN, sitio de unión del efector y estructura de tallo-lazo.
El término “promotor” se refiere a una secuencia de ADN que puede controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante se localiza 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Se entiende por aquellos expertos en la materia que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones medioambientales o fisiológicas. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células la mayoría de las veces se denominan comúnmente “promotores constitutivos”. Se reconoce adicionalmente que como en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad promotora idéntica.
El término “operativamente ligadas” se refiere a la asociación de secuencias de ácidos nucleicos en un único fragmento de ácido nucleico de manera que la función de una esté afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado con una secuencia codificante cuando puede efectuar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante esté bajo el control transcripcional de un promotor). Las secuencias codificantes pueden ligarse operativamente a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido.
El término “expresión”, como se usa en el presente documento, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión puede también referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido.
Como se usa en el presente documento, el término “transformación” se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un organismo huésped, produciendo herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos “transgénicos” o “recombinantes” o “transformados”.
Los términos “plásmido” y “vector” se refieren a un elemento extracromosómico que frecuentemente lleva genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y normalmente en forma de fragmentos de ADN bicatenario circular. Tales elementos pueden ser secuencias autónomamente replicantes, secuencias que integran el genoma, secuencias de fagos o de nucleótidos, ADN o ARN lineal o circular, mono o bicatenario, derivado de cualquier fuente, en el que varias secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una única construcción que puede introducir un fragmento de promotor y secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con secuencia sin traducir en 3' apropiada en una célula. “Vector de transformación” se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que facilitan la transformación de una célula huésped particular.
Como se usa en el presente documento, el término “degeneración de codones” se refiere a la naturaleza en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El experto conoce muy bien la “preferencia codónica” mostrada por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por tanto, cuando se sintetiza un gen para la expresión mejorada en una célula huésped, se desea diseñar el gen de forma que su frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia de uso de codones preferida de la células huésped.
El término “de codones optimizados”, como se refiere a genes o regiones codificantes de moléculas de ácidos nucleicos para la transformación de diversos huéspedes, se refiere a la alteración de codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácidos nucleicos para reflejar el uso de codones típico del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el ADN.
El término “medio de producto de fermentación” se refiere a un medio en el que se ha producido la fermentación de forma que el producto esté presente en el medio.
Las técnicas de ADN recombinante y de clonación molecular convencionales usadas aquí son muy conocidas en la técnica y se describen por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (en lo sucesivo “Maniatis”); y por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. y Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987).
Las rutas biosintéticas de 2-butanol y 2-butanona
Los microorganismos que utilizan hidrato de carbono emplean la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), la ruta de Entner-Doudoroff y el ciclo de la pentosa fosfato como rutas metabólicas principales para proporcionar energía y precursores celulares para el crecimiento y mantenimiento. Estas rutas tienen en común el producto intermedio gliceraldehído-3-fosfato y, por último lugar, se forma piruvato directamente o en combinación con la ruta de EMP. Las reacciones combinadas de conversión de azúcar en piruvato producen energía (por ejemplo, adenosina-5'trifosfato, ATP) y reducen equivalentes (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido reducido, NADH, y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido, NADPH). NADH y NADPH deben recircularse a sus formas oxidadas (NAD+ y NADP+, respectivamente). En presencia de aceptores de electrones inorgánicos (por ejemplo, O2, NO3 y SO42-), los equivalentes reductores pueden usarse para aumentar la reserva energética; alternativamente, puede formarse un subproducto de carbono reducido.
La invención permite la producción de 2-butanona o 2-butanol a partir de fuentes de hidrato de carbono con microorganismos recombinantes proporcionando una ruta biosintética completa a partir de piruvato en 2-butanona o 2-butanol. Se describen tres rutas adicionales. Aunque el 2-butanol no es conocido como el producto principal de cualquier fermentación bacteriana, hay varias posibles rutas para la producción de 2-butanol mediante tipos conocidos de reacciones bioquímicas. Estas rutas se muestran en la Figura 1. Las letras y números romanos citados a continuación se corresponden con las letras y números romanos en la Figura 1, que se usan para representar las etapas y productos de conversión, respectivamente. Como se describe a continuación, la 2-butanona es un producto
intermedio en todas estas rutas biosintéticas de 2-butanol.
Todas las rutas empiezan con la reacción inicial de dos moléculas de piruvato para dar alfa-acetolactato (I), mostradas como la conversión de sustrato en producto (a) en la Figura 1. A partir de alfa-acetolactato hay 4 rutas posibles para 2-butanona (V), citadas en el presente documento como las rutas biosintéticas de la 2-butanona:
Ruta
1) I--->II--->III--->IV--->V (conversión de sustrato en productos b, c, d, e);
2) I--->II--->VII--->IV--->V (conversión de sustrato en productos b, g, h, e)
3) I--->II--->VIII--->V (conversión de sustrato en productos b, i, j): Esta es la ruta de la presente invención.
4) I--->IX--->X--->V (conversión de sustrato en productos k, l, m)
Las rutas biosintéticas del 2-butanol concluyen con la conversión de la 2-butanona (V) en 2-butanol (VI). Una discusión detallada de la conversión de sustrato en productos en cada ruta se facilita a continuación.
Ruta 1:
(a) piruvato en alfa-acetolactato:
La etapa inicial en la ruta 1 es la conversión de dos moléculas de piruvato en una molécula de alfa-acetolactato (compuesto I en la Figura 1) y una molécula de dióxido de carbono catalizada por una enzima dependiente de tiamina pirofosfato. Las enzimas que catalizan esta conversión de sustrato en producto (generalmente llamadas tanto acetolactato sintasa como acetohidroxi sintasa ácida; EC 2.2.1.6 [cambiada de 4.1.3.18 en 2002]) son muy conocidas y participan en la ruta biosintética para los aminoácidos proteinogénicos leucina y valina, además de en la ruta para la producción fermentativa de 2,3-butanodiol y acetoína de varios organismos.
El experto apreciará que los polipéptidos que tienen actividad de acetolactato sintasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencias. Algunos ejemplos de enzimas acetolactato sintasa adecuadas están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank nº: secuencia de aminoácidos de NCBI (Centro Nacional para Información Biotecnológica) AAA22222 (SEC ID Nº: 77), secuencia de nucleótidos de NCBI L04470 (SEC ID Nº: 76)], Klebsiella terrigena [GenBank nº: AAA25055 (SEC ID Nº: 79), L04507 (SEC ID Nº: 78)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank nº: AAA25079 (SEC ID Nº: 4), M73842 (SEC ID Nº: 3)]. Enzimas acetolactato sintasa preferidas son aquellas que tienen al menos el 80 % - 85 % de identidad con SEC ID Nº 4, 77 y 79, en las que al menos el 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
(b) alfa-acetolactato en acetoína:
La alfa-acetolactato (I) se convierte en acetoína (II) por la acción de una enzima tal como acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5). Al igual que la acetolactato sintasa, esta enzima es dependiente de la tiamina pirofosfato y también participa en la producción de 2,3-butanodiol y acetoína por varios organismos. Las enzimas de diferentes fuentes varían bastante ampliamente en tamaño (25-50 kilodalton), oligomerización (dímero-hexámero), localización (intracelular de extracelular) y regulación alostérica (por ejemplo, activación por aminoácidos de cadena ramificada). Con el fin de la presente invención, una localización intracelular es preferible a extracelular, pero generalmente son aceptables otras variaciones.
El experto apreciará que los polipéptidos que tienen actividad de acetolactato descarboxilasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencias. Algunos ejemplos de enzimas acetolactato descarboxilasa adecuadas están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank nº: AAA22223 (SEC ID Nº: 81), L04470 (SEC ID Nº: 80)], Klebsiella terrigena [GenBank nº: AAA25054 (SEC ID Nº: 83), L04507 (SEC ID Nº: 82)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank nº: AAU43774 (SEC ID Nº: 2), AY722056 (SEC ID Nº: 1)].
Enzimas acetolactato descarboxilasa preferidas son aquellas que tienen al menos el 80 % - 85 % de identidad con SEC ID Nº 2, 81 y 83, en las que al menos el 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
(c) acetoína en 3-amino-2-butanol:
Hay dos tipos conocidos de reacciones bioquímicas que podrían efectuar la conversión de sustrato en producto de acetoína (II) en 3-amino-2-butanol (III), específicamente, transaminación dependiente de piridoxal fosfato utilizando
un donante de amino accesorio y aminación reductora directa con amoniaco. En el último caso, los equivalentes reductores se suministran en forma de un cofactor de nicotinamida reducido (tanto NADH o NADPH). Un ejemplo de una enzima dependiente de NADH que cataliza esta reacción con acetoína como sustrato se informa por Ito y col. (patente de EE.UU. nº 6.432.688). No se ha evaluado ninguna estereoespecificidad de esta enzima. Un ejemplo de una transaminasa dependiente de piridoxal fosfato que cataliza la conversión de acetoína en 3-amino-2-butanol se ha informado por Shin y Kim (arriba). Se mostró en el Ejemplo 13 en el presente documento que esta enzima convertía tanto el isómero (R) de acetoína en el isómero (2R,3S) de 3-amino-2-butanol como el isómero (S) de acetoína en el isómero (2S,3S) de 3-amino-2-butanol. Cualquier tipo de enzima (es decir, transaminasa o aminasa reductora) se considera que es una acetoína aminasa y puede utilizarse en la producción de 2-butanol. Otras enzimas en este grupo pueden tener diferentes estereospecificidades.
El experto apreciará que los polipéptidos que tienen actividad de acetoína aminasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencias. Un ejemplo de esta actividad se ha descrito en el presente documento y se identifica como SEC ID Nº: 122. Por consiguiente, enzimas acetoína aminasa preferidas son aquellas que tienen al menos el 80 % - 85 % de identidad con SEC ID Nº: 122, en las que al menos el 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
(d) 3-amino-2-butanol en 3-amino-2-butanol O-fosfato:
No se conocen enzimas en la técnica que catalicen la conversión de sustrato en producto de 3-amino-2-butanol (III) en 3-amino-2-butanol fosfato (IV). Sin embargo, se ha mostrado que algunas especies de Pseudomonas y Erwinia expresan una etanolamina cinasa dependiente de ATP (EC 2.7.1.82) que les permite utilizar etanolamina o 1-amino2-propanol como fuente de nitrógeno (Jones y col. (1973) Biochem. J. 134:167-182). Es probable que esta enzima también tenga actividad hacia 3-amino-2-butanol o pudiera manipularse para tenerla, proporcionando así una aminobutanol cinasa. La presente invención describe en el Ejemplo 14 un gen de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (SEC ID Nº: 123) que codifica una proteína (SEC ID Nº: 24) que se identifica como amino alcohol cinasa. Esta enzima puede usarse para convertir 3-amino-2-butanol en 3-amino-2-butanol O-fosfato.
El experto apreciará que los polipéptidos que tienen actividad de aminobutanol cinasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencias. Un ejemplo de esta actividad se ha descrito en el presente documento y se identifica como SEC ID Nº: 124. Por consiguiente, enzimas aminobutanol cinasa preferidas son aquellas que tienen al menos el 80 % - 85 % de identidad con SEC ID Nº: 124, en las que al menos el 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
(e) 3-amino-2-butanol fosfato en 2-butanona:
Aunque no se informado de enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto de 3-amino-2-butanol fosfato (IV) en 2-butanona (V), el sustrato es muy similar a aquellos utilizados por la enzima fosfoetanolamina fosfoliasa dependiente de piridoxal fosfato, que se ha encontrado en un pequeño número de especies de Pseudomonas y Erwinia. Estas enzimas tienen actividad hacia fosfoetanolamina y ambos enantiómeros de 2-fosfo-1-aminopropano (Jones y col. (1973) Biochem. J. 134:167-182), y también puede tener actividad hacia 3-amino-2-butanol O-fosfato. La presente invención describe un gen de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (SEC ID Nº: 125) que codifica una proteína (SEC ID Nº: 126) con homología a las aminotransferasas de clase III. El Ejemplo 15 demuestra que esta enzima es activa sobre tanto sustratos de aminopropanol fosfato como aminobutanol fosfato. La enzima recientemente identificada y caracterizada pudo catalizar la conversión de una mezcla de (R)-3-amino-(S)-2-butanol y (S)-3-amino-(R)-2-butanol O-fosfato, y una mezcla de (R)-3-amino-(R)-2-butanol y (S)-3-amino-(S)-2-butanol Ofosfato, en 2-butanona. La enzima recientemente identificada y caracterizada también pudo catalizar la conversión de tanto (R) como (S)-2-amino-1-propanol fosfato en propanona, con una preferencia por (S)-2-amino-1-propanol fosfato. La mayor actividad se observó con el sustrato natural propuesto DL-1-amino-2-propanol fosfato, que se convirtió en propionaldehído.
El experto apreciará que los polipéptidos que tienen actividad de aminobutanol fosfato fosfo-liasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencias. Un ejemplo de una enzima aminobutanol fosfato fosfo-liasa adecuada se describe en el presente documento como SEC ID Nº: 126. Por consiguiente, enzimas aminobutanol fosfato fosfo-liasa preferidas son aquellas que tienen al menos el 80 % - 85 % de identidad con SEC ID Nº 126, en las que al menos el 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
(f) 2-butanona en 2-butanol:
La etapa final en todas las rutas para producir 2-butanol a partir de ácido pirúvico es la reducción de 2-butanona (V) en 2-butanol (VI). Esta conversión de sustrato en producto se cataliza por algunos miembros de la amplia clase de alcohol deshidrogenasas (tipos que utilizan tanto NADH como NADPH como fuente de hidruro, dependiendo de la enzima) que pueden llamarse butanol deshidrogenasas. Las enzimas de cada tipo que catalizan la reducción de 2butanona son muy conocidos, como se ha descrito anteriormente en la definición para butanol deshidrogenasa.
El experto apreciará que los polipéptidos que tienen actividad de butanol deshidrogenasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencias. Algunos ejemplo de enzimas butanol deshidrogenasa adecuadas están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, Rhodococcus ruber [GenBank nº: CAD36475 (SEC ID Nº: 14), AJ491307 (SEC ID Nº: 13)]. Las enzimas dependientes de NADP se conocen como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus [GenBank nº: AAC25556 (SEC ID Nº: 91), AF013169 (SEC ID Nº: 90)]. Adicionalmente, una butanol deshidrogenasa está disponible de Escherichia coli [GenBank nº:NP_417484 (SEC ID Nº: 75), NC_000913 (SEC ID Nº: 74)] y una ciclohexanol deshidrogenasa está disponible de Acinetobacter sp. [GenBank nº: AAG10026 (SEC ID Nº: 72), AF282240 (SEC ID Nº: 71)]. Enzimas butanol deshidrogenasa preferidas son aquellas que tienen al menos el 80 % 85 % de identidad con SEC ID Nº 14, 91, 75 y 72, en las que al menos el 85 % -90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
Ruta 2:
(a)
piruvato en alfa-acetolactato:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
(b)
alfa-acetolactato en acetoína:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
(g)
acetoína en fosfoacetoína:
Aunque no se han descrito enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto de acetoína (II) en fosfoacetoína (VII), la estructura del sustrato acetoína es muy similar a la de la dihidroxiacetona y, por tanto, la acetoína puede ser un sustrato aceptable para dihidroxiacetona cinasa (EC 2.7.1.29), una enzima que cataliza la fosforilación de dihidroxiacetona. Técnicas de ingeniería de proteínas para la alteración de la especificidad por sustrato de enzimas son muy conocidas (Antikainen y Martin (2005) Bioorg. Med. Chem. 13:2701-2716) y pueden usarse para generar una enzima con la especificidad requerida. En esta conversión, el resto de fosfato puede suministrarse por cualquier donante de fosfato biológico de alta energía, siendo los sustratos comunes fosfoenolpiruvato (como en la dihidroxiacetona cinasa de E. coli) y ATP (como en la dihidroxiacetona cinasa de Citrobacter freundii) (Garcia-Alles y col. (2004) Biochemistry 43:13037-13045).
(h)
fosfoacetoína en 3-amino-2-butanol O-fosfato:
Aunque no se han descrito enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto de fosfoacetoína (VII) en 3amino-2-butanol O-fosfato (IV), la estructura del sustrato es muy similar a la de la dihidroxiacetona fosfato, un sustrato para la serinol fosfato aminotransferasa propuesta codificada por la porción 5' del gen rtxA en algunas especies de Bradyrhizobium (Yasuta y col., arriba). Así, una serinol fosfato aminotransferasa puede ser funcional en esta etapa.
(e)
3-amino-2-butanol O-fosfato en 2-butanona:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
(f)
2-butanona en 2-butanol:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
Ruta 3:
(a)
piruvato en alfa-acetolactato:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
(b)
alfa-acetolactato en acetoína:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
(i) acetoína en 2,3-butanodiol:
La conversión de sustrato en producto de acetoína (II) en 2,3-butanodiol (VIII) puede catalizarse por una butanodiol deshidrogenasa que puede tanto utilizar NADH como NADPH como fuente de equivalentes reductores cuando se llevan a cabo las reducciones. Las enzimas con actividad hacia acetoína participan en la ruta para la producción de 2,3-butanodiol en organismos que producen ese compuesto. Las enzimas informadas (por ejemplo, BudC de Klebsiella pneumoniae (Ui y col. (2004) Letters in Applied Microbiology 39:533-537) generalmente utilizan NADH. Cualquier cofactor es aceptable para su uso en la producción de 2-butanol por esta ruta.
El experto apreciará que los polipéptidos que tienen actividad de butanodiol deshidrogenasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencias. Algunos ejemplo de enzimas butanodiol deshidrogenasa adecuadas están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, Klebsiella pneumoniae (GenBank nº: BBA13085 (SEC ID Nº: 6), D86412 (SEC ID Nº: 5)). Las butanodiol deshidrogenasas específicas para (R) se conocen como EC 1.1.1.4 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus [GenBank nº. NP_830481 (SEC ID Nº: 85), NC_004722 (SEC ID Nº: 84); AAP07682 (SEC ID Nº: 87), AE017000 (SEC ID Nº: 86)] y Lactococcus lactis [GenBank nº. AAK04995 (SEC ID Nº: 89), AE006323 (SEC ID Nº: 88)]. Enzimas butanodiol deshidrogenasas preferidas son aquellas que tienen al menos el 80 %-85 % de identidad con SEC ID Nº 6, 85, 87 y 89, en las que al menos el 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
(j) 2,3-butanodiol en 2-butanona:
La conversión de sustrato en producto de 2,3-butanodiol (VIII) en 2-butanona (V) puede catalizarse por enzimas diol deshidratasa (EC 4.2.128) y enzimas glicerol deshidratasa (EC 4.2.130). La diol deshidratasa mejor caracterizada es la enzima Klebsiella oxytoca dependiente de la coenzima B12, pero enzimas similares se encuentran en varias bacterias entéricas. Se ha mostrado que la enzima K. oxytoca acepta meso-2,3-butanodiol como sustrato (Bachovchin y col. (1977) Biochemistry 16:1082-1092), produciendo el producto deseado 2-butanona. El Ejemplo 17 demuestra que la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae pudo convertir meso-2,3-butanodiol en 2-butanona. Las tres subunidades de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae (alfa: SEC ID Nº: 145 (región codificante) y 146 (proteína); beta: SEC ID Nº: 147 (región codificante) y 148 (proteína); y gamma: SEC ID Nº: 149 (región codificante) y 150 (proteína)) se expresaron conjuntamente con las dos subunidades de la glicerol deshidratasa reactivasa de Klebsiella pneumoniae (subunidad grande, SEC ID Nº: 151 (región codificante) y 152 (proteína); y subunidad pequeña, SEC ID Nº: 153 (región codificante) y 154 (proteína)) para proporcionar actividad.
También hay informes en la bibliografía de una diol deshidratasa independiente de B12 de Clostridium glycolicum (Hartmanis y col. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 245:144-152). Esta enzima tiene actividad hacia 2,3-butanodiol, aunque esta actividad es inferior al 1 % de la actividad hacia etanodiol, pero la enzima puede manipularse para mejorar esa actividad. Una deshidratasa independiente de B12 mejor caracterizada es la glicerol deshidratasa de Clostridium butyricum (proteína SEC ID Nº: 280; región codificante SEC ID Nº: 281; O'Brien y col. (2004) Biochemistry 43:4635-4645), que tiene alta actividad hacia 1,2-propanodiol, además de glicerol. Esta enzima usa Sadenosilmetionina como fuente de radical adenosilo. No hay informes de actividad hacia 2,3-butanodiol, pero tal actividad, si ya no está presente, puede posiblemente manipularse. También se ha informado de la glicerol deshidratasa reactivasa de Clostridium butyricum (proteína SEC ID Nº: 282; región codificante SEC ID Nº: 283).
Además, se ha identificado una propanodiol deshidratasa independiente de B12 putativa (independiente de la coenzima B12) de Roseburia inulinivorans (codificada por ORF18) como inducida bajo condiciones de utilización de fucosa y por homología de secuencias con la glicerol deshidratasa independiente de B12 de Clostridium butyricum (53 % de identidad; Scott y col., J. of Bacteriology (2006) 188:4340-4349)). Similarmente se identificó un activador de propanodiol deshidratasa putativa de Roseburia inulinivorans (codificada por ORF 19) con inducción de fucosa y homología con la glicerol deshidratasa activasa de Clostridium butyricum (35 % de identidad; Scott y col., véase arriba).
Los solicitantes han demostrado por primera vez que las proteínas ORF18 y ORF19 de Roseburia inulinivorans codificadas, llamadas en el presente documento RdhtA y RdhtB, respectivamente, proporcionan actividad de 1,2propanodiol deshidratasa cuando se expresan en una célula huésped microbiana recombinante (Ejemplo 19). Además, los solicitantes han encontrado que la expresión de RdhtA y RdhtB proporciona actividad para la conversión de meso-2,3-butanodiol en 2-butanona, que indica que la actividad enzimática expresada incluye actividad de butanodiol deshidratasa. Además, los solicitantes han demostrado en el presente documento que cuando RdhtA y RdhtB se expresan en una célula huésped microbiana recombinante que tiene una fuente de 2,3butanodiol y que tiene actividad de butanol deshidrogenasa, se produce 2-butanol (Ejemplo 21). La 2-butanona puede producirse si la célula huésped carece de actividad de butanol deshidrogenasa.
Así, en un aspecto de la invención, la actividad de glicerol/diol deshidratasa independiente de B12 preferida, más específicamente la actividad de butanodiol deshidratasa, se proporciona por las proteínas RdhtA y RdhtB para la conversión de 2,3-butanodiol en 2-butanona en la ruta biosintética 3, para la producción de 2-butanona o 2-butanol.
Usando estas proteínas, el 2-butanol puede producirse en ausencia de la coenzima B12, como se demuestra en el Ejemplo 21 en el presente documento, en el que la célula huésped microbiana recombinante usada para la producción es capaz de sintetizar coenzima B12 y no se añade vitamina B12 al medio. La vitamina B12 que se usa generalmente como aditivo en el medio no es la coenzima B12 (adenosil cobalamina), pero es otra forma de cobalamina que se convierte por células en la coenzima B12.
Una fuente de 2,3-butanodiol en las células huésped microbianas recombinantes puede proporcionarse naturalmente, exógenamente o manipulando una ruta biosintética para producir 2,3-butanodiol. Una ruta tal se describe anteriormente en las etapas que incluye proporcionar enzimas para la conversión de piruvato en alfaacetolactato, alfa-acetolactato en acetoína y acetoína en 2,3-butanodiol. RdhtA y RdhtB pueden expresarse en una célula que tiene enzimas capaces de llevar a cabo estas etapas para la producción de 2-butanona. La expresión de actividad de butanol deshidrogenasa, para la conversión de 2-butanona en 2-butanol, se describe anteriormente como una etapa adicional.
En la presente invención puede usarse cualquier diol deshidratasa o glicerol deshidratasa independiente de B12, junto con una diol deshidratasa reactivasa o glicerol deshidratasa reactivasa independiente de B12, con actividad de butanodiol deshidratasa. Una búsqueda con BLAST de secuencias públicamente disponibles revela que las secuencias de proteínas más próximas a RdhtA son una proteína desconocida de Ruminococcus gnavus (nº de acceso Z7B0E1) que es aproximadamente el 69 % idéntica y una proteína hipotética de Ruminococcus obeum (nº de acceso A5ZM80) que es aproximadamente el 66 % idéntica. Las secuencias de proteínas más próximas a RdhtB son una proteína hipotética de Ruminococcus gnavus (nº de acceso ZP_02040254) que es aproximadamente el 67 % idéntica y una proteína hipotética de Ruminococcus obeum (nº de acceso ZP_01962383) que es aproximadamente el 66 % idéntica.
En la presente invención pueden usarse proteínas que tienen al menos aproximadamente el 75 % o mayor identidad de aminoácidos con cualquiera de SEC ID Nº: 276 ó 278 que juntos proporcionan actividad de butanodiol deshidratasa independiente de B12, y moléculas de ADN aisladas que codifican dichas proteínas. Tales proteínas pueden tener identidad del 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 % o el 95 %-100 %. Pueden usarse moléculas de ADN aisladas que codifican dichas proteínas que tienen identidades de secuencia con SEC ID Nº: 277 ó 279 que son al menos aproximadamente el 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 % o el 95 %-100 %. Las más adecuadas son moléculas de ADN con SEC ID Nº: 277 y 279, que codifican la RdhtA de butanodiol deshidratasa independiente de B12 de Roseburia inulinivorans y la RdhtB de butanodiol deshidratasa reactivasa, respectivamente. Una molécula de ácido nucleico que codifica la butanodiol deshidratasa independiente de B12 de Roseburia inulinivorans, tal como SEC ID Nº: 277, puede usarse para aislar moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas homólogas, que tienen al menos el 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 % o el 95 %100 % de identidad de secuencias con este fragmento de ácido nucleico, de la misma especie microbiana u otra. Una molécula de ácido nucleico que codifica la butanodiol deshidratasa reactivasa independiente de B12 de Roseburia inulinivorans tal como SEC ID Nº: 279 puede usarse para aislar moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas homólogas, que tienen al menos el 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 % o el 95 %100 % de identidad de secuencias con este fragmento de ácido nucleico, de la misma especie microbiana u otra.
El aislamiento de homólogos usando protocolos dependientes de secuencia es muy conocido en la técnica. Ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos y procedimientos de amplificación de ADN y ARN como se ejemplifican por diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Mullis y col., patente de EE.UU. 4.683.202; reacción en cadena de la ligasa (LCR), Tabor, S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1074, (1985); o amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA), Walker, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 392, (1992)).
Por ejemplo, los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden aislarse directamente usando todo o una porción del fragmento de ácido nucleico de SEC ID Nº: 277 ó 279 como sonda de hibridación de ADN para cribar bibliotecas de cualquier bacteria deseada usando metodología muy conocida para aquellos expertos en la materia. Sondas de oligonucleótidos específicas basadas en SEC ID Nº: 277 ó 279 pueden diseñarse y sintetizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Maniatis, arriba). Además, la secuencia puede usarse directamente para sintetizar sondas de ADN mediante procedimientos conocidos para el experto tales como marcado de ADN con cebadores aleatorios, traslación de mellas o técnicas de marcado de los extremos, o sondas de ARN usando sistemas de transcripción in vitro disponibles. Además, pueden diseñarse y usarse cebadores específicos para amplificar una parte de o la longitud completa de homólogos de SEC ID Nº: 277 ó 279. Los productos de amplificación resultantes pueden marcarse directamente durante reacciones de amplificación o marcarse después de reacciones de amplificación, y usarse como sondas para aislar fragmentos de ADN de longitud completa en condiciones de rigurosidad apropiada.
Normalmente, en técnicas de amplificación tipo PCR, los cebadores tienen diferentes secuencias y no son complementarias entre sí. Dependiendo de las condiciones de prueba deseadas, las secuencias de los cebadores deben diseñarse para proporcionar tanto replicación eficaz como fiel del ácido nucleico diana. Los procedimientos de diseño de cebadores de PCR son comunes y muy conocidos en la técnica (Thein y Wallace, “The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”, en Human Genetic Diseases:
A Practical Approach, K. E. Davis Ed., (1986) pp. 33-50 IRL Press, Herndon, Virginia); Rychlik, W. (1993) In White,
B. A. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 15, páginas 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humania Press, Inc., Totowa, NJ.)
Generalmente, dos segmentos cortos de la presente secuencia de ácidos nucleicos pueden usarse para diseñar cebadores para su uso en protocolos de reacción en cadena de la polimerasa para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican regiones codificantes homólogas de ADN o ARN. La PCR puede realizarse usando como molde cualquier ADN que contenga una secuencia de ácidos nucleicos homóloga a SEC ID Nº: 277 ó 279, que incluye, por ejemplo, ADN genómico, ADNc o ADN de plásmido como molde. Si se usa una biblioteca de ADNc clonado, la secuencia de un cebador se deriva de SEC ID Nº: 277 ó 279 y la secuencia del otro cebador se aprovecha de la presencia de los tractos de ácido poliadenílico en el extremo 3' del precursor de ARNm que codifican genes microbianos. Alternativamente, la segunda secuencia de cebador puede basarse en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, el experto puede seguir el protocolo de RACE usando ARNm como molde (Frohman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998 (1988)) para generar ADNc usando PCR para amplificar copias de la región entre un único punto en el transcrito y el extremo 3' o 5'. Los cebadores orientados en las direcciones 3' y 5' pueden diseñarse a partir de la presente secuencia de ácidos nucleicos. Usando sistemas 3' RACE o 5' RACE comercialmente disponibles (Life Technologies, Rockville, MD) pueden aislarse fragmentos de ADNc de 3' o 5' específicos (Ohara y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673 (1989); Loh y col., Science 243:217 (1989)).
Alternativamente, una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº: 277 ó 279 o su complemento puede emplearse como reactivo de hibridación para la identificación de homólogos. Los componentes básicos de una prueba de hibridación de ácido nucleico incluyen una sonda, una muestra que se sospecha que contiene el gen o fragmento del gen de interés y un procedimiento de hibridación específico. Las sondas de la presente invención son normalmente secuencias de ácidos nucleicos monocatenarias que son complementarias a las secuencias de ácidos nucleicos que van a detectarse. Las sondas son “hibridables” con la secuencia de ácidos nucleicos que va a detectarse. La longitud de la sonda puede variar de 5 bases a decenas de miles de bases, y dependerá de la prueba específica a hacer. Normalmente, una longitud de las sondas de aproximadamente 15 bases a aproximadamente 30 bases es adecuada. Solo parte de la molécula de la sonda necesita ser complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos que va a detectarse. Además, la complementariedad entre la secuencia de la sonda y de diana no necesita ser perfecta. La hibridación se produce entre moléculas imperfectamente complementarias con el resultado de que una cierta fracción de las bases en la región hibridada no están emparejadas con la base complementaria apropiada.
Los procedimientos de hibridación están bien definidos. Normalmente, la sonda y la muestra deben mezclarse en condiciones que permitirán la hibridación de ácidos nucleicos. Esto implica poner en contacto la sonda y muestra en presencia de una sal inorgánica u orgánica bajo las condiciones de concentración y temperatura apropiadas. Los ácidos nucleicos de la sonda y la muestra deben estar en contacto durante un tiempo suficiente para que pueda producirse cualquier hibridación posible entre el ácido nucleico de la sonda y la muestra. La concentración de sonda
o diana en la mezcla determinará el tiempo necesario para que se produzca la hibridación. Cuanto mayor sea la concentración de sonda o diana, más corto será el tiempo de incubación de la hibridación necesario. Opcionalmente puede añadirse un agente caotrópico. El agente caotrópico estabiliza ácidos nucleicos inhibiendo la actividad de nucleasas. Además, el agente caotrópico permite hibridación sensible y rigurosa de sondas de oligonucleótidos cortas a temperatura ambiente (Van Ness y Chen, Nucl. Acids Res. 19:5143-5151(1991)). Agentes caotrópicos adecuados incluyen cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, tiocianato de sodio, tetracloroacetato de litio, perclorato de sodio, tetracloroacetato de rubidio, yoduro de potasio y trifluoroacetato de cesio, entre otros. Normalmente, el agente caotrópico estará presente a una concentración final de aproximadamente 3 M. Si se desea, puede añadirse formamida a la mezcla de hibridación, normalmente 30-50 % (v/v).
Pueden emplearse diversas disoluciones de hibridación. Normalmente, éstas comprenden de aproximadamente el 20 al 60 % en volumen, preferentemente 30 %, de un disolvente orgánico polar. Una disolución de hibridación común emplea aproximadamente 30-50 % en v/v de formamida, cloruro sódico aproximadamente 0,15 a 1 M, tampones aproximadamente 0,05 a 0,1 M, tales como citrato de sodio, Tris-HCl, PIPES o HEPES (intervalo de pH aproximadamente 6-9), aproximadamente 0,05 al 0,2 % de detergente, tal como dodecilsulfato de sodio, o EDTA entre 0,5-20 mM, FICOLL (Pharmacia Inc.) (aproximadamente 300-500 kilodalton (kD)), polivinilpirrolidona (aproximadamente 250-500 kD) y albúmina de suero. También se incluirán en la disolución de hibridación ácidos nucleicos de vehículo sin marcar típicos de aproximadamente 0,1 a 5 mg/ml, ADN nucleico fragmentado, por ejemplo, ADN de timo bovino o de esperma de salmón, o ARN de levadura, y opcionalmente de aproximadamente el 0,5 al 2 % en peso/vol. de glicina. También pueden incluirse otros aditivos, tales como agentes de exclusión del volumen que incluyen una variedad de agentes solubles en agua o hinchables polares tales como polietilenglicol, polímeros aniónicos tales como poliacrilato o polimetilacrilato, y polímeros sacáricos aniónicos tales como sulfato de dextrano.
La hibridación de ácidos nucleicos es adaptable a una variedad de formatos de ensayo. Uno de los más adecuados es el formato de ensayo de sándwich. El ensayo de sándwich es particularmente adaptable a hibridación bajo condiciones no desnaturalizantes. Un componente primario de un ensayo tipo sándwich es un soporte sólido. El soporte sólido tiene adsorbido a él o acoplado covalentemente a él sonda de ácido nucleico inmovilizada que está sin marcar y es complementaria a una porción de la secuencia.
Además, como están apareciendo rápidamente secuencias de genomas microbianos disponibles para el público, pueden identificarse homólogos usando solo enfoques de bioinformática.
Un experto en la materia puede evaluar fácilmente la actividad de butanodiol deshidratasa de una proteína codificada por una molécula de ADN identificada por metodologías basadas en secuencia descritas anteriormente. La proteína se expresa en una célula huésped microbiana como se describe más adelante y se realiza un ensayo de actividad de butanodiol deshidratasa en medio de cultivo, extractos celulares, preparaciones de enzima en bruto o preparaciones de enzima purificada. Por ejemplo, se añade meso-2,3-butanodiol al medio de cultivo y después de aproximadamente 24 horas de cultivo del huésped de expresión, la 2-butanona se detecta en el medio de cultivo por HPLC si la actividad está presente. Mediante este u otros ensayos fácilmente realizables, la función de la butanodiol deshidratasa está ligada a la estructura de una proteína codificada por una molécula de ADN identificada por una metodología basada en secuencias.
El experto apreciará que los polipéptidos que tienen actividad de butanodiol deshidratasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencias. Como se observa anteriormente, se han descrito en la bibliografía una variedad de diol y glicerol deshidratasas y serán adecuadas para su uso en la presente invención. Por consiguiente, en un aspecto de la invención preferido, las enzimas diol y glicerol deshidratasa dependientes de B12 son aquellas que tienen al menos el 80 % - 85 % de identidad con enzimas que tienen las subunidades grandes, medianas y pequeñas, respectivamente, de las secuencias enumeradas a continuación:
a) SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 12;
b) SEC ID Nº: 93, SEC ID Nº: 95 y SEC ID Nº: 97;
c) SEC ID Nº: 99, SEC ID Nº: 101 y SEC ID Nº: 103;
d) SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 107 y SEC ID Nº: 109;
e) SEC ID Nº: 135, SEC ID Nº: 136 y SEC ID Nº: 137;
f) SEC ID Nº: 138, SEC ID Nº: 139 y SEC ID Nº: 140;
g) SEC ID Nº: 146, SEC ID Nº: 148 y SEC ID Nº: 150;
h) SEC ID Nº: 141, SEC ID Nº: 142 y SEC ID Nº: 143; y
i) SEC ID Nº: 164, SEC ID Nº: 165 y SEC ID Nº: 166,
en las que al menos el 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
Enzimas diol y glicerol deshidratasa similarmente preferidas son aquellas que tienen al menos el 80 % - 85 % de identidad con enzimas que tienen las subunidades grandes, medianas y pequeñas, respectivamente, de las secuencias enumeradas a continuación: Subunidad grande: SEC ID Nº: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164; subunidad mediana: SEC ID Nº: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; subunidad pequeña: SEC ID Nº: 12, 103, 109, 137, 140,143, 150 y 166; en las que al menos el 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en las que al menos el 95 % de identidad, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, es el más preferido.
Enzimas diol y glicerol deshidratasa adicionales que pueden usarse en la ruta biosintética 3 de la presente invención se identificaron mediante un análisis bioinformático de estructura/función que se describe más adelante y en el Ejemplo 18.
(f) 2-butanona en 2-butanol:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
Diol y glicerol deshidratasas para la ruta biosintética 3
Cualquier enzima que sea una diol o glicerol deshidratasa puede usarse en la presente invención para la conversión de 2,3-butanodiol en 2-butanona. Se estableció una relación estructura/función para diol y glicerol deshidratasas en las clases de enzima EC 4.2.128 y EC 4.2.130, respectivamente, en el presente documento en el Ejemplo 18. La función se proporciona por datos experimentales y la estructura se proporciona por análisis bioinformático. Se analizaron ocho enzimas diol y glicerol deshidratasa con actividades que se han demostrado experimentalmente. En este grupo (enumerado en la Tabla 10) se mostró que las enzimas diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca y glicerol
deshidratasa de Klebsiella pneumoniae convirtieron 2,3-butanodiol en 2-butanona (Bachovchin y col. (1977) Biochemistry 16:1082-1092 y Ejemplo 17 en el presente documento, respectivamente), mientras que las actividades de las seis enzimas adicionales se demostraron usando sus sustratos naturales (referencias facilitadas en la Tabla 10). Este conjunto de ocho diol y glicerol deshidratasas se analizó usando el algoritmo hmmsearch del paquete de software HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA). El parámetro Z del algoritmo hmmsearch se fijó a 1 billón. La salida del análisis de HMMER usando un conjunto de secuencias de proteínas es un perfil de modelo oculto de Markov (perfil HMM). La teoría tras los perfiles HMM se describe en Durbin y col., Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh y col., 1994; J. Mol. Biol. 235:1501-1531) que caracteriza el conjunto de proteínas basado en la probabilidad de que cada aminoácido se produzca en cada posición en el alineamiento de las proteínas del conjunto.
Como las ocho diol y glicerol deshidratasas (diol/glicerol deshidratasas) con función experimentalmente verificada que se usaron para el análisis tienen cada una tres subunidades (grande o alfa, mediana o beta y pequeña o gamma), se preparó un perfil HMM separado para cada subunidad. La subunidad grande del perfil HMM (Tabla 12) se construyó usando proteínas con SEC ID Nº: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164 que se describen en las Tablas 1 y 2. La subunidad mediana del perfil HMM (Tabla 13) se construyó usando proteínas con SEC ID Nº: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165 que se describen en las Tablas 1 y 2. La subunidad pequeña del perfil HMM (Tabla 14) se construyó usando proteínas con SEC ID Nº: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166 que se describen en las Tablas 1 y 2. Referencias que proporcionan los datos del ensayo funcional se facilitan en la Tabla 10. El perfil HMM preparado para la subunidad grande da una caracterización estructural para la subunidad grande funcional de diol/glicerol deshidratasas. Similarmente, los perfiles HMM para las subunidades medianas y pequeñas dan caracterizaciones estructurales para las subunidades medianas y pequeñas funcionales, respectivamente, de diol/glicerol deshidratasas. Por tanto, cualquier proteína que tenga una coincidencia significativa con tanto la subunidad grande, mediana como pequeña del perfil HMM se liga directamente a la función de la subunidad para la que se preparó el perfil. Para ser significativa, la coincidencia tiene un valor de E de 0,01 o menos, y el uso adicional de “coincidencia” se entiende que es con este criterio de valor de E. Así, subunidades de diol/glicerol deshidratasa que pueden usarse en la presente invención son proteínas que coinciden con los perfiles HMM, que se prepararon usando las proteínas con SEC ID Nº enumeradas anteriormente, con un valor de E de 0,01 o menos.
Las proteínas que son de longitud completa y tienen enlace funcional con la subunidad grande de diol/glicerol deshidratasas, mediante coincidencia con la subunidad grande del perfil HMM, incluyen, pero no se limitan a, proteínas con SEC ID Nº: 93, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259. Las proteínas que son de longitud completa y tienen enlace funcional con la subunidad mediana de diol/glicerol deshidratasas, mediante coincidencia con la subunidad mediana del perfil HMM, incluyen, pero no se limitan a, proteínas con SEC ID Nº: 95, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167. Las proteínas que son de longitud completa y tienen enlace funcional con la subunidad pequeña de diol/glicerol deshidratasas, mediante coincidencia con la subunidad pequeña del perfil HMM, incluyen pero no se limitan a, proteínas con SEC ID Nº: 97, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274. Además, las proteínas que son subunidades grandes y medianas de longitud completa fusionadas que tienen enlace funcional con las subunidades grandes y medianas de diol/glicerol deshidratasas, mediante coincidencia con la subunidad grande y mediana de los perfiles HMM incluyen, pero no se limitan a, proteínas con SEC ID Nº: 233, 235, 237, 239, 241, 246 y 247.
Como los perfiles HMM descritos anteriormente proporcionan una relación estructura/función para diol/glicerol deshidratasas, las proteínas recientemente identificadas que coinciden con estos perfiles también pueden usarse en la presente invención. Además, las secuencias de proteínas de las subunidades de diol/glicerol deshidratasa que pueden usarse en la presente invención incluyen proteínas con cambios de aminoácidos que tienen efectos mínimos sobre la función de la subunidad, que son sustancialmente similares a las secuencias de las SEC ID Nº enumeradas anteriormente. Es muy conocido en la técnica que la sustitución de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado que no tiene efecto en las propiedades funcionales de la proteína codificada sea común. Para los fines de la presente invención, sustituciones que proporcionan proteínas sustancialmente similares se definen como intercambios dentro de uno de los cinco siguientes grupos:
1.
Residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);
2.
Residuos polares negativamente cargados y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln;
3.
Residuos polares positivamente cargados: His, Arg, Lys;
4.
Residuos alifáticos grandes no polares: Met, Leu, Ile, Val (Cys); y
5.
Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.
Así, puede esperarse que las sustituciones de un aminoácido con otro en estos grupos produzcan una proteína funcionalmente equivalente. En muchos casos, tampoco se esperaría que los cambios que producen la alteración de
las porciones del extremo N y extremo C de la proteína alteraran la actividad de la proteína.
Proteínas sustancialmente similares a aquellas de SEC ID que coinciden con los perfiles HMM pueden ser el 90 % o 95 % idénticas en secuencia de aminoácidos a una de las proteínas coincidentes, y esto puede usarse en la presente invención.
Un experto en la materia puede identificar fácilmente un conjunto de tres subunidades que pueden usarse juntas para proporcionar una diol/glicerol deshidratasa funcional. Es particularmente adecuada una combinación de una subunidad grande, mediana y pequeña de la misma cepa de organismo, cuyas regiones codificantes están localizadas próximas entre sí en el genoma. Sería más probable que estas subunidades formaran una diol o glicerol deshidratasa natural. Muchas subunidades grandes, medianas y pequeñas se agrupan de este modo en la Tabla 2. Una combinación de subunidades de cepas o especies estrechamente relacionadas es adecuada para componer una diol deshidratasa o una glicerol deshidratasa. Puede usarse cualquier combinación de subunidades que catalice la conversión de 2,3-butanodiol en 2-butanona. Combinaciones de subunidades eficaces pueden determinarse fácilmente por un experto en la materia mediante comparaciones y/o ensayos funcionales de secuencias de aminoácidos.
Por consiguiente, la invención proporciona diol y glicerol deshidratasa, enzimas que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden subunidades grandes, medianas y pequeñas de longitud completa que cada una dan un parámetro de valor de E de 0,01 o menos cuando se consultan usando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las subunidades grandes de SEC ID Nº: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164; las subunidades medianas de SEC ID Nº: 10, 101, 107, 136,139, 142, 148 y 165; y las subunidades pequeñas de SEC ID Nº: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166; siendo cada consulta llevada a cabo usando el algoritmo hmmsearch en el que el parámetro Z está fijado a 1 billón. Alternativamente, la invención proporciona enzimas diol y glicerol deshidratasa que tienen secuencias de aminoácidos identificadas mediante un procedimiento que comprende a) generar un perfil de modelo oculto de Markov a partir del alineamiento de las secuencias de aminoácidos correspondientes a las subunidades grandes, medianas y pequeñas de enzimas diol y glicerol deshidratasa en el que;
i) la subunidad grande comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164;
ii) la subunidad mediana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y
iii) la subunidad pequeña comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166;
b) consultar al menos una base de datos pública de secuencias de proteínas que contiene secuencias de diol y glicerol deshidratasas con el perfil de modelo oculto de Markov de (a) usando el algoritmo hmmsearch en la que el parámetro Z esté fijado a 1 billón y el valor del parámetro E esté fijado a 0,01, para identificar un primer conjunto de datos de secuencias de aminoácidos de diol y glicerol deshidratasa; y
c) eliminar cualquier secuencia parcial del primer conjunto de datos de (b) para generar un segundo conjunto de datos de secuencias de aminoácidos de diol y glicerol deshidratasa, en el que se identifican las enzimas diol deshidratasa y glicerol deshidratasa.
Con respecto a las subunidades grandes de las diol y glicerol deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad grande que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
Con respecto a las subunidades medianas de las diol y glicerol deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad mediana que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 10, 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
Con respecto a las subunidades pequeñas de las diol y glicerol deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad mediana que comprende una subunidad pequeña que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por
defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
Alternativamente, la diol deshidratasa o glicerol deshidratasa puede comprender subunidades grandes, medianas y pequeñas fusionadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 233, 235, 237, 239, 241, 246 y 247, basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
Alternativamente, las enzimas diol deshidratasa o glicerol deshidratasa pueden comprender subunidades grandes, medianas y pequeñas fusionadas y tener al menos el 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos que comprende las tres secuencias de aminoácidos que codifican subunidades grandes, medianas y pequeñas, seleccionadas del grupo que consiste en:
a) SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 12;
b) SEC ID Nº: 93, SEC ID Nº: 95 y SEC ID Nº: 97;
c) SEC ID Nº: 99, SEC ID Nº: 101 y SEC ID Nº: 103;
d) SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 107 y SEC ID Nº: 109;
e) SEC ID Nº: 135, SEC ID Nº: 136 y SEC ID Nº: 137;
f) SEC ID Nº: 138, SEC ID Nº: 139 y SEC ID Nº: 140;
g) SEC ID Nº: 146,SEC ID Nº: 148 y SEC ID Nº: 150;
h) SEC ID Nº: 141, SEC ID Nº: 142 y SEC ID Nº: 143; y
i) SEC ID Nº: 164, SEC ID Nº: 165 y SEC ID Nº: 166;
basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
Ruta 4:
(a)
piruvato en alfa-acetolactato:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
(k)
alfa-acetolactato en ácido 2,3-dihidroxi-2-metilbutanoico:
La conversión de sustrato en producto de acetolactato (I) en ácido 2,3-dihidroxi-2-metilbutanoico (IX) no se conoce en la técnica. Sin embargo, el producto de esta conversión se ha informado como un componente de caldos de fermentación (Ziadi y col. (1973) Comptes Rendus des Seances de l'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles 276:965-8), pero el mecanismo de formación es desconocido. El mecanismo de formación probable es la reducción de acetolactato con NADH o NADPH como donante de electrones. Para utilizar esta ruta para la producción de 2-butanol necesita identificarse o manipularse una enzima que catalice esta reacción. Sin embargo, el precedente para la reducción enzimática de cetonas a alcoholes está bien establecido.
(I)
ácido 2,3-dihidroxi-2-metilbutanoico en ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico:
No se conocen enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto de ácido 2,3-dihidroxi-2-metilbutanoico
(IX)
en ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico (X). Sin embargo, hay un gran número de cinasas en la naturaleza que poseen especificidad variable. Por tanto, es probable que una enzima pueda aislarse o manipularse con esta actividad.
(m)
ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico en 2-butanona:
No se conocen enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto de ácido 2-hidroxi-2-metil-3fosfobutanoico (X) en 2-butanona (V). La combinación de esta reacción con la previa es muy similar a la reacción de múltiples etapas catalizada por mevalonato-5-pirofosfato (M5PP) descarboxilasa, que consiste en la fosforilación inicial de M5PP a 3-fosfomevalonato-5-PP, seguido de la eliminación dependiente de la descarboxilación de fosfato (Alvear y col. (1982) Biochemistry 21:4646-4650).
(f) 2-butanona en 2-butanol:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se ha descrito anteriormente para la ruta 1.
Así, al proporcionar múltiples rutas recombinantes a partir de piruvato en 2-butanol, existen varias elecciones para cumplir las etapas de conversión individuales, y el experto en la materia podrá utilizar secuencias públicamente disponibles y secuencias desveladas en el presente documento para construir las rutas relevantes. Un listado de un número representativo de genes conocidos en la técnica y útiles en la construcción de rutas biosintéticas de 2butanol se facilita anteriormente en las Tablas 1 y 2.
Huéspedes microbianos para la producción de 2-butanol y 2-butanona
Huéspedes microbianos para la producción de 2-butanol o 2-butanona pueden seleccionarse de bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levaduras. El huésped microbiano usado para la producción de 2-butanol o 2butanona debe ser tolerante al producto producido, de manera que el rendimiento no esté limitado por la toxicidad del producto al huésped. La selección de un huésped microbiano para la producción de 2-butanol se describe en detalle a continuación. Los mismos criterios se aplican a la selección de un huésped para la producción de 2butanona.
Los microbios que son metabólicamente activos a niveles de altos títulos de 2-butanol no son muy conocidos en la técnica. Aunque se han aislado mutantes tolerantes a butanol de Clostridia solventogénicos, está disponible poca información referente a la tolerancia al butanol de otras cepas bacterianas posiblemente útiles. La mayoría de los estudios sobre la comparación de tolerancia al alcohol en bacterias sugieren que el butanol es más tóxico que el etanol (de Cavalho y col., Microsc. Res. Tech. 64:215-22 (2004) y Kabelitz y col., FEMS Microbiol. Lett. 220:223-227 (2003)). Tomas y col. (J. Bacteriol. 186:2006-2018 (2004)) informan de que el rendimiento de 1-butanol durante la fermentación en Clostridium acetobutylicum puede limitarse por toxicidad al butanol. El efecto primario del 1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la alteración de las funciones de la membrana (Hermann y col., Appl. Environ. Microbiol. 50:1238-1243 (1985)).
Los huéspedes microbianos seleccionados para la producción de 2-butanol deben ser tolerantes a 2-butanol y deben poder convertir los hidratos de carbono en 2-butanol usando la ruta biosintética introducida. Los criterios para la selección de huéspedes microbianos adecuados incluyen los siguientes: tolerancia intrínseca a 2-butanol, alta tasa de utilización de hidratos de carbono, disponibilidad de herramientas genéticas para la manipulación de genes y la capacidad para generar alteraciones cromosómicas estables.
Pueden identificarse cepas huésped adecuadas con una tolerancia para 2-butanol por cribado basado en la tolerancia intrínseca de la cepa. La tolerancia intrínseca de microbios a 2-butanol puede medirse determinando la concentración de 2-butanol que es responsable del 50 % de inhibición de la tasa de crecimiento (CI50) cuando se cultivan en un medio mínimo. Los valores de CI50 pueden determinarse usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los microbios de interés pueden cultivarse en presencia de diversas cantidades de 2-butanol y monitorizarse la tasa de crecimiento midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros. El tiempo de duplicación puede calcularse a partir de la parte logarítmica de la curva de crecimiento y usarse como una medida de la tasa de crecimiento. La concentración de 2-butanol que produce el 50 % de inhibición del crecimiento puede determinarse a partir de una gráfica del porcentaje de inhibición del crecimiento frente a la concentración de 2-butanol. Preferentemente, la cepa huésped debe tener una CI50 para 2-butanol superior a aproximadamente 0,5 %. Es más adecuada una cepa huésped con una CI50 para 2-butanol que es superior a aproximadamente el 1,5 %. Es particularmente adecuada una cepa huésped con una CI50 para 2-butanol que es superior a aproximadamente el 2,5 %.
El huésped microbiano para la producción de 2-butanol debe también utilizar glucosa y/u otros hidratos de carbono a una mayor tasa. La mayoría de los microbios pueden utilizar hidratos de carbono. Sin embargo, ciertos microbios medioambientales no puede usar eficazmente hidratos de carbono y, por tanto, no serían huéspedes adecuados.
La capacidad para modificar genéticamente el huésped es esencial para la producción de cualquier microorganismo recombinante. Los modos de la tecnología de transferencia génica que pueden usarse incluyen por electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Está disponible un amplia gama de plásmidos conjugativos del huésped y marcadores de resistencia a fármacos. Los vectores de clonación usados con un organismo se adaptan al organismo huésped basándose en la naturaleza de marcadores de resistencia a antibióticos que pueden funcionar en ese huésped.
El huésped microbiano también puede manipularse con el fin de inactivar rutas de competencia para el flujo de carbono inactivando diversos genes. Esto requiere la disponibilidad de tanto transposones como vectores de integración cromosómica para dirigir la inactivación. Adicionalmente, los huéspedes de producción que están dispuestos para mutagénesis química pueden experimentar mejoras en la tolerancia intrínseca al 2-butanol mediante mutagénesis química y selección de mutantes.
Basándose en los criterios descritos anteriormente, huéspedes microbianos adecuados para la producción de 2butanol y 2-butanona incluyen, pero no se limitan a, miembros de los géneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia,
Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyces y Saccharomyces. Huéspedes preferidos incluyen: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Bacillus subtilis, Kluyveromyces lactis y Saccharomyces cerevisiae.
Construcción de huésped de producción
Pueden construirse organismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codifican la ruta enzimática para la conversión de un sustrato de carbono fermentable en 2-butanol o 2-butanona usando técnicas muy conocidas en la técnica. En la presente invención, los genes que codifican las enzimas de la ruta biosintética 3 de 2butanol: acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa, butanodiol deshidratasa y butanol deshidrogenasa; o la ruta biosintética 3 de 2-butanona que omiten la butanol deshidrogenasa, pueden aislarse de diversas fuentes, como se ha descrito anteriormente.
Procedimientos de obtención de genes deseados a partir de un genoma bacteriano son comunes y muy conocidos en la técnica de la biología molecular. Por ejemplo, si la secuencia del gen es conocida, pueden diseñarse cebadores y amplificarse la secuencia deseada usando procedimientos de amplificación dirigida a cebadores convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (patente de EE.UU. nº 4.683.202) para obtener cantidades de ADN adecuadas para la clonación en vectores de expresión. Si va a aislarse un gen que es heterólogo para una secuencia conocida, pueden crearse bibliotecas genómicas adecuadas por digestión con endonucleasa de restricción y pueden cribarse con sondas que tienen secuencia complementaria a la secuencia de genes deseada. Una vez se aísla la secuencia, el ADN puede amplificarse usando procedimientos de amplificación dirigida a cebadores convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (documento U.S. 4.683.202) para obtener cantidades de ADN adecuadas para la clonación en vectores de expresión, que luego se transforman en células huésped apropiadas.
Además, dada la secuencia de aminoácidos de una proteína con actividad enzimática deseada, la secuencia codificante puede determinarse por traducción inversa de la secuencia de proteínas. Un fragmento de ADN que contiene la secuencia codificante puede prepararse sintéticamente y clonarse en un vector de expresión, luego transformarse en la célula huésped deseada.
En la preparación de un fragmento de ADN sintético que contiene una secuencia codificante, esta secuencia puede optimizarse para la expresión en la célula huésped diana. Están fácilmente disponibles herramientas para la optimización de codones para la expresión en un huésped heterólogo. Están disponibles algunas herramientas para la optimización de codones basándose en el contenido de GC del organismo huésped. Los contenidos de GC de algunos huéspedes microbianos a modo de ejemplo se facilitan en la Tabla 3.
Tabla 3
Contenidos de GC de huéspedes microbianos
Cepa
% de GC
B. licheniformis
46
B. subtilis
42
C. acetobutylicum
37
E. coli
50
P. putida
61
A. eutrophus
61
Paenibacillus macerans
51
Rhodococcus erythropolis
62
Brevibacillus
50
Paenibacillus polymyxa
50
Una vez se identifican y aíslan los genes de la ruta relevante, pueden transformarse en huéspedes de expresión adecuados por medios muy conocidos en la técnica. Vectores útiles para la transformación de una variedad de células huésped son comunes y están comercialmente disponibles de empresas tales como EPICENTRE® (Madison, WI), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), Stratagene (La Jolla, CA) y New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Normalmente, el vector contiene un marcador de selección y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica en el huésped deseado. Además, vectores adecuados comprenden una región promotora
que aloja controles de iniciación de la transcripción y una región de control de terminación de la transcripción, entre los cuales puede insertarse un fragmento de ADN de la región codificante, para proporcionar expresión de la región codificante insertada. Ambas regiones de control pueden derivarse de genes homólogos a la célula huésped transformada, aunque debe entenderse que tales regiones de control también pueden derivarse de genes que son no nativos para las especies específicas elegidas como huésped de producción.
Las regiones de control de la iniciación o promotores, que son útiles para accionar la expresión de las regiones codificantes de la ruta relevante en la célula huésped deseada, son numerosas y familiares para aquellos expertos en la materia. Prácticamente cualquier promotor que pueda accionar estos elementos genéticos es adecuado para la presente invención que incluyen, pero no se limitan a, promotores derivados de los siguientes genes: CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD y GPM (útiles para la expresión en Saccharomyces); AOX1 (útiles para la expresión en Pichia); además de los promotores lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli, Alcaligenes y Pseudomonas); los promotores amy, apr y npr, y diversos promotores de fago útiles para la expresión en Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Paenibacillus macerans; nisA (útiles para la expresión de bacterias Gram-positivas, Eichenbaum y col., Appl. Environ. Microbiol. 64(8):2763-2769 (1998)); y el promotor P11 sintético (útil para la expresión en Lactobacillus plantarum, Rud y col., Microbiology 152:1011-1019 (2006)).
Las regiones de control de la terminación también pueden derivarse de diversos genes nativos para los huéspedes preferidos. Opcionalmente, un sitio de terminación puede ser innecesario, sin embargo, es el más preferido si se incluye.
Ciertos vectores pueden replicarse en una amplia variedad de bacterias huésped y pueden transferirse por conjugación. Están disponibles la secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados: pRK437, pRK442 y pRK442(H). Estos derivados han demostrado ser valiosas herramientas para la manipulación genética en bacterias Gram-negativas (Scott y col., Plasmid 50(1):74-79 (2003)). También están disponibles varios derivados de plásmido del plásmido Inc P4 de amplio espectro de huésped RSF1010 con promotores que pueden funcionar en una variedad de bacterias Gram-negativas. El plásmido pAYC36 y pAYC37 tienen promotores activos, junto con sitios de clonación múltiple para permitir la expresión génica heteróloga en bacterias Gram-negativas.
También están ampliamente disponibles herramientas de sustitución génica cromosómica. Por ejemplo, se ha modificado una variante termosensible del replicón de amplio espectro de huésped pWV101 para construir un plásmido pVE6002 que puede usarse para efectuar la sustitución génica en un intervalo de bacterias Gram-positivas (Maguin y col., J. Bacteriol. 174(17):5633-5638 (1992)). Adicionalmente están disponibles transposomas in vitro de fuentes comerciales tales como EPICENTRE® para crear mutaciones aleatorias en una variedad de genomas.
La expresión de una ruta biosintética del 2-butanol en diversos huéspedes microbianos preferidos se describe más abajo en más detalle. Para la expresión de una ruta biosintética de la 2-butanona se aplica la misma descripción, pero se omite la conversión final de sustrato en producto de 2-butanona en 2-butanol.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en E. coli
Vectores útiles para la transformación de E. coli son comunes y están comercialmente disponibles de las empresas enumeradas anteriormente. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética del 2-butanol pueden aislarse de diversas fuentes, como se ha descrito anteriormente, clonarse sobre un vector pUC19 modificado y transformarse en NM522 de E. coli, como se describe en los Ejemplos 6 y 7. Alternativamente, los genes que codifican una ruta biosintética del 2-butanol pueden dividirse en múltiples operones, clonarse sobre vectores de expresión y transformarse en diversas cepas de E. coli, como se describe en los Ejemplos 9, 10 y 11. La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Rhodococcus erythropolis
Están disponibles una serie de vectores lanzadera de E. coli-Rhodococcus para la expresión en R. erythropolis, que incluyen, pero no se limitan a pRhBR17 y pDA71 (Kostichka y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 62:61-68 (2003)). Adicionalmente, están disponibles una serie de promotores para la expresión génica heteróloga en R. erythropolis (véase, por ejemplo, Nakashima y col., Appl. Environ. Microbiol. 70:5557-5568 (2004), y Tao y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, DOI 10, 1007/s00253-005-0064). Pueden crearse alteraciones génicas dirigidas en genes cromosómicos de R. erythropolis usando los procedimientos descritos por Tao y col., arriba, y Brans y col. (Appl. Envion. Microbiol. 66: 2029-2036 (2000)).
Los genes heterólogos requeridos para la producción de 2-butanol, como se han descrito anteriormente, pueden clonarse inicialmente en pDA71 o pRhBR71 y transformarse en E. coli. Los vectores pueden entonces transformarse en R. erythropolis por electroporación, como se describe por Kostichka y col., arriba. Los recombinantes pueden cultivarse en medio sintético que contiene glucosa y la producción de 2-butanol puede seguirse usando procedimientos de fermentación conocidos en la técnica. La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en B. subtilis
Procedimientos para la expresión génica y creación de mutaciones en B. subtilis también son muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética del 2-butanol pueden aislarse de diversas fuentes, como se ha descrito anteriormente, clonarse en un vector lanzadera de E. coli-Bacillus modificado y transformarse en BE1010 de Bacillus subtilis, como se describe en el Ejemplo 8. Los genes deseados pueden clonarse en un vector de expresión de Bacillus y transformarse en una cepa para preparar un huésped de producción. Alternativamente, los genes pueden integrarse en el cromosoma de Bacillus usando replicones condicionales o vectores suicidas que son conocidos para un experto en la materia. Por ejemplo, el Bacillus Genetic Stock Center tiene numerosos vectores de integración. La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en B. licheniformis
La mayoría de los plásmidos y vectores lanzadera que se replican en B. subtilis pueden usarse para transformar B. licheniformis por tanto transformación como electroporación de protoplastos. Los genes requeridos para la producción de 2-butanol pueden clonarse en derivados de los plásmidos pBE20 o pBE60 (Nagarajan y col., Gene 114:121-126 (1992)). Los procedimientos para transformar B. licheniformis se conocen en la técnica (por ejemplo, véase Fleming y col., Appl. Environ: Microbiol., 61(11):3775-3780 (1995)). Los plásmidos construidos para la expresión en B. subtilis pueden transformarse en B. licheniformis para producir un huésped microbiano recombinante que produce 2-butanol. La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Paenibacillus macerans
Pueden construirse plásmidos como se ha descrito anteriormente para la expresión en B. subtilis y usarse para transformar Paenibacillus macerans por transformación de protoplastos para producir un huésped microbiano recombinante que produce 2-butanol. La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de 2-butanona en Alcaligenes (Ralstonia) eutrophus
Se conocen en la técnica procedimientos para la expresión génica y creación de mutaciones en Alcaligenes eutrophus (véase, por ejemplo, Taghavi y col., Appl. Environ. Microbiol., 60(10):3585-3591 (1994)). Los genes para una ruta biosintética del 2-butanol pueden clonarse en cualquiera de los vectores de amplio espectro de huésped descritos anteriormente, y electroporarse en Alcaligenes eutrophus para generar recombinantes que producen 2butanol. Se ha descrito en detalle la ruta de poli(hidroxibutirato) en Alcaligenes, se conocen una variedad de técnicas genéticas para modificar el genoma de Alcaligenes eutrophus, y aquellas herramientas pueden aplicarse para manipular por ingeniería una ruta biosintética del 2-butanol. La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Pseudomonas putida
Se conocen en la técnica procedimientos para la expresión génica en Pseudomonas putida (véase, por ejemplo, Ben-Bassat y col., patente de EE.UU. nº 6.586.229). Los genes de una ruta biosintética del 2-butanol pueden insertarse en pPCU18, y este ADN ligado puede electroporarse en células DOT-T1 C5aAR1 de Pseudomonas putida electrocompetentes para generar recombinantes que producen 2-butanol. La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Lactobacillus plantarum
El género Lactobacillus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores usados en la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus pueden usarse para Lactobacillus. Ejemplos no limitantes de vectores adecuados incluyen pAMβ1 y derivados de los mismos (Renault y col., Gene 183:175-182 (1996); y O'Sullivan y col., Gene 137:227-231 (1993)); pMBB1 y pHW800, un derivado de pMBB1 (Wyckoff y col., Appl. Environ. Microbiol. 62:1481-1486 (1996)); pMG1, un plásmido conjugativo (Tanimoto y col., J. Bacteriol. 184:58005804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem y col., Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto y col., Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001)); y pAT392 (Arthur y col., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994)). También se ha informado de varios plásmidos de Lactobacillus plantarum (van Kranenburg y col., Appl. Environ. Microbiol. 71(3):1223-1230 (2005)).
Los diversos genes para una ruta biosintética del 2-butanol pueden ensamblarse en cualquier vector adecuado, tal como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden optimizarse para la expresión basándose en el índice de codones deducido de las secuencias de genoma de Lactobacillus plantarum o Lactobacillus arizonensis. Los plásmidos pueden introducirse en la célula huésped usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como electroporación (Cruz-Rodz y col., Molecular Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990), Bringel y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 664-670 (1990), Alegre y col., FEMS Microbiology letters 241:73-77 (2004)) y conjugación (Shrago y col., Appl. Environ. Microbiol. 52:574-576 (1986)). Los genes de la ruta biosintética del 2-butanol también pueden integrarse en el cromosoma de Lactobacillus usando vectores de integración (Hols y col., Appl. Environ. Microbiol. 60:1401-1403 (1990), Jang y col., Micro. Lett. 24:191-195 (2003)). La ruta de biosíntesis de la 2-butanona
puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium y Enterococcus faecalis
El género Enterococcus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores usados en la transformación de Lactobacillus, Bacillus subtilis y Streptococcus, descritos anteriormente, pueden usarse para Enterococcus. También pueden usarse los vectores de expresión para E. faecalis que usan el gen nisA de Lactococcus (Eichenbaum y col., Appl. Environ. Microbiol. 64:2763-2769 (1998). Adicionalmente, pueden usarse vectores para la sustitución génica en el cromosoma de E. faecium (Nallaapareddy y col., Appl. Environ. Microbiol. 72:334-345 (2006)).
Los diversos genes para una ruta biosintética del 2-butanol pueden ensamblarse en cualquier vector adecuado, tal como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden optimizarse para la expresión basándose en el índice de codones deducido de las secuencias del genoma de Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium. Los plásmidos pueden introducirse en la célula huésped usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como electroporación, como se describe por Cruz-Rodz y col. (Molecular Genetics y Genomics 224:1252-154 (1990)) o conjugación, como se describe por Tanimoto y col. (J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)) y Grohamann y col. (Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:277-301 (2003)). La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Pediococcus pentosaceus y Pediococcus acidilactici
El género Pediococcus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores usados en la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus, descritos anteriormente, pueden usarse para Pediococcus. Un ejemplo no limitante de un vector adecuado es pHPS9 (Bukhtiyarova y col., Appl. Environ. Microbiol. 60:3405-3408 (1994)). También se ha informado de varios plásmidos de Pediococcus (Alegre y col., FEMS Microbiol. Lett. 250:151-156 (2005); Shareck y col., Crit. Rev Biotechnol. 24:155-208 (2004)).
Los genes para una ruta biosintética del 2-butanol pueden ensamblarse en cualquier vector adecuado, tal como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden optimizarse para la expresión basándose en el índice de codones deducido de la secuencia del genoma de Pediococcus pentosaceus. Los plásmidos pueden introducirse en la célula huésped usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como electroporación (véase, por ejemplo, Osmanagaoglu y col., J. Basic Microbiol. 40:233-241 (2000); Alegre y col., FEMS Microbiol. Lett. 250:151-156 (2005)) y conjugación (Gonzalez y Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)). Los genes de la ruta biosintética del 2-butanol también pueden integrarse en el cromosoma de Pediococcus usando vectores de integración (Davidson y col., Antonie van Leeuwenhoek 70:161-183 (1996)). La ruta de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse similarmente, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Medios de fermentación
Los medios de fermentación en la presente invención deben contener sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa, o mezclas de los mismos, y mezclas sin purificar de materias primas renovables tales como permeado de suero del queso, licor de maceración del maíz, melazas de remolacha azucarera y malta de cebada. Adicionalmente, el sustrato de carbono también puede ser sustratos de un carbono tales como dióxido de carbono, o metanol para el que se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos clave. Además de uno y dos sustratos de carbono, también se conocen organismos metilotróficos que utilizan varios otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, se conocen levaduras metilotróficas que utilizan el carbono de metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion y col., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32, Editor(s): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, RU). Similarmente, diversas especies de Candida metabolizarán alanina o ácido oleico (Sulter y col., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). Por tanto, se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención pueda englobar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y solo se limitará por la elección de organismo.
Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono anteriormente mencionados y mezclas de los mismos sean adecuados en la presente invención, sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa y sacarosa, además de mezclas de cualquiera de estos azúcares. La sacarosa puede obtenerse de materias primas tales como caña de azúcar, remolachas azucareras, yuca y sorgo dulce. La glucosa y la dextrosa pueden obtenerse mediante sacarificación de materias primas basadas en almidón que incluyen granos tales como maíz, trigo, centeno, cebada y avena.
Además, pueden obtenerse azúcares fermentables de biomasa celulósica y lignocelulósica mediante procedimientos de pretratamiento y sacarificación, como se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE.UU. del mismo solicitante y en tramitación junto con la presente US20070031918A1. Biomasa se refiere a cualquier material
celulósico o lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa, y opcionalmente que comprenden además hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos. La biomasa también puede comprender componentes adicionales tales como proteína y/o lípido. La biomasa puede derivarse de una única fuente, o la biomasa puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa podría comprender una mezcla de mazorcas de maíz y hojas y tallos de maíz, o una mezcla de hierba y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos de bioenergía, residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, lodo de la fabricación del papel, residuos de jardín, residuos de madera y forestales. Ejemplos de la biomasa incluyen, pero no se limitan a, grano de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos tales como cáscaras de maíz, hojas y tallos de maíz, hierbas, trigo, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, césped de pradera, papel residual, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, virutas de madera, serrín, arbustos y matorrales, verduras, frutas, flores y estiércol animal.
Además de una fuente de carbono apropiada, los medios de fermentación deben contener minerales adecuados, sales, cofactores, tampones y otros componentes, conocidos para aquellos expertos en la materia, adecuados para el crecimiento de los cultivos y promoción de una ruta enzimática necesaria para la producción de 2-butanol o de 2butanona.
Condiciones de cultivo
Normalmente, las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 ºC a aproximadamente 40 ºC en un medio apropiado. Medios de crecimiento adecuados en la presente invención son medios comercialmente preparados comunes tales como caldo de Luria Bertani (LB), caldo de dextrosa Sabouraud (SD) o caldo de medio de levadura (YM). También pueden usarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos, y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo particular será conocido por un experto en la materia de la microbiología o ciencia de la fermentación. El uso de agentes conocidos para modular la represión de catabolitos directamente o indirectamente, por ejemplo, adenosina 2':3'-monofosfato cíclico, también puede incorporarse en el medio de fermentación.
Intervalos de pH adecuados para la fermentación están entre pH 5,0 y pH 9,0, en los se prefiere pH 6,0 a pH 8,0 como condición inicial.
Las fermentaciones pueden realizarse bajo condiciones aerobias o anaerobias, prefiriéndose condiciones anaerobias o microaerobias.
Fermentaciones discontinuas y continuas industriales
El presente procedimiento emplea un procedimiento discontinuo de fermentación. Una fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado en el que la composición del medio se fija al principio de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Así, al principio de la fermentación el medio se inocula con el organismo u organismos deseados, y se deja que se produzca la fermentación sin añadir nada al sistema. Normalmente, sin embargo, una fermentación “discontinua” es discontinua con respecto a la adición de fuente de carbono y frecuentemente se hacen intentos por controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas discontinuos, las composiciones de metabolito y biomasa del sistema cambian constantemente hasta que se detiene el tiempo la fermentación. Dentro de los cultivos discontinuos, las células se moderan a través de un periodo de latencia estático a una fase logarítmica de alto crecimiento y finalmente a una fase estacionaria en la que la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria morirán eventualmente. Las células en la fase logarítmica generalmente son responsables de la masa de producción del producto final o producto intermedio.
Una variación del sistema discontinuo convencional es el sistema de alimentación discontinua. Los procedimientos de fermentación de alimentación discontinua también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema discontinuo típico, con la excepción de que el sustrato se añade en incrementos a medida que progresa la fermentación. Los sistemas de alimentación discontinua son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y, si es deseable, limitar cantidades de sustrato en los medios. La medición de la actual concentración de sustrato en sistemas de alimentación discontinua es difícil y, por tanto, se estima basándose en los cambios de factores medibles tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales tales como CO2. Las fermentaciones discontinuas y de alimentación discontinua son comunes y muy conocidas en la técnica, y ejemplos pueden encontrarse en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA., o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992).
Aunque la presente invención se realiza en modo discontinuo, se contempla que el procedimiento sería adaptable a procedimientos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto en el que un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medios acondicionados se saca simultáneamente para procesar. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una alta densidad constante.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el
crecimiento celular o concentración de producto final. Por ejemplo, un procedimiento mantendrá un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o nivel de nitrógeno a una tasa fija y permitirá moderar todos los otros parámetros. En otros sistemas varios, factores que afectan el crecimiento pueden alterarse continuamente mientras que la concentración de células, medida por la turbidez del medio de cultivo, se mantiene constante. Los sistemas continuos luchan por mantener las condiciones de crecimiento en estado estacionario y así la pérdida de células debido a que el medio que se saca debe equilibrarse contra la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Procedimientos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para los procedimientos de fermentación continua, además de técnicas para maximizar la tasa de formación de producto, son muy conocidos en la técnica de la microbiología industrial y una variedad de procedimientos se detalla por Brock, arriba.
Se contempla que la presente invención puede ponerse en práctica usando tanto procedimientos discontinuos, de alimentación discontinua como continuos, y que cualquier modo conocido de fermentación sería adecuado. Adicionalmente, se contempla que las células pueden inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células completas y someterse a condiciones de fermentación para la producción de 2-butanol o de 2-butanona.
Procedimientos para el aislamiento de 2-butanol y de 2-butanona del medio de fermentación
El 2-butanol bioproducido puede aislarse del medio de fermentación usando procedimientos conocidos en la técnica para fermentaciones de ABE (véase, por ejemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:639-648 (1998), Groot y col., Process Biochem. 27:61-75 (1992), y referencias en su interior). Por ejemplo, pueden eliminarse sólidos del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación o similares. Entonces, el 2-butanol puede aislarse del medio de fermentación usando procedimientos tales como destilación, destilación azeotrópica, extracción líquidolíquido, adsorción, arrastre con gas, evaporación en membrana o pervaporación. Estos mismos procedimientos pueden adaptarse para aislar 2-butanona bioproducida del medio de fermentación.
Ejemplos
La presente invención se define adicionalmente en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican una realización preferida de la invención, se facilitan a modo de ilustración solo. De la discusión anterior y estos ejemplos un experto en la materia puede determinar las características esenciales de la presente invención y, sin apartarse del alcance de las mismas, puede hacer diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones.
Procedimientos generales
Técnicas de ADN recombinante y de clonación molecular convencionales descritas en los ejemplos son muy conocidas en la técnica y se describen por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, (1989) (Maniatis) y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) y por Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987).
Materiales y procedimientos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la técnica. Técnicas adecuadas para su uso en los siguientes ejemplos pueden encontrarse como se explica en Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) o por Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989). Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales descritos para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Life Technologies (Rockville, MD) o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), a menos que se especifique de otro modo. Las cepas bacterianas se obtienen de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA), a menos que se indique lo contrario.
Los cebadores de oligonucleótidos descritos en los siguientes ejemplos se facilitan en la Tabla 4. Todos los cebadores de oligonucleótidos se sintetizaron por Sigma-Genosys (Woodlands, TX). Tabla 4 Cebadores de clonación y cribado
Gen
Nombre del cebador Secuencia SEC ID Nº: Descripción
budB
B1 15 budB directo
budB
B2 16 budB inverso
budA
B3 17 budA directo
Los cebadores de oligonucleótidos descritos en los siguientes ejemplos se facilitan en la Tabla 4. Todos los cebadores de oligonucleótidos se sintetizaron por Sigma-Genosys (Woodlands, TX). Tabla 4 Cebadores de clonación y cribado
Gen
Nombre del cebador Secuencia SEC ID Nº: Descripción
budA
B4 18 budA inverso
budC
B5 19 budC directo
budC
B6 TTAGTTAAATACCAT 20 budC inverso
pddA
B7 21 pddABC directo
pddC
B8 22 pddABC inverso
sadh
B9 23 sadh directo
sadh
B10 24 sadh inverso
budA
B11 25 budABC directo
budC
B12 26 budABC inverso
pddA
B13 27 pddABC directo
pddC
B14 28 pddABC inverso
sadh
B15 29 sadh directo
sadh
B16 30 sadh inverso
--
BenF 31 -
--
BenBPR 32 -
budAB
BABC F 33 budAB directo
budAB
BABR 34 budAB inverso
budC
BC Spe F 40 budC directo
budC
BC Xba R 41 budC inverso
pddAB CddrAB
DDo For 44 pddABC-ddrAB directo
pddAB CddrAB
DDo Rev 45 pddABC-ddrAB inverso
Los cebadores de oligonucleótidos descritos en los siguientes ejemplos se facilitan en la Tabla 4. Todos los cebadores de oligonucleótidos se sintetizaron por Sigma-Genosys (Woodlands, TX). Tabla 4 Cebadores de clonación y cribado
Gen
Nombre del cebador Secuencia SEC ID Nº: Descripción
chnA
ChnA F 54 chnA directo
chnA
ChnA R 55 chnA inverso
--
Top ter F1 58 directo
--
Top ter F2 59 directo
--
Bot ter R1 60 inverso
--
Bot ter R2 61 inverso
KA-AT
OT872 127 Operón de aminoalcohol cinasa/liasa directo
KA-AT
OT873 128 Operón de aminoalcohol cinasa/liasa inverso
KA
OT879 129 Aminoalcohol cinasa inversa
AT
OT880 130 Aminoalcohol liasa directa
pBAD. HisB
OT909 131 Añade sitio EcoRI para sustituir sitio Ncol
pBAD. HisB
OT910 132 Añade sitio EcoRI para sustituir sitio Ncol
BudAB
N84seqR3 159 inverso
APT
APTfor 162 APT directo
APT
APTrev 163 APT inverso
Tabla 5
Cebadores de secuenciación
Nombre
Secuencia Específica para el gen SEC ID Nº:
M13 Directo
GTAAAACGACGGCCAGT - 35
M13 Inverso
AACAGCTATGACCATG - 36
N83 SeqF2
GCTGGATTACCAGCTCGACC - 37
Cebadores de secuenciación
Nombre
Secuencia Específica para el gen SEC ID Nº:
N83 SeqF3
CGGACGCATTACCGGCAAAG - 38
N84 Seq R2
GCATCGAGATTATCGGGATG - 65
N84 SeqR4
CGAAGCGAGAGAAGTTATCC - 39
Trc F
TTGACAATTAATCATCCGGC todos 42
Trc R
CTTCTCTCATCCGCCAAAAC todos 43
DDko seq F2
GCATGGCGCGGATTTGACGAAC pddABC-ddrAB 46
DDko seq F5
CATTAAAGAGACCAAGTACGTG pddABC-ddrAB 47
DDko seq F7
ATATCCTGGTGGTGTCGTCGGCGT pddABC-ddrAB 48
DDko seq F9
TCTTTGTCACCAACGCCCTGCG pddABC-ddrAB 49
DDko seq R1
GCCCACCGCGCTCGCCGCCGCG pddABC-ddrAB 50
DDko seq R3
CCCCCAGGATGGCGGCTTCGGC pddABC-ddrAB 51
DDko seq R7
GGGCCGACGGCGATAATCACTT pddABC-ddrAB 52
DDko seq R10
TTCTTCGATCCACTCCTTAACG pddABC-ddrAB 53
chnSeq F1
CTCAACAGGGTGTAAGTGTAGT chnA 56
chnSeq R1
CGTTTTGATATAGCCAGGATGT chnA 57
pCL1925 vec F
CGGTATCATCAACAGGCTTACC todos 62
pCL1925 vec R1
AGGGTTTTCCCAGTCACGACGT todos 63
pCL1925 vec R2
CGCAATAGTTGGCGAAGTAATC todos 64
APTseqRev
GCTAGAGATGATAGC APT 160
APTseqFor
GGAAGAGACTATCCAGCG APT 161
Tabla 15. 5
Secuenciación y cebadores de PCR usados en los Ejemplos 19-22
Nombre
SEC ID Nº Función
Trc99a_For
285 construcción de comprobación de pTrc99a::rdhtAB
Trc99a_Rev
286 construcción de comprobación de pTrc99a::rdhtAB
N712
287 construcción de comprobación de pCL1925::RdhtAB
N713
288 construcción de comprobación de pCL1925::RdhtAB
N473
291 amplificación de sadB
N469
292 amplificación de sadB
N695
293 amplificación de RdhtA
N696
294 amplificación de RdhtA
N697
295 amplificación de RdhtB
N698
296 amplificación de RdhtB
N742A
302 amplificación de FBA-RdhtA+GPM-RdhtB
N743A
303 amplificación de FBA-RdhtA+GPM-RdhtB
N657
304 amplificación del marcador MET15
N653A
305 amplificación del marcador MET15
N579
306 amplificación de budA
Secuenciación y cebadores de PCR usados en los Ejemplos 19-22
Nombre
SEC ID Nº Función
N480
307 amplificación de budA
N98SeqF1
311 Cribado de alsS
N99SeqR2
312 Cribado de alsS
N160SeqF1
313 Cribado de budA
N84SeqR2
314 Cribado de budA
N581
315 amplificación de budC
N582
316 amplificación de budC
N583
319 amplificación de sadB
N584
320 amplificación de sadB
N142
322 construcción de comprobación de pRS425::GPM-sadB
N459
323 construcción de comprobación de pRS425::GPM-sadB
Procedimientos para determinar la concentración 2-butanol y 2-butanona en medios de cultivo
La concentración de 2-butanol y 2-butanona en los medios de cultivo puede determinarse por varios procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento específico de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizó una columna SH-1011 Shodex con una precolumna SH-G Shodex, ambas compradas de Waters Corporation (Milford, MA), con detección por índice de refracción (IR). La separación cromatográfica se logró usando H2SO4 0,01 M como fase móvil con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min y una temperatura de la columna de 50 ºC. En las condiciones usadas, la 2-butanona y el 2-butanol tuvieron tiempos de retención de 39,5 y 44,3 min, respectivamente. Alternativamente, están disponibles procedimientos de cromatografía de gases (CG). Por ejemplo, un procedimiento de CG específico utilizó una columna HP-INNOWax (30 m x 0,53 m de DI, espesor de película 1 µm, Agilent Technologies, Wilmington, DE) con un detector de ionización de llama (FID). El gas portador fue helio a una velocidad de flujo de 4,5 ml/min, medida a 150 ºC con presión de la cabeza constante; el fraccionado del inyector fue 1:25 a 200 ºC; la temperatura del horno fue 45 ºC durante 1 min, 45 a 220 ºC a 10 ºC/min y 220 ºC durante 5 min; y se empleó detección de FID a 240 ºC con 26 ml/min de gas compuesto de helio. Los tiempos de retención de la 2-butanona y el 2-butanol fueron 3,61 y 5,03 min, respectivamente.
La 2-butanona también puede detectarse por derivatización con 3-metil-2-benzotiazolinonahidrazona (MBTH). Una disolución acuosa que contiene 2-butanona se mezcla con un volumen igual de una disolución acuosa de 6 mg/ml de MBTH en glicina-HCl 375 mM (pH 2,7) y se incuba a 100 ºC durante 3 min. Las muestras derivatizadas de MBTH resultantes se analizan sobre una columna Supelcosil LC-18-D5 5 µm de 25 cm x 4,6 mm (id) (Supelco) usando una fase móvil de 55 % de acetonitrilo en agua a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El derivado de 2-butanona aparece como dos picos (isómeros cis y trans) con tiempos de retención de aproximadamente 12,3 y 13,3 min y máximos de absorbancia de 230 y 307 nm.
El significado de las abreviaturas es el siguiente: “s” significa segundo(s), “min” significa minuto(s), “h” significa hora(s), “psi” significa libras por pulgada cuadrada, “nm” significa nanómetros, “d” significa día(s), “µl” significa microlitro(s), “ml” significa mililitro(s), “L” significa litro(s), “mm” significa milímetro(s), “nm” significa nanómetros, “mM” significa milimolar, “M” significa molar, “mmol” significa milimol(es), “µmol” significa micromol(es)”, “g” significa gramo(s), “µg” significa microgramo(s) y “ng” significa nanogramo(s), “PCR” significa reacción en cadena de la polimerasa, “DO” significa densidad óptica, “DO600” significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, “kDa” significa kilodalton, “g” significa la constante de la gravedad, “pb” significa par(es) de bases, “kpb” significa kilopar(es) de bases, “% en p/v” significa porcentaje en peso/volumen, % en v/v” significa porcentaje en volumen/volumen, “% en p” significa porcentaje en peso, “HPLC” significa cromatografía líquida de alta resolución y “CG” significa cromatografía de gases. El término “selectividad molar” es el número de moles de producto producidos por mol de sustrato de azúcar consumido y se informa como un porcentaje.
Ejemplo 1
Clonación y expresión de acetolactato sintasa
El fin de este ejemplo fue clonar y expresar en E. coli el gen budB que codifica la enzima acetolactato sintasa. El gen budB se amplificó a partir de ADN genómico de la cepa ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae usando PCR.
La secuencia de budB que codifica acetolactato sintasa se amplificó a partir de ADN genómico de Klebsiella pneumoniae (ATCC 25955) por PCR usando el par de cebadores B1 (SEC ID Nº: 15) y B2 (SEC ID Nº: 16). Otros
reactivos de amplificación por PCR (por ejemplo, Kod HiFi DNA Polymerase (Novagen Inc., Madison, WI; catálogo nº 71805-3)) se suministraron en los kits del fabricante y se usaron según el protocolo del fabricante. Se preparó ADN genómico de Klebsiella pneumoniae usando el kit Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Mineápolis, MN; número de catálogo D-5000A). La amplificación se llevó a cabo en un ciclador térmico de ADN GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) y la secuencia de aminoácidos predicha de la enzima se facilitan como SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 4, respectivamente.
Para los estudios de expresión se usó la tecnología de clonación Gateway (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). El vector de entrada pENTR/SD/D-TOPO permite la clonación direccional y proporcionó una secuencia de Shine-Dalgarno para el gen de interés. El vector de destino pDEST14 usó un promotor de T7 para la expresión del gen sin marca. El cebador directo incorporó cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de iniciación de la traducción para permitir la clonación direccional del producto de PCR de la región codificante de acetolactato sintasa budB en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), generando el plásmido pENTRSDD-TOPObudB. La construcción de pENTR se transformó en células Top10 de E. coli (Invitrogen) y se sembró según las recomendaciones del fabricante. Los transformantes se cultivaron durante la noche y el ADN de plásmido se preparó usando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA; nº de catálogo 27106) según las recomendaciones del fabricante. Para crear un clon de expresión, la región codificante de budB de pENTRSDD-TOPObudB se transfirió al vector pDEST 14 por recombinación in vitro usando la mezcla LR Clonase (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA). El vector resultante, pDEST14budB, se transformó en células BL-21-AI (Invitrogen Corp.). Las células BL-21-AI llevan una copia cromosómica de la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor araBAD inducible por arabinosa.
Se inoculan transformantes en medio LB complementado con 50 µg/ml de ampicilina y se cultivan durante la noche. Se usa una alícuota del cultivo durante la noche para inocular 50 ml de medio LB complementado con 50 µg/ml de ampicilina. El cultivo se incuba a 37 ºC con agitación hasta que la DO600 alcanza 0,6-0,8. El cultivo se divide en dos porciones de 25 ml y se añade arabinosa a uno de los matraces a una concentración final del 0,2 % en p/v. El matraz de control negativo no se induce con arabinosa. Los matraces se incuban durante 4 h a 37 ºC con agitación. Las células se recogen por centrifugación y los sedimentos de células se resuspenden en tampón MOPS 50 mM, pH 7,0. Las células se rompen tanto por sonicación como por pase a través de una celda de presión francesa. Cada lisado celular se centrifuga dando el sobrenadante y el sedimento o la fracción insoluble. Una alícuota de cada fracción (lisado de células completas, de células inducidas y de control) se resuspende en tampón de carga SDS (MES) (Invitrogen), se calienta a 85 ºC durante 10 min y se somete a análisis de SDS-PAGE (NuPAGE 4-12 % de gel bis-Tris, nº de catálogo NP0322Box, Invitrogen). Una proteína del peso molecular esperado, como se deduce de la secuencia de ácidos nucleicos, está presente en el cultivo inducido, pero no en el control sin inducir.
La actividad de acetolactato sintasa en los extractos libres de células se mide usando el procedimiento descrito por Bauerle y col. (Bauerle y col. (1964) Biochim. Biophys. Acta 92:142-149). La concentración de proteína se mide por tanto el procedimiento de Bradford como por el kit bicinconínico (Sigma, nº de catálogo BCA-1; St. Louis, MO) usando albúmina de suero bovino (BSA) (Bio-Rad, Hercules, CA) como patrón.
Ejemplo 2
Clonación y expresión de acetolactato descarboxilasa
El fin de este ejemplo fue clonar y expresar en E. coli el gen budA que codifica la enzima acetolactato descarboxilasa. El gen budA se amplificó a partir de ADN genómico de la cepa ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae usando PCR.
La secuencia de budA que codifica acetolactato descarboxilasa se clonó del mismo modo que se ha descrito para budB en el Ejemplo 1, excepto que los cebadores usados para la amplificación por PCR fueron B3 (SEC ID Nº: 17) y B4 (SEC ID Nº: 18). La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) y la secuencia de aminoácidos predicha de la enzima se facilitan como SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2, respectivamente. El plásmido resultante se llamó pENTRSDD-TOPObudA.
La actividad de acetolactato descarboxilasa en los extractos libres de células se mide usando el procedimiento descrito por Bauerle y col., arriba.
Ejemplo 3 (profético)
Clonación y expresión de butanodiol deshidrogenasa
El fin de este ejemplo profético es describir cómo clonar y expresar en E. coli el gen budC que codifica la enzima butanodiol deshidrogenasa. El gen budC se amplifica a partir de ADN genómico de la cepa IAM1063 de Klebsiella pneumoniae usando PCR.
La secuencia de budC que codifica butanodiol deshidrogenasa se clona y expresa del mismo modo que se describe para budA en el Ejemplo 1, excepto que los cebadores usados para la amplificación por PCR son B5 (SEC ID Nº: 19) y B6 (SEC ID Nº: 20) y el molde de ADN genómico es de IAM1063 de Klebsiella pneumoniae (que se obtiene del Institute of Applied Microbiology Culture Collection, Tokio, Japón). Se prepara ADN genómico de IAM1063 de
Klebsiella pneumoniae usando el kit Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Mineápolis, MN; número de catálogo D-5000A). La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) y la secuencia de aminoácidos predicha de la enzima se facilitan como SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6, respectivamente.
La actividad de butanodiol deshidrogenasa en los extractos libres de células se mide espectrofotométricamente siguiendo el consumo de NADH a una absorbancia de 340 nm.
Ejemplo 4 (profético)
Clonación y expresión de butanodiol deshidratasa
El fin de este ejemplo profético es describir cómo clonar y expresar en E. coli los genes pddA, pddB y pddC que codifican butanodiol deshidratasa. Los genes pddA, pddB y pddC se amplifican a partir de ADN genómico de ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca usando PCR.
Las secuencias de pddA, pddB y pddC que codifican butanodiol deshidratasa se clonan y se expresan del mismo modo que se describe para budA en el Ejemplo 1, excepto que el molde de ADN genómico es de ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca y los cebadores son B7 (SEC ID Nº: 21) y B8 (SEC ID Nº: 22). Se prepara ADN genómico de Klebsiella oxytoca usando el kit Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Mineápolis, MN; número de catálogo D-5000A). Se clona un único producto de PCR que incluye los tres marcos de lectura abiertos (ORF), de manera que las tres regiones codificantes se expresan como un operón de un único promotor en el plásmido de expresión. Las secuencias de nucleótidos de los marcos de lectura abiertos para las tres subunidades se facilitan como SEC ID Nº: 7, 9 y 11, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos predichas de las tres subunidades de enzima se facilitan como SEC ID Nº: 8, 10 y 12, respectivamente.
La actividad de butanodiol deshidratasa en los extractos libres de células se mide derivatizando el producto de cetona con 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH). Brevemente, 100 µl de mezcla de reacción, extracto de células que contiene aproximadamente 0,0005 unidades de enzima, tampón fosfato de potasio 40 mM (pH 8,0), 2 µg de adenosilcobalamina, 5 µg de 2,3-butanodiol y 1 µg de albúmina de suero bovino, se inactivan mediante la adición de un volumen igual de 0,05 % en p de DNPH en HCl 1,0 N. Después de 15 min a temperatura ambiente, el color se desarrolla mediante la adición de 100 µl de NaOH 4 N. La cantidad de producto se determina a partir de la absorbancia de la disolución final a 550 nm en comparación con una curva patrón preparada con 2-butanona. Todas las reacciones se llevan a cabo a 37 ºC bajo luz roja tenue.
Ejemplo 5 (profético)
Clonación y expresión de butanol deshidrogenasa
El fin de este ejemplo profético es describir cómo clonar y expresar en E. coli el gen sadh que codifica butanol deshidrogenasa. El gen sadh se amplifica a partir de ADN genómico de la cepa 219 de Rhodococcus ruber usando PCR.
La secuencia de sadh que codifica butanol deshidrogenasa se clona y expresa del mismo modo que se describe para budA en el Ejemplo 1, excepto que el molde de ADN genómico es de la cepa 219 de Rhodococcus ruber (Meens, Institut für Mikrobiologie, Universidad de Hannover, Hannover, Alemania) y los cebadores son B9 (SEC ID Nº: 23) y B10 (SEC ID Nº: 24). Se prepara ADN genómico de Rhodococcus ruber usando el kit de aislamiento de ADN microbiano Ultra Clean™ (MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA) según el protocolo del fabricante. La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) y la secuencia de aminoácidos predicha de la enzima se facilitan como SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14, respectivamente.
La actividad de butanol deshidrogenasa en extractos libres de células se mide siguiendo el aumento en absorbancia a 340 nm resultante de la conversión de NAD a NADH cuando la enzima se incuba con NAD y 2-butanol.
Ejemplo 6 (profético)
Construcción de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética del 2-butanol
El fin de este ejemplo profético es describir la preparación de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética del 2-butanol (es decir, ruta 3 como se ha descrito anteriormente). Al igual que la mayoría de los organismos, E. coli convierte glucosa inicialmente en ácido pirúvico. Las enzimas requeridas para convertir ácido pirúvico en 2-butanol siguiendo la ruta 3, es decir, acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa, butanodiol deshidratasa y butanol deshidrogenasa, están codificadas por los genes budA, budB, budC, pddA, pddB, pddC y sadh. Para simplificar la formación de la ruta biosintética del 2-butanol en un organismo recombinante, los genes que codifican las 5 etapas en la ruta se dividen en dos operones. La ruta superior comprende las tres primeras etapas catalizadas por acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa y butanodiol deshidrogenasa. La ruta inferior comprende las dos últimas etapas catalizadas por butanodiol deshidratasa y butanol deshidrogenasa.
Las secuencias codificantes se amplifican por PCR con cebadores que incorporan sitios de restricción para la
clonación posterior, y los cebadores directos contienen un sitio de unión a ribosoma de E. coli optimizado (AAAGGAGG). Los productos de PCR se clonan con TOPO en el vector pCR4Blunt-TOPO y se transforman en células Top10 (Invitrogen). Se prepara ADN de plásmido a partir de los clones de TOPO, y se verifica la secuencia del fragmento de PCR clonado. Las enzimas de restricción y ADN ligasa T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) se usan según recomendaciones del fabricante. Para los experimentos de clonación, los fragmentos de restricción se purifican en gel usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen).
Después de la confirmación de la secuencia, las regiones codificantes se subclonan en un vector pUC19 modificado como plataforma de clonación. El vector pUC19 se modifica por un digesto de HindIII/SapI, seguido de tratamiento con ADN polimerasa de Klenow para llenar los extremos. El fragmento de vector de 2,4 kB se purifica en gel y se religa creando pUC19dHS. Alternativamente, el vector pUC19 se modifica por un digesto de SphI/SapI, seguido de tratamiento con ADN polimerasa de Klenow para hacer romos los extremos. El fragmento de vector de 2,4 kB se purifica en gel y se religa creando pUC19dSS. Los digestos eliminan el promotor lac adyacente al MCS (sitios de clonación múltiple), previniendo la transcripción de los operones del vector.
Ruta superior:
Las regiones codificantes de budABC se amplifican a partir de ADN genómico de Klebsiella pneumoniae por PCR usando el par de cebadores B11 y B12 (Tabla 4), facilitados como SEC ID Nº: 25 y 26, respectivamente. El cebador directo incorpora un sitio de restricción de EcoRI y un sitio de unión a ribosoma (RBS). El cebador inverso incorpora un sitio de restricción Sphl. El producto de PCR se clona en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budABC.
Para construir la ruta superior, el operón pCR4 Blunt-TOPO-budABC se digiere con EcoRI y Sphl liberando un fragmento budABC de 3,2 kpb. El vector pUC19dSS también se digiere con EcoRI y Sphl, liberando un fragmento de vector de 2,0 kpb. El fragmento budABC y el fragmento de vector se ligan juntos usando ADN ligasa T4 (New England Biolabs) para formar pUC19dSS-budABC.
Ruta inferior:
Las regiones codificantes de pddABC se amplifican a partir de ADN genómico de ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca por PCR usando los cebadores B13 y B14 (Tabla 4), facilitados como SEC ID Nº: 27 y 28, respectivamente, creando un producto de 2,9 kpb. El cebador directo incorpora sitios de restricción EcoRI y Pmel y un RBS. El cebador inverso incorpora el sitio de restricción BamHI. El producto de PCR se clona en pCRBlunt II-TOPO creando pCRBluntII-pdd.
El gen sadh se amplifica a partir de ADN genómico de la cepa 219 de Rhodococcus ruber por PCR usando los cebadores B15 y B16 (Tabla 4), facilitados como SEC ID Nº: 29 y 30, respectivamente, creando un producto de 1,0 kpb. El cebador directo incorpora un sitio de restricción BamHI y un RBS. El cebador inverso incorpora un sitio de restricción Xbal. El producto de PCR se clona en pCRBlunt II-TOPO creando pCRBluntII-sadh.
Para construir el operón de la ruta inferior, un fragmento de EcoRI y BamHI de 2,9 kpb de pCRBluntII-pdd, un fragmento de BamHI y XbaI de 1,0 kpb de pCRBluntII-sadh y el fragmento grande de un digesto de EcoRI y XbaI de pUC19dHS se ligan juntos. La ligación de tres vías crea pUC19dHS-pdd-sadh.
El vector pUC19dSS-budABC se digiere con PmeI y HindIII, liberando un fragmento de 3,2 kpb que se clona en pBenBP, un vector lanzadera de E. coli-B. subtilis. El plásmido de pBenBP se crea por modificación del vector pBE93, que se describe por Nagarajan (documento WO 93/2463, Ejemplo 4). Para generar pBenBP, la secuencia señal del promotor de proteasa neutra (NPR) de Bacillus amiloliquefaciens y el gen phoA se eliminan de pBE93 con un digesto de NcoI/HindIII. El promotor de NPR se amplifica por PCR a partir de pBE93 por los cebadores BenF y BenBPR, facilitados por SEC ID Nº: 31 y 32, respectivamente. El cebador BenBPR incorpora sitios BstEII, Pmel y HindIII en la dirección 3' de un promotor. El producto de PCR se digiere con Ncol y Hindlll, y el fragmento se clona en los sitios correspondientes en el vector pBE93 para crear pBenBP. El fragmento de operón superior se subclona en los sitios Pmel y HindIII en pBenBP creando pBen-budABC.
El vector pUC19dHS-pdd-sadh se digiere con Pmel y HindIII liberando un fragmento de 3,9 kpb que se clona en los sitios Pmel y Hindlll de pBenBP, creando pBen-pdd-sadh.
Ejemplo 7 (profético)
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol en E. coli
El fin de este ejemplo profético es describir cómo expresar una ruta biosintética del 2-butanol en E. coli.
Los plásmidos pBen-budABC y pBen-pdd-sadh, preparados como se ha descrito en el Ejemplo 6, se transforman por separado en NM522 de E. coli (ATCC nº 47000), y la expresión de los genes en cada operón se monitoriza por análisis de SDS-PAGE y ensayo enzimático. Después de confirmarse la expresión de todos los genes, pBenbudABC se digiere con EcoRI y HindIII para liberar el fragmento budABC del promotor de NPR. El fragmento se hace romo en los extremos usando el fragmento de Klenow de ADN polimerasa (New England Biolabs, nº de catálogo M0210S). El plásmido pBen-pdd-sadh se digiere con EcoRI y similarmente se hace romo para crear un
fragmento de vector de extremos romos linealizado. El vector y los fragmentos NPR-budABC se ligan, creando p2BOH. Este plásmido se transforma en NM522 de E. coli dando NM522/p2BOH de E. coli, y la expresión de los genes se monitoriza como se ha descrito previamente.
NM522/p2BOH de E. coli se inocula en un matraz con agitación de 250 ml que contiene 50 ml de medio y se agita a 250 rpm y 35 ºC. El medio está compuesto por: dextrosa, 5 g/l; MOPS, 0,05 M; sulfato de amonio, 0,01 M; fosfato de potasio, monobásico, 0,005 M; mezcla de metales S10, 1 % (v/v); extracto de levadura, 0,1 % (p/v); casaminoácidos, 0,1 % (p/v); tiamina, 0,1 mg/l; prolina, 0,05 mg/l; y biotina 0,002 mg/l, y se valora a pH 7,0 con KOH. La mezcla de metales S10 contiene: MgCl2, 200 mM; CaCl2, 70 mM; MnCl2, 5 mM; FeCl3, 0,1 mM; ZnCl2, 0,1 mM; clorhidrato de tiamina, 0,2 mM; CuSO4 172 µM; CoCl2, 253 µM; y Na2MoO4, 242 µM. Después de 18 h se detecta 2-butanol por HPLC o análisis de CG usando procedimientos que son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la sección de Procedimientos generales anterior.
Ejemplo 8 (profético)
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol en Bacillus subtilis
El fin de este ejemplo profético es describir cómo expresar una ruta biosintética del 2-butanol en Bacillus subtilis.
Los plásmidos pBen-budABC y pBen-pdd-sadh, preparados como se ha descrito en el Ejemplo 6, se transforman por separado en BE1010 de Bacillus subtilis (J. Bacteriol. 173:2278-2282 (1991)) y la expresión de los genes en cada operón se monitoriza como se ha descrito en el Ejemplo 7. El plásmido pBen-budABC se digiere con EcoRI y Hindlll para liberar el fragmento budABC del promotor de NPR. El fragmento se hace romo en los extremos usando el fragmento de Klenow de ADN polimerasa (New England Biolabs, nº de catálogo M0210S). El plásmido pBen-pddsadh se digiere con EcoRI y similarmente se hace romo para crear un fragmento de vector de extremos romos linealizado. El vector y los fragmentos de NPR-budABC se ligan, creando p2BOH. Este plásmido se transforma en BE1010 de Bacillus subtilis dando BE1010 /p2BOH de Bacillus subtilis, y la expresión de los genes se monitoriza como se ha descrito previamente.
BE1010/p2BOH de Bacillus subtilis se inocula en un matraz con agitación de 250 ml que contenía 50 ml de medio y se agitó a 250 rpm y 35 ºC durante 18 h. El medio está compuesto por: dextrosa, 5 g/l; MOPS, 0,05 M; ácido glutámico, 0,02 M; sulfato de amonio, 0,01 M; tampón fosfato de potasio, monobásico, 0,005 M; mezcla de metales S10 (como se ha descrito en el Ejemplo 7), 1 % (v/v); extracto de levadura, 0,1 % (p/v); casaminoácidos, 0,1 % (p/v); triptófano, 50 mg/l; metionina, 50 mg/l; y lisina, 50 mg/l, y se valora a pH 7,0 con KOH. Después de 18 h el 2-butanol se detecta por HPLC o análisis de CG usando procedimientos que son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la sección de Procedimientos generales anterior.
Ejemplo 9
Construcción de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética del 2-butanol
El fin de este ejemplo era preparar un huésped de E. coli recombinante que llevara los genes en una ruta biosintética del 2-butanol (es decir, la ruta 3 como se ha descrito anteriormente). Al igual que la mayoría de organismos, E. coli convierte glucosa inicialmente en ácido pirúvico. Las enzimas requeridas para convertir ácido pirúvico en 2-butanona en la ruta 3, es decir, acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa y butanodiol deshidratasa están codificadas por los genes budA, budB, budC, pddA, pddB y pddC. En la última etapa de la ruta, una butanol deshidrogenasa convierte 2-butanona en 2-butanol. Las deshidrogenasas que llevan a cabo esta última etapa son promiscuas y pueden encontrarse en muchos organismos. Para simplificar la formación de la ruta biosintética del 2-butanol en un organismo recombinante, los genes que codifican las 5 etapas en la ruta se dividieron en múltiples operones. El operón de la ruta superior comprendió las tres primeras etapas catalizadas por acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa y butanodiol deshidrogenasa y se clonaron sobre un vector de expresión. La ruta inferior comprendió las dos últimas etapas catalizadas por butanodiol deshidratasa que incluyen el factor reactivante (Mori y col., J. Biol. Chem. 272:32034 (1997)) y una butanol deshidrogenasa. La diol deshidratasa puede experimentar inactivación suicida durante la catálisis. La proteína factor reactivante codificada por ddrA y ddrB (GenBank AF017781, SEC ID Nº: 70) reactiva la enzima inactiva. Los genes ddrA y ddrB flanquean el operón de diol deshidratasa. Los operones para la deshidratasa/factor reactivante y la butanol deshidrogenasa tanto se clonaron sobre otro vector de expresión como el operón para deshidratasa/factor reactivante se clonó individualmente sobre otro vector de expresión y la última etapa se proporcionó por una actividad endógena en el huésped de demostración.
Construcción del vector pTrc99a-budABC:
Las regiones codificantes de budAB se amplificaron a partir de ADN genómico de ATCC 25955 de K. pneumoniae por PCR usando el par de cebadores BABC F y BAB R, facilitados como SEC ID Nº: 33 y 34, respectivamente (véase la Tabla 4), creando un producto de 2,5 kpb. El cebador directo incorporó sitios de restricción SacI y EcoRI y un sitio de unión a ribosoma (RBS). El cebador inverso incorporó un sitio de restricción Spel. El producto de PCR se clonó en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budAB. Se preparó ADN de plásmido a partir de los clones de TOPO y la secuencia de los genes se verificó con los cebadores M13 directo (SEC ID Nº: 35), M13 inverso (SEC
ID Nº: 36), N83 SeqF2 (SEC ID Nº: 37), N83 SeqF3 (SEC ID Nº: 38) y N84 SeqR4 (SEC ID Nº: 39) (véase la Tabla 5).
La región codificante de budC se amplificó a partir de ADN genómico de ATCC 25955 de K. pneumoniae por PCR usando el par de cebadores BC Spe F y BC Xba R, facilitados como SEC ID Nº: 40 y 41, respectivamente, creando un producto de 0,8 kpb. El cebador directo incorporó un sitio de restricción Spel, un RBS y modificó el CDS cambiando el segundo y tercer codones de AAA a AAG. El cebador inverso incorporó un sitio de restricción Xbal. El producto de PCR se clonó en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budC. Se preparó ADN de plásmido a partir de los clones de TOPO y la secuencia de los genes se verificó con los cebadores M13 directo (SEC ID Nº: 35) y M13 inverso (SEC ID Nº: 36).
Para construir el operón budABC, pCR4 Blunt-TOPO-budC se digirió con SnaBI y Xbal liberando un fragmento budC de 1,0 kpb. El vector pTrc99a (Amann y col., Gene 69(2):301-315 (1988)) se digirió con Smal y XbaI creando un fragmento de vector linealizado de 4,2 kpb. El vector y el fragmento budC se ligaron para crear pTrc99a-budC y se transformaron en células Top 10 de E. coli (Invitrogen). Los transformantes se analizaron por amplificación por PCR con cebadores Trc F (SEC ID Nº: 42) y Trc R (SEC ID Nº: 43) para un producto de 1,2 kpb para confirmar la presencia del inserto de budC. Los genes budAB se subclonaron a partir de pCR4 Blunt-TOPO-budAB como un fragmento de EcoRI/SpeI de 2,5 kpb. El vector pTrc99a-budC se digirió con EcoRI y Spel y el fragmento de vector de 5,0 kpb resultante se purificó en gel. El vector purificado y el inserto de budAB se ligaron y se transformaron en células Top 10 de E. coli. Los transformantes se cribaron por amplificación por PCR con cebadores Trc F (SEC ID Nº: 42) y N84 Seq R2 (SEC ID Nº: 65) para confirmar la creación de pTrc99a-budABC. En este plásmido, las regiones codificantes de bud A, B, y C están adyacentes entre sí, en este orden, y entre el promotor de Trc y la secuencia de terminación de rrnB.
Resultados:
Se examinaron tres cepas aisladas independientes de Top 10/pTrc99a-budABC de E. coli para la producción de butanodiol, usando Top 10/pCL1925-Kodd-ddr de E. coli (descrito más adelante) como control negativo. Las cepas se cultivaron en medio LB que contenía 100 µg/ml de carbenicilina. Las células resultantes se usaron para inocular matraces con agitación (aproximadamente 175 ml de volumen total) que contenían 125 ml de medio TM3a/glucosa con 100 µg/ml de carbenicilina. Además, los matraces inoculados con cepas que llevaban pTrc99a-budABC contuvieron β-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo 0,4 mM (IPTG). El medio TM3a/glucosa contiene (por litro): 10 g de glucosa, 13,6 g de KH2PO4, 2,0 g de ácido cítrico monohidratado, 3,0 g de (NH4)2SO4, 2,0 g de MgSO4·7H2O, 0,2 g de CaCl2·2H2O, 0,33 g de citrato de amonio férrico, 1,0 mg de tiamina·HCl, 0,50 g de extracto de levadura y 10 ml de disolución de oligoelementos, ajustado a pH 6,8 con NH4OH. La disolución de oligoelementos contuvo: ácido cítrico·H2O (4,0 g/l), MnSO4·H2O (3,0 g/l), NaCl (1,0 g/l), FeSO4·7H2O (0,10 g/l), CoCl2·6H2O (0,10 g/l), ZnSO4·7H2O (0,10 g/l), CuSO4·5H2O (0,010 g/l), H3BO3(0,010 g/l) y Na2MoO4·2H2O (0,010 g/l). Los matraces, se taparon con tapones ventilados, se inocularon a una DO600 inicial de aproximadamente 0,03 unidades y se incubaron a 34 ºC con agitación a 300 rpm.
Aproximadamente 23 h después de la inducción, una alícuota del caldo se analizó por HPLC (columna Sugar SH1011 Shodex) y GC (HP-INNOWax), usando los mismos procedimientos descritos en la sección de Procedimientos generales para 2-butanol y 2-butanona. Los resultados del análisis se facilitan en la Tabla 6. Los tres clones de E. coli convirtieron glucosa en acetoína y meso-2,3-butanodiol, los productos intermedios deseados de la ruta, con una selectividad molar del 14 %. Esta selectividad fue aproximadamente 35 veces superior a la observada con la cepa de control de E. coli que carece de budABC.
Tabla 6
Producción de acetoína y meso-2,3-butanodiol por Top 10/pTrc99a-budABC de E. coli
Cepa
DO600 Acetoína, mM Meso-2,3-butanodiol, mM Selectividad molara, %
Control negativo
1,4 0,07 0,03 0,4
Cepa aislada nº 1
1,5 0,64 1,3 14
Cepa aislada nº 2
1,4 0,70 1,2 14
Cepa aislada nº 3
1,4 0,74 1,3 15
a La selectividad molar es (acetoína + meso-2,3-butanondiol)/(glucosa consumida).
Construcción del vector pCL1925-KoDD-ddr:
Los operones de diol deshidratasa (GenBank D45071, SEC ID Nº: 69) y factor reactivante (GenBank AF017781, 44
SEC ID Nº: 70) se amplificaron por PCR a partir de ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca como única unidad con cebadores DDo For (SEC ID Nº: 44) y DDo Rev (SEC ID Nº: 45). El cebador directo incorporó un RBS de E. coli optimizado y un sitio de restricción HindIII. El cebador inverso incluyó un sitio de restricción XbaI. El producto de PCR de 5318 pb se clonó en pCR4Blunt-TOPO y los clones de pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr resultante se secuenciaron con cebadores M13 directo (SEC ID Nº: 35), M13 inverso (SEC ID Nº: 36), DDko seq F2 (SEC ID Nº: 46), DDko seq F5 (SEC ID Nº: 47), DDko seq F7 (SEC ID Nº: 48), DDko seq F9 (SEC ID Nº: 49), DDko seq R1 (SEC ID Nº: 50), DDko seq R3 (SEC ID Nº: 51), DDko seq R7 (SEC ID Nº: 52) y DDko seq R10 (SEC ID Nº: 53). Se identificó un clon que tenía el inserto con la secuencia esperada.
Para la expresión, los genes diol deshidratasa/factor reactivante se subclonaron en pCL1925 (patente de EE.UU. nº 7.074.608), un plásmido de bajo número de copias que lleva el promotor de glucosa isomerasa de Streptomyces. pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr se digirió con Hindlll y Xbal y el fragmento Kodd-ddr de 5,3 kpb resultante se purificó en gel. El vector pCL1925 se digirió con HindIII y Xbal y el fragmento de vector de 4539 pb resultante se purificó en gel. El vector y el fragmento Kodd-ddr se ligaron y se transformaron en Top10 de E. coli. Los transformantes se cribaron por PCR con cebadores DDko Seq F7 (SEC ID Nº: 48) y DDko Seq R7 (SEC ID Nº: 52). La amplificación del plásmido (pCL1925-Kodd-ddr) que lleva el inserto produjo un producto de aproximadamente 797 pb.
La actividad de diol deshidratasa hacia meso-2,3-butanodiol se midió incubando el extracto de células (proteína total ~ 0,8 mg/ml) con butanodiol 10 mM y coenzima B12 12 mM en HEPES 80 mM (pH 8,2) durante 17 h a temperatura ambiente. La formación del producto esperado, 2-butanona, se determinó por HPLC como se ha descrito en Procedimientos generales.
Construcción del vector pCL1925-KoDD-ddr::T5 chnA ter:
Para proporcionar una actividad de alcohol deshidrogenasa heteróloga, el gen chnA que codifica ciclohexanol deshidrogenasa de Acinetobacter sp.(Cheng y col., J. Bacteriol. 182:4744-4751 (2000)) se clonó en el vector pCL1925 con el operón de diol deshidratasa, pCL1925-Kodd-ddr. El gen chnA, facilitado como SEC ID Nº: 71 (Genbank nº: AF282240, SEC ID Nº: 73) se amplificó a partir de pDCQ2, un cósmido que lleva la agrupación de genes de ciclohexanol de Acinetobacter, con los cebadores ChnA F (SEC ID Nº: 54) y ChnA R (SEC ID Nº: 55). El producto de PCR de 828 pb resultante se clonó en pCR4Blunt-TOPO para crear pCR4Blunt-TOPO-chnA y los transformantes se cribaron por PCR de colonias con los cebadores M13 directo (SEC ID Nº: 35) y M13 inverso (SEC ID Nº: 36). Los clones correctos produjeron un producto de PCR de aproximadamente 1 kpb y se secuenciaron con los cebadores M13 directo (SEC ID Nº: 35) y M13 inverso (SEC ID Nº: 36).
Después de la secuenciación de pCR4Blunt-TOPO-chnA para confirmar la secuencia correcta, el gen chnA se subclonó a partir del plásmido como un fragmento MfeI/SmaI de 813 pb. El vector de expresión pQE30 (Qiagen) se digirió con Mfel y Smal y el fragmento de vector de 3350 pb resultante se purificó en gel. El fragmento chnA y el vector purificado se ligaron y se transformaron en células Top10 de E. coli. Los transformantes se seleccionaron por PCR de colonias con cebadores chnSeq F1 (SEC ID Nº: 56) y chnseq R1 (SEC ID Nº: 57) para un producto de PCR de 494 pb. Esta clonación puso el gen chnA bajo el control del promotor T5 en el plásmido, pQE30-chnA.
Para preparar el vector pCL1925 para llevar dos operones se añadieron terminadores al vector. Un fragmento de terminador de tonB-mcs-terminador de trpA se preparó hibridando oligonucleótidos con cebadores Top ter F1 (SEC ID Nº: 58), Top ter F2 (SEC ID Nº: 59), Bot ter R1 (SEC ID Nº: 60) y Bot ter R2 (SEC ID Nº: 61). El ADN hibridado se purificó en gel sobre un gel al 6 % de PAGE (Embi-tec, San Diego, CA). El vector pCL1925 se digirió con Sacl y XbaI y se purificó en gel. El ADN hibridado y el fragmento de vector se ligaron para crear pCL1925-ter. Los transformantes se cribaron por amplificación por PCR de colonias con cebadores pCL1925 vec F (SEC ID Nº: 62) y pCL1925 vec R1 (SEC ID Nº: 63) para la presencia de un producto de PCR de aproximadamente 400 pb. Los clones positivos del cribado de PCR se secuenciaron con los mismos cebadores.
El vector pCL1925-ter se digirió con Xhol y PmeI y el fragmento de 4622 pb resultante se purificó en gel. pQE30chnA se digirió con Ncol y el ADN se trató con ADN polimerasa de Klenow para hacer romos los extremos. Entonces, pQE30-chnA se digirió con Xhol y el fragmento de promotor T5-chnA de 1,2 kpb resultante se purificó en gel. El vector pCL1925-ter y el fragmento de operón chnA se ligaron juntos dando pCL1925-ter-T5chnA y se transformaron en Top10 de E. coli. Los transformantes se cribaron por amplificación por PCR de colonias con los cebadores pCL1925 vec F (SEC ID Nº: 64) y chnseq R1 (SEC ID Nº: 59) para un producto de aproximadamente 1 kpb.
Para acabar la formación del vector de la ruta, el plásmido pCL1925-KoDD-ddr se digirió con Xbal y Sacl y el fragmento de vector de 9504 pb resultante se purificó en gel. El operón de chnA flanqueado por los terminadores, con el terminador trpA (Koichi y col. (1997) volumen 272, número 51, pág. 32034-32041) 3' con respecto a la secuencia codificante de chnA, de pCL1925-ter-T5chnA se purificó en gel como un fragmento XbaI/SacI de 1271 pb. Después de la ligación de los fragmentos y transformación en Top10 de E. coli, los transformantes se cribaron por PCR de colonias. Los cebadores chnSeq F1 (SEC ID Nº: 58) y pCL1925 vec R2 (SEC ID Nº: 64) amplificaron el producto de PCR de 1107 pb esperado en el plásmido resultante, pCL1925-KoDD-ddr::ter-T5chnA.
Ejemplo 10
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol en E. coli con alcohol deshidrogenasa endógena expresada en exceso
El fin de este ejemplo era expresar una ruta biosintética del 2-butanol en varias cepas de E. coli.
Construcción de cepas de E. coli que expresan constitutivamente vghD:
E. coli contiene un gen nativo (yqhD) que se identificó como una 1,3-propanodiol deshidrogenasa (patente de EE.UU. nº 6.514.733). El gen yqhD, dado como SEC ID Nº: 74, tiene el 40 % de identidad con el gen adhB en Clostridium, una probable butanol deshidrogenasa dependiente de NADH. El gen yqhD se puso bajo la expresión constitutiva de una variante del promotor de glucosa isomerasa 1.6Gl (SEC ID Nº: 67) en la cepa MG1655 1.6yqhD::Cm de E. coli (documento WO 2004/033646) usando tecnología  Red (Datsenko y Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640 (2000)). Similarmente, el promotor nativo se sustituyó por el promotor 1.5Gl (documento WO 2003/089621) (SEC ID Nº: 68), creando la cepa MG1655 1.5yqhD::Cm, sustituyendo así el promotor 1.6Gl de MG1655 1.6yqhD::Cm con el promotor 1.5Gl. Los promotores 1.5Gl y 1.6Gl se diferencian 1 pb en la región -35, alterando así la fuerza de los promotores (documento WO 2004/033646). Aunque se sustituyó el promotor yqhD nativo con tanto el promotor 1.5Gl como 1.6Gl, el gen yqhC que codifica el regulador transcripcional putativo para el operón yqh se delecionó. La actividad de butanol deshidrogenasa se confirmó por ensayo enzimático usando procedimientos que son muy conocidos en la técnica.
Transformación de cepas de E. coli:
Plásmidos de la ruta pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC, descritos en el Ejemplo 9, se co-transformaron en las cepas MG1655, MG1655 1.6yqhD y MG1655 1.5yqhD de E. coli. Las dos últimas cepas expresan en exceso la 1,3propanodiol deshidrogenasa, YqhD, que también tiene actividad de butanol deshidrogenasa. Las cepas se examinaron para la producción de 2-butanona y 2-butanol esencialmente como se ha descrito anteriormente. Las células se inocularon en matraces con agitación (aproximadamente 175 ml de volumen total) que contenían tanto 50 como 150 ml de medio TM3a/glucosa (con 0,1 mg/l de vitamina B12, antibióticos apropiado y IPTG) para representar condiciones de medio y bajo oxígeno, respectivamente. Se usaron espectinomicina (50 µg/ml) y carbenicilina (100 µg/ml) para los plásmidos pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC, respectivamente. Los matraces se inocularon a una DO600 inicial de ≤ 0,04 unidades y se incubaron a 34 ºC con agitación a 300 rpm. Los matraces que contenían 50 ml de medio se taparon con tapones ventilados; los matraces que contenían 150 ml se taparon con tapones no ventilados para minimizar el intercambio de aire. IPTG estuvo presente a tiempo cero a una concentración de cero o 0,04 mM. Los resultados analíticos para la producción de 2-butanona y de 2-butanol se presentan en la Tabla 7. Todas las cepas de E. coli que comprenden una ruta biosintética del 2-butanol produjeron 2-butanona bajo condiciones de bajo y medio oxígeno y produjeron 2-butanol bajo condiciones de bajo oxígeno.
Tabla 7
Producción de 2-butanona y de 2-butanol por cepas MG1655 de E. coli que alojan los plásmidos de la ruta pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC
Cepaa,b
IPTG. mM Volumen de medio. ml 2-Butanona. mM 2-Butanol. mM
MG1655 nº 1
0 50 0,08 No detectado
MG1655 nº 2
0 50 0,11 No detectado
MG1655 nº 1
0,04 50 0,12 No detectado
MG1655 nº 2
0,04 50 0,11 No detectado
MG1655 nº 1
0 150 0,15 0,047
MG1655 nº 2
0 150 0,19 0,041
MG1655 nº 1
0,04 150 0,10 0,015
MG1655 nº 2
0,04 150 0,11 0,015
MG1655 1.5yqhD nº 1
0 50 0,10 No detectado
MG1655 1.5yqhD nº 2
0 50 0,07 No detectado
MG1655 1.5yqhD nº 1
0,04 50 0,12 No detectado
Producción de 2-butanona y de 2-butanol por cepas MG1655 de E. coli que alojan los plásmidos de la ruta pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC
Cepaa,b
IPTG. mM Volumen de medio. ml 2-Butanona. mM 2-Butanol. mM
MG1655 1.5yqhD nº 2
0,04 50 0,18 No detectado
MG1655 1.5yqhD nº 1
0 150 0,16 0,030
MG1655 1.5yqhD nº 2
0 150 0,18 0,038
MG1655 1.5yqhD nº 1
0,04 150 0,10 0,021
MG1655 1.5yqhD nº 2
0,04 150 0,09 0,017
MG1655 1.6yqhD nº 1
0 50 0,08 No detectado
MG1655 1.6yqhD nº 2
0 50 0,07 No detectado
MG1655 1.6yqhD nº 1
0,04 50 0,12 No detectado
MG1655 1.6yqhD nº 2
0,04 50 0,15 No detectado
MG1655 1.6yqhD nº 1
0 150 0,17 0,019
MG1655 1.6yqhD nº 2
0 150 0,18 0,041
MG1655 1.6yqhD nº 1
0,04 150 0,11 0,026
MG1655 1.6yqhD nº 2
0,04 150 0,11 0,038
Control (medio sin inocular)
No detectado No detectado
a nº 1 y nº 2 representan cepas aisladas independientes. b MG1655 es MG1655/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC MG1655 1.6yqhD es MG1655 1.6yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC MG1655 1.6yqhD es MG1655 1.5yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC.
Ejemplo 11
Expresión de una ruta biosintética del 2-butanol en E. coli con alcohol deshidrogenasa heteróloga
Plásmidos pCL1925-KoDD-ddr:ter-T5chnA y pTrc99a-budABC, descritos en el Ejemplo 9, se transformaron en las cepas MG1655 y MG1655 ΔyqhCD de E. coli para una demonstración de la producción de 2-butanol.
5 MG1655 ΔyqhCD lleva una inactivación yqhCD que se hizo usando el procedimiento de Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(12):6640-6645 (2000)). Después de la sustitución de la región con el casete FRT-CmR-FRT de pKD3, el marcador de resistencia a cloranfenicol se eliminó usando la FLP recombinasa. La secuencia de la región delecionada se facilita como SEC ID Nº: 66.
Las cepas MG1655/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::ter-T5 chnA y MG1655 ΔyqhCD/pTrc99a
10 budABC/pCL1925KoDD-ddr:ter-T5 chnA se examinaron para la producción de 2-butanona y de 2-butanol esencialmente como se ha descrito anteriormente. La cepa MG1655 ΔyqhCD/pCL1925 se usó como control negativo. Las células se inocularon en matrices con agitación (aproximadamente 175 ml de volumen total) que contenían 50 ó 150 ml de medio TM3a/glucosa (con 0,1 mg/l de vitamina B12 y antibióticos apropiados) para representar condiciones de medio y bajo oxígeno, respectivamente. Se usaron espectinomicina (50 µg/ml) y
15 ampicilina (100 µg/ml) para la selección de plásmidos basados en pCL1925 y pTrc99a-budABC, respectivamente. La actividad enzimática derivada de pTrc99a-budABC se detectó por ensayo enzimático en ausencia de inductor de IPTG, así, IPTG no se añadió al medio. Los matraces se inocularon a una DO600 inicial de ≤ 0,01 unidades y se incubaron a 34 ºC con agitación a 300 rpm durante 24 h. Los matraces que contenían 50 ml de medio se taparon con tapones ventilados; los matraces que contenían 150 ml se taparon con tapones no ventilados para minimizar el
20 intercambio de aire. Los resultados analíticos para la producción de 2-butanona y de 2-butanol se presentan en la Tabla 8. Ambas cepas de E. coli que comprenden una ruta biosintética del 2-butanol produjeron 2-butanona bajo condiciones de bajo y medio oxígeno y produjeron 2-butanol bajo condiciones de bajo oxígeno, mientras que la cepa de control negativo no produjo niveles detectables de tanto 2-butanona como 2-butanol.
Tabla 8
Producción de 2-butanona y 2-butanol por cepas de E. coli
Cepaa
Volumen, ml 2-Butanona, mM 2-Butanol, mM
Control negativo, MG1655 ΔyqhCD/pCL1925
50 No detectada No detectado
MG1655/pTrc99a-budABC/pCL1 925KoDD-ddr::T5 chnA ter
50 0,33 No detectado
MG1655 ΔyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA ter nº 1
50 0,23 No detectado
MG1655 ΔyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA nº 2
50 0,19 No detectado
Control negativo, MG1655 ΔyqhCD/pCL1925
150 No detectada No detectado
MG1655/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA ter
150 0,41 0,12
MG1655 ΔyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA nº 1
150 0,15 0,46
MG1655 ΔyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA nº 2
150 0,44 0,14
Medio
No detectada No detectado
a nº 1 y nº 2 representan cepas aisladas independientes.
Ejemplo 12
Clonación de amino:piruvato transaminasa (APT)
Una amino:piruvato transaminasa (APT) de JS17 de Vibrio fluvialis se identificó por Shin y col. (Appl. Microbiol
5 Biotechnol. (2003) 61:463-471). Se encontró que la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 122) tenía homología significativa con -aminoácido:piruvato transaminasas (Shin y Kim (J. Org. Chem. 67:2848-2853 (2002)). Se mostró que APT de Vibrio fluvialis tiene actividad de transaminasa hacia acetoína.
Para la expresión de la enzima APT en E. coli se diseñó una región codificante de APT de codones optimizados (SEC ID Nº: 144) usando los codones de E. coli preferidos con consideraciones adicionales tales como equilibrio de
10 codones y estabilidad de ARNm, y se sintetizó (por DNA2.0; Redwood City, CA). El fragmento de ADN de la región codificante se subclonó en el vector pBAD.HisB (Invitrogen) entre los sitios Ncol y HindIII y el plásmido resultante, más adelante denominado pBAD.APT1, se transformó en células TOP10.
Ejemplo 13
Caracterización de la actividad de APT alanina:acetoína aminotransferasa de Vibrio fluvialis
15 Un volumen de 5 ml de caldo LB + 100 µg/ml de ampicilina se inoculó con una colonia nueva de células TOP10/pBAD:APT1. El cultivo se incubó a 37 ºC durante aproximadamente 16 h con agitación (225 rpm). Una alícuota de 300 µl de este cultivo se usó para inocular 300 ml del mismo medio, que se incubó a 37 ºC con agitación (225 rpm). Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 0,8, se añadió L-arabinosa a una concentración final del 0,2 % (p/v). El cultivo se incubó durante 16 h adicionales, luego se recogió. Las células se lavaron una vez con tampón
20 fosfato de potasio 100 mM (pH 7,8) y luego se congelaron y se guardaron a -80 ºC.
Para aislar la enzima, el sedimento de células se descongeló y se resuspendió en 8 ml de tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 7) que contenía etilendiaminatetraacetato 0,2 mM, ditiotreitol 1 mM y 1 comprimido de mezcla de inhibidores de proteasas (Roche; Indianápolis, IN). Las células se lisaron por dos pases a través de una celda de presión francesa a 900 psi, y el lisado resultante se clarificó por centrifugación durante 30 min a 17000 x g. Se 25 añadió sulfato de amonio al 35 % de saturación y la disolución se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, momento en el que los sólidos precipitados se eliminaron por centrifugación (30 min, 17000 x g). Se añadió sulfato de amonio adicional al sobrenadante dando 55 % de saturación, y la disolución se agitó de nuevo durante 30 min a temperatura ambiente. Los sólidos precipitados se eliminaron por centrifugación (30 min, 17000 x g) y luego se resuspendieron en 5 ml de tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 7) que contenía piridoxal 5'-fosfato 10 µM y 30 ditiotreitol 1 mM. Esta disolución se desaló pasando a través de una columna PD10 equilibrada con tampón A
(tampón bis-tris propano 50 mM (pH 6) que contenía piridoxal 5'-fosfato 10 µM y ditiotreitol 1 mM). Entonces, el extracto desalado se cargó sobre una columna Q-Fast Flow de 20 ml pre-equilibrada con tampón A. Se eluyó APT con un gradiente lineal de NaCl 0-0,1 M en tampón A. La enzima se detectó en fracciones eluidas por la presencia de una banda de proteína de tamaño ~50 kD cuando se analizó por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y por la absorbancia característica a 418 nm. Las fracciones que contenían la enzima se eluyeron a NaCl ~ 0,3 M. Estas fracciones se reunieron dando un total de 6 ml de una disolución de 5,45 mg/ml de enzima, que fue >90 % pura, como se juzga por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
La actividad de alanina:acetoína aminotransferasa de APT se ensayó usando un ensayo acoplado a deshidrogenasa láctica. Las mezclas de reacción contuvieron bis-tris propano 100 mM (pH 9,0), piridoxal 5'-fosfato 10 µM, acetoína 0-50 mM, L-alanina 0-5 mM, 0,14 ó 0,28 mg/ml de enzima purificada, NADH 200 µM y 20 U/ml de deshidrogenasa láctica (Sigma; St. Louis, MO). La reacción se siguió midiendo el cambio en absorbancia a 340 nm, indicativo de la oxidación de NADH. Bajo estas condiciones, la kcat/Km para acetoína fue 10 M-1 s-1 y aquella para L-alanina fue 400
M-1-1
s.
La identidad del producto esperado 3-amino-2-butanol se confirmó por comparación con un patrón sintético. Se sintetizó una mezcla de (R,R)-y(S,S)-3-amino-2-butanol mediante el procedimiento de Dickey y col., [J Amer Chem Soc 74:944 (1952)]: 5 g de trans-2,3-epoxibutano se agitaron lentamente en 150 ml de NH4OH frío (4 ºC). La reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente, se tapó y se agitó a temperatura ambiente durante 10 días adicionales. En ese momento, el amoniaco en exceso y el agua y epoxibutano residuales se eliminaron mediante evaporación rotatoria a vacío a 40 ºC. El aceite transparente resultante (2,9 g) se resuspendió en agua a una concentración del 10 % (p/v). La producción del producto deseado se confirmó por análisis de RMN y comparación del espectro con el informado por Levy y col. [Org. Magnetics Resonance 14:214 (1980)]. Se produjo una mezcla de los isómeros (2R,3S)-y (2S,3R) correspondientes usando el procedimiento idéntico con la excepción de que el material de partida fue el isómero cis de 2,3-epoxibutano.
Se desarrolló un procedimiento analítico para la detección de 3-amino-2-butanol basado en el procedimiento de derivatización de o-ftaldialdehído para la determinación de aminoácidos informado por Roth [Anal. Chem. 43:880 (1971)]. Una alícuota de 200 µl de 3-amino-2-butanol 1 mM (mezcla de isómeros) se mezcló con 200 µl de una disolución 50 mM de borato (pH 9,5), a la que se añadieron 10 µl de 5 µl/ml de 2-mercaptoetanol en etanol y 10 µl de 10 mg/ml de o-ftaldialdehído en etanol. La disolución se incubó a temperatura ambiente durante 10 min, momento en el que el derivado se extrajo en 200 µl de hexano. El hexano se separó de la disolución acuosa decantando y se inyectaron 10 µl sobre una columna de HPLC Chiracel OD (Daicel Chemical Industries; Fort Lee, NJ). La columna se ejecutó isocráticamente con una fase móvil de 90:10 de hexano:isopropanol a una tasa de 1 ml/min. Los isómeros derivatizados de 3-amino-2-butanol se detectaron por absorbancia a 340 nm con tiempos de retención de aproximadamente 15,7 y 16,8 min [(2S,3S) y (2R,3R)] y 18,4 y 21,9 min [(2R,3S) y (2S,3R)]. Para diferenciar los enantiómeros en la primera mezcla, el isómero (2R,3R) puro (Bridge Organics; Vicksburg, MI) también se ejecutó bajo condiciones idénticas y se encontró que era el pico de 16,8 min. Para diferenciar los enantiómeros en la segunda mezcla, la mezcla se resolvió primero cinéticamente usando alanina:acetoína aminotransferasa: se incubaron 0,28 mg de enzima purificada con piruvato 10 mM y 3-amino-2-butanol 10 mM [mezcla 1:1 de isómeros (2R,3S) y (2S,3R)] en 1 ml de bis-tris propano 100 mM (pH 9,0). Después de 24 h a temperatura ambiente se tomó una alícuota y se analizó como se ha descrito anteriormente. El análisis reveló que el pico de 18,4 min estaba agotado al 95 %, mientras que el pico de 21,9 min se retenía >90 %. Una alícuota de 100 µl de la mezcla de reacción restante se mezcló con 50 µl de NADH 20 mM y 10 µl de extracto de la cepa TOP10/pTrc99a-BudC descrita en el Ejemplo 9. Se sabe que la enzima BudC reduce (R)-acetoína en meso-2,3-butanodiol y (S)-acetoína en (S,S)-2,3-butanodiol [Ui y col.(2004) Letters in Applied Microbiology 39:533-537]. Después de 3 h se tomaron muestras de la reacción y se analizaron como se ha descrito anteriormente para acetoína y butanodiol. El análisis indicó que el producto primario de la reducción fue meso-2,3-butanodiol, que indica que el producto de la reacción de aminotransferasa fue (R)-acetoína y, por tanto, el isómero de 3-amino-2-butanol consumido era el isómero (2R,3S). Así, el tiempo de retención de 18,4 min puede asignarse a este isómero y 21,9 al isómero (2S,3R).
Para confirmar que el producto de la reacción de alanina:acetoína aminotransferasa catalizada por APT era 3-amino2-butanol, 0,28 mg de enzima purificada se incubaron con acetoína 10 mM, L-alanina 10 mM, 50 U de deshidrogenasa láctica y NADH 200 µM en 1 ml de bis-tris propano 100 mM (pH 9,0). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 20 h, después de lo cual se tomó una alícuota de 200 µl y se derivatizó como se ha descrito anteriormente. Los tiempos de retención de los productos derivatizados fueron 15,8 min (producto principal) y 18,5 min (producto secundario), coincidiendo con los de los patrones de (2S,3S)-y (2R,3S)-3amino-2-butanol.
Ejemplo 14
Identificación y clonación de amino alcohol cinasa y amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
El fin de este ejemplo es describir la identificación y clonación de secuencias que codifican una amino alcohol cinasa y amino alcohol O-fosfato liasa de la bacteria Erwinia carotovora. Estas dos enzimas son parte de la ruta 1 para la conversión de 3-amino-2-butanol en 2-butanona mediante el producto intermedio 3-amino-2-butanol fosfato como se
muestra en la Figura 1.
Predicción de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia
Se han detectado actividades de amino alcohol cinasa y amino alcohol O-fosfato liasa dependientes de ATP en varias especies de Pseudomonas y Erwinia, que incluyen Pseudomonas sp. P6 (NCIB10431), Pseudomonas putida NCIB 10558 (Jones y col. (1973) Biochem. J. 134:167-182), Erwinia carotovora, Erwinia amanas, Erwina mijoiae y Erwinia atroseptica (Jones y col. (1973) Biochem. J. 134:959-968). En estos estudios se mostró que los extractos de las especies anteriores tenían actividad para la conversión enzimática de aminopropanol mediante aminopropanol O-fosfato en propionaldehído, y la conversión de etanolamina mediante etanolamina O-fosfato en acetaldehído.
La secuencia genómica de la cepa de Erwinia atroseptica en la que se informó que existían estas actividades (ahora designadas la cepa SCRI1043 de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (ATCC BAA-672)) se ha determinado en el Instituto Sanger (Bell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (30): 11105-11110). El análisis de las cinasas putativas en el genoma de Erwinia carotovora subsp. atroseptica reveló una secuencia de operón (SEC ID Nº: 275) que codifica una proteína putativa (ECA2059; SEC ID Nº: 124) que es el 39 % idéntica a una homoserina cinasa de Rhizobium loti y una aminotransferasa dependiente de piridoxal fosfato (PLP) putativa de clase III (ECA2060; SEC ID Nº: 126) que es el 58 % idéntica a una aminotransferasa putativa de Rhizobium meliloti. Se esperaba que ECA2059 fuera una amino alcohol cinasa y ECA2060 fuera una amino alcohol O-fosfato liasa que usa PLP como cofactor.
Clonación de la amino alcohol cinasa putativa y amino alcohol O-fosfato liasa putativa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
Se obtuvo ADN genómico de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (ATCC nº: BAA-672D) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). El operón que codifica la amino alcohol cinasa (KA) putativa y la amino alcohol O-fosfato liasa (AT) se llamó KA-AT (SEC ID Nº: 275). Este operón se amplificó a partir del ADN genómico de Erwinia por la ADN polimerasa Phusion (Finnzymes; mediante New England Biolabs; Ipswich, MA) usando los cebadores OT872 (SEC ID Nº: 127) y OT873 (SEC ID Nº: 128). Se obtuvo un fragmento de ADN de 2,4 kb por la reacción de PCR, que se corresponde con el tamaño del operón KA-AT. El producto de PCR se digirió con enzimas de restricción EcoRI y PstI y se clonó en el vector pKK223-3 (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ) que se digirió con las mismas enzimas de restricción. Esto produjo el plásmido pKK223.KA-AT, que contuvo el operón de amino alcohol cinasa-liasa de Erwinia putativa bajo el control del promotor tac. Similarmente se prepararon los plásmidos pKK223.KA y pKK223.AT que pusieron la cinasa putativa de Erwinia y las regiones codificantes de liasa putativa de Erwinia en vectores separados, cada uno bajo el control del promotor tac. Para la clonación por PCR de la región codificante de KA (SEC ID Nº: 123) se usaron los cebadores OT872 (SEC ID Nº: 127) y OT879 (SEC ID Nº: 129); y para la clonación de la región codificante de AT (SEC ID Nº: 125) se usaron los cebadores OT873 (SEC ID Nº: 128) y OT880 (SEC ID Nº: 130) en las amplificaciones por PCR, que generaron productos de PCR de 1,1 kb y 1,3 kb respectivamente. Los productos de PCR se digirieron cada uno con EcoRI y PstI, y se ligaron en el vector pKK223-3 para generar pKK223.KA y pKK223.AT.
Actividad in vivo de la amino alcohol cinasa putativa y amino alcohol O-fosfato liasa putativa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
Los plásmidos pKK223.KA-AT, pKK223.KA, pKK223.AT y pKK223-3 se transformaron en la cepa MG1655 de E. coli. Los transformantes se volvieron a extender sobre una placa de medio mínimo MOPS que contenía 1 % de glucosa, 0,5 % de aminopropanol como única fuente de nitrógeno, IPTG 1 mM y 100 µg/ml de ampicilina. La expresión de genes KA-AT, KA y AT se indujo por IPTG. Una placa de control no tuvo IPTG incluido. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 7 días. Sobre la placa con IPTG, solo la cepa MG1655/pKK223.KA-AT creció, mientras que las otras tres cepas no crecieron. Sobre la placa sin IPTG añadido, la cepa MG1655/pKK223.KA-AT creció, pero las colonias fueron significativamente más pequeñas que aquellas sobre la placa que contenía IPTG, que se corresponde con los menores niveles de expresión de KA y AT en las células sin inducir. Ninguna de las otras tres cepas creció sobre esta placa. Esto indica que la co-expresión de los genes KA y AT de Erwinia putativa proporcionó actividades de enzima suficientes que permitieron a la cepa de E. coli MG1655/pKK223.KA-AT utilizar aminopropanol como única fuente de nitrógeno. La expresión de cada enzima individual de tanto KA como AT no fue suficiente para proporcionar tal actividad enzimática in vivo.
Ejemplo 15
Actividad in vitro de amino alcohol cinasa y amino alcohol O-fosfato liasa putativa de Erwinia
Subclonación del operón KA-AT de Erwinia en el vector pBAD.HisB e inducción de la expresión de proteínas
Los niveles de expresión de proteína de enzimas KA y AT putativas de Erwinia expresadas en células MG1655 del vector pKK223.KA-AT se analizaron por análisis de SDS-PAGE. El nivel de expresión de la enzima AT de Erwinia fue relativamente bajo, con una nueva banda de proteína detectada en el peso molecular correcto de 46 kD en la fracción soluble de un extracto de células, mientras que no se detectó banda de proteína nueva al tamaño predicho para la enzima KA.
En un esfuerzo por mejorar la expresión de los genes KA y AT putativos de Erwinia, el operón KA-AT se subclonó en los sitios EcoRI y HindIII del vector pBAD.HisB-EcoRI. pBAD.HisB-EcoRI se derivó del vector pBAD.HisB (Invitrogen) reemplazando el sitio Ncol en pBAD.HisB con un sitio EcoRI mediante mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) usando los cebadores OT909 (SEC ID Nº 131) y OT91 0 (SEC ID Nº 132). En el plásmido construido pBAD.KA-AT, el operón KA-AT se puso directamente bajo el control del promotor araB (sin marca de His).
El plásmido pBAD.KA-AT se transformó en la cepa TOP90 de E. coli. Un cultivo de 50 ml de la cepa TOP10/pBAD.KA-AT se cultivó a fase semilogarítmica (DO600=0,6) en LB, 100 µg/ml de medio ampicilina a 37 ºC con agitación a 250 rpm. El cultivo se indujo mediante la adición de L-arabinosa a una concentración final del 0,1 % (p/v), y se incubó adicionalmente a 37 ºC durante 5 h antes de la recogida por centrifugación. El sedimento de células se resuspendió en Tris-HCl 50 mM helado, pH 8,0, y se rompió por sonicación sobre hielo con un desmembrador sódico modelo 300 de Fisher (Fisher, Pittsburgh, PA) al 50 % de potencia, repitiendo cuatro ciclos de 30 segundos de sonicación con 60 segundos de descanso entre cada ciclo. Se centrifugó cada muestra sonicada
(15.000 x g, 4 min, 4 ºC). Los extractos libres de células clarificados se analizaron para el nivel de expresión de proteínas y actividad de amino alcohol O-fosfato liasa.
Síntesis química de aminobutanol O-fosfato y aminopropanol O-fosfato
El sustrato (R,R)-3-amino-2-butanol O-fosfato se sintetizó mediante un procedimiento basado en el informado por Ferrari y Ferrari (patente de EE.UU. 2730542 [1956]) para fosfoetanolamina: 10 mmoles de H3PO4 en una disolución acuosa al 50 % (p/v) se mezclaron con una disolución al 50 % (p/v) de (R,R)-3-amino-2-butanol (Bridge Organics; Vicksburg, MI) mientras se agitaba sobre hielo. Después de la mezcla, la disolución se calentó lentamente a temperatura ambiente y luego se agitó a vacío y se calentó a 70 ºC. Después de 1 h a 70 ºC, la temperatura se aumentó lentamente a 185 ºC y se mantuvo allí durante 2 h adicionales. En ese momento, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se liberó el vacío. El material restante se disolvió en agua y el análisis por RMN indicó que el 80 % del material de partida se había convertido en producto quedando el 20 % restante sin reaccionar. No se observaron productos adicionales.
Los sustratos adicionales (2R,3S)-3-amino-2-butanol O-fosfato y (2S,3R)-3-amino-2-butanol O-fosfato se sintetizaron por el mismo procedimiento usando una mezcla 1:1 de (2R,3S)-3-amino-2-butanol y(2S,3R)-3-amino-2-butanol (sintetizada como se ha descrito en el Ejemplo 13) como material de partida. Se sintetizaron DL-1-amino-2-propanol O-fosfato, (S)-2-amino-1-propanol O-fosfato y (R)-2-amino-1-propanol O-fosfato por el mismo procedimiento usando DL-1-amino-2-propanol, (R)-2-amino-1-propanol o (S)-2-amino-1-propanol como material de partida.
Análisis de la actividad de aminopropanol O-fosfato liasa codificada por el operón KA-AT de Erwinia putativa
El ensayo de aminopropanol O-fosfato liasa se realizó como se describe por Jones y col. (1973, Biochem. J. 134:167-182) y G. Gori y col. (1995, Chromatographia 40:336). La formación de propionaldehído a partir de aminopropanol O-fosfato se ensayó colorimétricamente con MBTH, que permite la detección de la formación de aldehído. La reacción se realizó del siguiente modo. En una reacción de 1 ml, 100 µg de extracto sin células de TOP10/pBAD.KA-AT de E. coli se añadieron a DL-1-amino-2-propanol O-fosfato 10 mM en Tris-HCl 100 mM, pH 7,8, con PLP 0,1 mM. La reacción se incubó a 37 ºC durante 10 min y 30 min, tomándose una alícuota de 100 µl de mezcla de reacción en cada momento de tiempo y mezclando con 100 µl de 6 mg/ml de MBTH en glicina-HCl 375 mM, pH 2,7. Esta mezcla se incubó a 100 ºC durante 3 min, se enfrió sobre hielo durante 15-30 s y se añadió 1 ml de 3,3 mg/ml de FeCl3·6H2O (en HCl 10 mM), seguido de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente. La absorbancia de la mezcla de reacción que contenía el aducto de aldehído-MBTH se midió a 670 nm. Los resultados del ensayo se enumeran en la Tabla 9. En presencia del sustrato de fosfato de aminopropanol, PLP y el extracto sin células se detectó la formación de aldehído, como se indica por una Abs670 que era superior a la referencia de control de hasta 0,3. En ausencia de tanto el sustrato como el extracto sin células no se detectó formación de aldehído. En ausencia de PLP añadido se detectó algo menos de cantidad de aldehído, supuestamente debido a la presencia de PLP en el extracto sin células. El extracto sin células del cultivo TOP10/pBAD.KA-AT sin inducir no produjo ningún aldehído detectable en la reacción. Estos resultados indicaron que la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia putativa no cataliza la conversión de aminopropanol O-fosfato en propionaldehído.
Tabla 9 5
Ensayo de aminopropanol O-fosfato liasa. La muestra 1 fue el extracto sin células de un control no inducido de TOP10/pBAD.KA-AT de E. coli. Las muestras 2-5 contuvieron el extracto sin células del cultivo inducido de TOP10/pBAD.KA-AT de E. coli.
Número de muestra
Inducción por 0,1 % de arabinosa Aminopropanol O-fosfato PLP Extracto enzima (100 µg/ml) DO670, 10 min DO670, 30 min
1
sin inducir (+) (+) (+) 0,262 0,255
2
inducido (+) (+) (+) 1,229 2,264
Ensayo de aminopropanol O-fosfato liasa. La muestra 1 fue el extracto sin células de un control no inducido de TOP10/pBAD.KA-AT de E. coli. Las muestras 2-5 contuvieron el extracto sin células del cultivo inducido de TOP10/pBAD.KA-AT de E. coli.
Número de muestra
Inducción por 0,1 % de arabinosa Aminopropanol O-fosfato PLP Extracto enzima (100 µg/ml) DO670, 10 min DO670, 30 min
3
inducido (-) (+) (+) 0,303 0,223
4
inducido (+) (-) (+) 0,855 1,454
5
inducido (+) (+) (-) 0,156 0,065
Análisis de la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia sustrato de aminobutanol O-fosfato
La actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa hacia los sustratos de aminobutanol O-fosfato se estudió bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. La reacción se llevó a cabo a 37 ºC durante la noche en una reacción de 1 ml que contenía 100 µg de extracto sin células de TOP10/pBAD.KA-AT de E. coli, aminobutanol Ofosfato 10 mM (tanto la mezcla de isómeros (R,R) + (S,S) como la mezcla de (R,S) + (S,R) descrita en el Ejemplo 15) en Tris-HCl 100 mM, pH 7,8, con PLP 0,1 mM. Se tomó una alícuota de la mezcla de reacción de 100 µl y el producto 2-butanona se detectó usando el procedimiento de derivatización de MBTH descrito en Procedimientos generales. Se observaron dos picos que representaban los isómeros de 2-butanona derivatizados. Por tanto, la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia es una aminobutanol fosfato fosfo-liasa, además de una aminopropanol fosfato fosfo-liasa.
Análisis de la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia estereoisómeros de aminopropanol Ofosfato y aminobutanol O-fosfato
La actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia diversos estereoisómeros de aminopropanol Ofosfato y aminobutanol O-fosfato se estudió bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. En presencia de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia, tanto (R) como (S)-2-amino-1-propanol O-fosfato se convirtieron en propanona por la enzima, pero el rendimiento del producto fue mucho mayor con el isómero (S). La enzima también produjo butanona a partir de ambas mezclas de isómeros de 3-amino-2-butanol O-fosfato, con un mayor rendimiento de producto encontrado en la reacción que contiene los isómeros de sustrato (R,S) y (S,R). Tanto los productos de propanona como de butanona se derivatizaron por MBTH y se detectaron por HPLC como se describe en Procedimientos generales.
Optimización del nivel de expresión génica para la amino alcohol cinasa y amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia
Con el fin de mejorar los niveles de expresión para la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia en E. coli, regiones codificantes de codones optimizados para ambas enzimas (llamadas EKA: SEC ID Nº: 155 y EAT: SEC ID Nº: 156 respectivamente) se sintetizaron por DNA2.0 (Redwood City, CA). Cada región codificante se sintetizó con colas de 5' y 3' que incluyen sitios de restricción para la clonación: EKA tiene sitios Bbsl en 5' y EcoRI, HindIII en 3'; EAT tiene sitios EcoRI en 5' y HindIII en 3'. Las regiones codificantes EKA y EAT se proporcionaron a partir de DNA2.0 como plásmidos pEKA y pEAT, que estuvieron en el vector pJ51 de DNA2.0. La región codificante optimizada para EKA se subclonó ligando un fragmento digerido con Bbsl y HindIII de pEKA en el vector pBAD.HisB entre los sitios NcoII y HindIII, para generar el plásmido pBAD.EKA. En el plásmido resultante la región codificante está 5' con respecto a la marca de His, de manera que una región codificante para una marca de His6 del extremo N fusionada con la amino alcohol cinasa de Erwinia se construyó realizando una reacción de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange usando los cebadores SEC ID Nº: 157 y SEC ID Nº: 158 para generar el vector pBAD.His-EKA.
pBAD.His-EKA se transformó en la cepa BL21AI de E. coli (F ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA; Invitrogen) para producir la cepa BL21Al/pBAD.HisA-EKA. Se cultivó un cultivo de 50 ml de BL21Al/pBAD.HisA-EKA a la fase semilogarítmica (DO600=0,6), se indujo con 0,1 % de arabinosa y adicionalmente se incubó a 30 ºC durante la noche. Los extractos libres de células se prepararon por sonicación. La proteína de fusión marcada con His6 de amino alcohol cinasa de Erwinia se purificó usando el sistema de purificación ProBond™ (Invitrogen) bajo condiciones de purificación no desnaturalizantes siguiendo las instrucciones de fabricación.
Resultado profético
La actividad de cinasa de la amino alcohol cinasa de Erwinia marcada con His6 se analiza por el ensayo ADP Quest(DiscoveRx, Fremont, CA) siguiente las instrucciones de fabricación. Éste es un ensayo bioquímico que mide la acumulación de ADP, un producto de la reacción de amino alcohol cinasa usando tanto aminopropanol como aminobutanol como sustrato. Se mezcla sustrato 10 mM con amino alcohol cinasa de Erwinia marcada con His6, en Tris-HCl 100 mM, pH 7,8, MgCl2 10 mM, KCI 2 mM, ATP 0,1 mM, y se incuba a 37 ºC durante 1 h en una reacción de 0,2 ml. Se añaden reactivo A de ADP (100 µl) y reactivo B de ADP (200 µl) y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 min. La señal de fluorescencia que indica actividad se mide con longitud de onda de excitación
de 530 nm y longitud de onda de emisión de 590 nm.
Ejemplo 16
Expresión de la ruta 3 entera
Construcción del vector pCLBudAB-ter-T5chnA
El vector pTrc99a::BudABC (descrito en el Ejemplo 9) se digiere con EcoRI, y el ADN se trata con ADN polimerasa de Klenow para hacer romos los extremos. El vector romo se digiere posteriormente con Spel dando un fragmento de 2,5 kb que contiene los genes budA y budB. El vector pCL1925-ter-T5chnA (descrito en el Ejemplo 9) se digiere con Hindlll, y el ADN se trata con ADN polimerasa de Klenow para hacer romos los extremos. El vector romo se digiere posteriormente con Xbal dando un fragmento de 4,6 kb que luego se liga al fragmento budAB de pTrc99a::BudABC. El plásmido resultante, designado pCLBudAB-ter-T5chnA, se usa para transformar células Top10 de E. coli, y las colonias individuales se criban para la apropiada estructura por PCR del plásmido usando los cebadores pCL1925vecF (SEC ID Nº: 62) y N84seqR3 (SEC ID Nº: 159). El plásmido se prepara a partir de una única colonia que da un producto de PCR del tamaño esperado de 1,4 kB.
Construcción del vector pKK223.KA-AT-APT
El gen APT se amplifica a partir del vector pBAD.APT (descrito en el Ejemplo 12) por PCR usando los cebadores APTfor (SEC ID Nº: 162; 5' incluye RBS y sitio SmaI) y APTrev (SEC ID Nº: 163; 3' añade el sitio Smal). El producto del tamaño esperado de 1,7 kpb se purifica en gel y se digiere con Smal dando extremos romos. El vector pKK223.KA-AT (descrito en el Ejemplo 14) se digiere con PstI, y el ADN se trata con ADN polimerasa de Klenow para hacer romos los extremos. El fragmento de ADN resultante se liga con el producto de PCR digerido con Smal, y el producto de ligación se usa para transformar células Top10 de E. coli. Se criban colonias resistentes a ampicilina individuales por PCR usando los cebadores OT872 (SEC ID Nº: 127) y APTrev (SEC ID Nº: 163). La presencia de un producto de PCR del tamaño esperado de 4,1 kpb indica que el gen que codifica APT está presente y orientado en la misma dirección que los genes que codifican KA y AT. La secuencia del inserto se verifica usando los cebadores APTseqRev (SEC ID Nº: 160) y APTseqFor (SEC ID Nº: 161). Este plásmido se llama pKK223.KA-AT-APT. La expresión apropiada de los tres genes se verifica cultivando un cultivo de 5 ml de Top10/pKK223.KA-AT-APT en LB
+ 100 µg/ml de ampicilina a 37 ºC con agitación. Cuando la DO600 alcanza ~0,8, la expresión de los genes sobre el plásmido se induce mediante la adición de IPTG a 0,4 mM. La expresión se evalúa por SDS-PAGE y ensayos de actividad como se han descrito anteriormente.
Construcción de la cepa de producción de 2-butanol y la producción de 2-butanona y 2-butanol
La cepa MG1655 de E. coli se transforma con tanto pKK223.KA-AT-APT como pCLBudAB-ter-T5chnA, y los transformantes se seleccionan para resistencia a ampicilina y espectinomicina, indicativo de la presencia de los plásmidos. Las células se inoculan en matrices con agitación (aproximadamente 175 ml de volumen total) que contienen 50 ó 150 ml de medio TM3a/glucosa (con antibióticos apropiados) para representar condiciones de medio y bajo oxígeno, respectivamente. Se añade IPTG a 0,4 mM para inducir la expresión de genes de pKK223.KA-AT-APT. Como control negativo, células MG1655 se cultivan en el mismo medio que carece de antibióticos. Los matraces se inoculan a una DO600 inicial de ≤ 0,01 y se incuban a 34 ºC con agitación a 300 rpm durante 24 h. Los matraces que contienen 50 ml de medio se tapan con tapones ventilados; los matraces que contienen 150 ml se tapan con tapones no ventilados para minimizar el intercambio de aire. La cepa MG1655/pKK223.KA-ATAPT/pCLBudAB-ter-T5chnA que comprende una ruta biosintética del 2-butanol produce tanto 2-butanona como 2butanol bajo condiciones de bajo y medio oxígeno mientras que la cepa de control negativo no produce niveles detectables de tanto 2-butanona como 2-butanol.
Ejemplo 17
Caracterización de la actividad de glicerol deshidratasa / butanodiol deshidratasa
La glicerol deshidratasa (E.C. 4.2.130) y la diol deshidratasa (E.C. 4.2.128), aunque están estructuralmente relacionadas, frecuentemente se distinguen en la materia basándose en diversas diferencias que incluyen especificidad por sustrato. Este ejemplo demuestra que la glicerol deshidratasa convierte meso-2,3-butanodiol en 2butanona. La cepa KLP23/pSYC012 de E. coli recombinante, que comprende los genes Klebsiella pneumoniae que codifican las múltiples subunidades de glicerol deshidratasa (alfa: SEC ID Nº: 145 (región codificante) y 146 (proteína); beta: SEC ID Nº: 147 (región codificante) y 148 (proteína); y gamma: SEC ID Nº: 149 (región codificante) y 150 (proteína)) y los genes Klebsiella pneumoniae que codifican las múltiples subunidades de glicerol deshidratasa reactivasa (subunidad grande, SEC ID Nº: 151 (región codificante) y 152 (proteína); y subunidad pequeña, SEC ID Nº: 153 (región codificante) y 154 (proteína)), se describe en Emptage y col., documento US 6.514.733 y en el documento WO 2003089621. Se preparó extracto sin células en bruto de KLP23/pSYCO12 mediante procedimientos conocidos para un experto en la materia. El ensayo de enzimas se realizó en ausencia de luz en tampón HEPES 80 mM, pH 8,2 a 37 ºC con coenzima B12 12 µM y meso-2,3-butanodiol 10 mM. La formación de 2-butanona se monitorizó por HPLC (columna SH-1011 y precolumna SH-G Shodex con detección del índice de refracción; H2SO4 0,01 M como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min y una temperatura de la columna de 50 ºC; tiempo de
retención de 2-butanona = 40,2 min). Se determinó que la tasa de formación de 2-butanona por la preparación de glicerol deshidratasa era 0,4 nmol/min/mg de proteína en bruto.
Ejemplo 18
Análisis estructural de diol/glicerol deshidratasas mediante generación y validación de un perfil HMM para diol/glicerol deshidratasas experimentalmente comprobadas
Las enzimas diol deshidratasa y glicerol deshidratasa pertenecen a las clases de enzimas 4.2.128 y 4.2.130, respectivamente. Las enzimas en ambas clases son cada uno un complejo de tres subunidades: grande (también llamada alfa), mediana (también llamada beta) y pequeña (también llamada gamma). En algunas glicerol deshidratasas se encontró que las subunidades grande y mediana estaban fusionadas.
Identificación de miembros de la familia por secuencia
Se usó la enzima butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como enzima prototipo para identificar una familia de enzimas diol y glicerol deshidratasa. Las secuencias de aminoácidos de las subunidades alfa (GenBank nº: BAA08099; SEC ID Nº: 8), beta (GenBank nº: BAA08100; SEC ID Nº: 10) y gamma (GenBank nº: BAA08101; SEC ID Nº: 12) se ejecutaron cada una como la secuencia de consulta en una búsqueda de BLASTp contra la base de datos de proteínas no redundante GenBank usando parámetros por defecto. Se extrajeron secuencias con coincidencias relevantes. La relevancia se juzgó por la puntuación del valor E, definición de proteínas, detalles incluidos en el informe de GenBank para las proteínas coincidentes y la bibliografía revisada del tópico. Para la subunidad grande, la salida de BLAST mostró una súbita disminución en el valor de E de e-20 a un valor de E de 1,5. Todas las coincidencias de secuencias con un valor de E de 1,5 o mayor tuvieron definiciones incoherentes con ellas, siendo deshidratasas. Muchas de estas secuencias se marcaron como subunidades beta de ARN polimerasa dirigidas al ADN. Hubo coincidencias con valores de E de aproximadamente e-20, que fueron secuencias parciales. Se incluyeron secuencias sin anotación si el valor de E fue inferior a 1,5.
Usando la subunidad alfa de butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como consulta se identificaron 50 homólogos como miembros de esta familia de proteínas. Este grupo incluyó algunas secuencias que no eran proteínas de longitud completa. Las secuencias de longitud completa identificadas para la familia de la subunidad alfa de diol/glicerol deshidratasas son el prototipo SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259. SEC ID Nº: 233, 235, 237, 239, 241, 246, 247 incluyen tanto las subunidades alfa como beta, que están fusionadas en estos casos.
Usando la subunidad beta de butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como consulta se identificaron 51 homólogos como miembros de esta familia de proteínas. Este grupo incluyó algunas secuencias que no eran proteínas de longitud completa. Las secuencias de longitud completa identificadas para la familia de la subunidad beta de diol/glicerol deshidratasas son el prototipo SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167.
Usando la subunidad gamma de butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como consulta se identificaron 48 homólogos como miembros de esta familia de proteínas. Este grupo incluyó algunas secuencias que no eran proteínas de longitud completa. Las secuencias de longitud completa identificadas para la familia de la subunidad gamma de diol/glicerol deshidratasas son el prototipo SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274.
Identificación de miembros de la familia con función experimentalmente evaluada
Para cada secuencia identificada mediante el análisis descrito anteriormente se realizó una búsqueda de pruebas experimentales de su función bioquímica en las bases de datos BRENDA, UniProt y NCBI Entrez. BRENDA es una base de datos organizada por ser humano que contiene información detallada sobre cinética de las enzimas, propiedades físicas y bioquímicas extraídas de la bibliografía experimental y con enlaces a las bases de datos relevantes (Centro de Bioinformática de la Universidad de Colonia). UniProt Knowledgebase está compuesta por una parte organizada por ser humano, la base de datos Swiss-Prot y por un suplemento anotado a máquina, la base de datos TrEMBL. La base de datos Swiss-Prot organizada (Instituto Suizo de Bioinformática) proporciona un alto nivel de anotación de proteínas que incluye arquitectura de dominios, modificaciones post-traduccionales y variantes de secuencia. NCBI Entrez es la búsqueda basada en texto integrada y el sistema de recuperación usado en NCBI (Centro Nacional para Información Biotecnológica, Bethesda, MD) para las principales bases de datos, que incluyen PubMed, Nucleotide and Protein Sequences, Protein Sequences, Complete Genomes y Taxonomy.
Mediante el análisis de información y referencias identificadas de estas bases de datos se identificaron ocho diol/glicerol deshidratasas con función experimentalmente verificada como diol o glicerol deshidratasa. Éstas se facilitan en la Tabla 10.
Tabla 10
Diol/glicerol deshidratasas con función experimentalmente verificada
organismo
subunidad Genbank nº SEC ID Nº tipo referencia
Klebsiella oxytoca
grande gi|6980836 8 diol Shibata y col., Structure 1999; 7:997-1008
K. oxytoca
mediana gi|6980837 10 diol
K. oxytoca
pequeña gi|6980838 12 diol
Klebsiella pneumoniae
grande gi|4063702 105 diol Tobimatsu y col., 1998; Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:1774-1777
K. pneumoniae
mediana gi|94470233 107 diol
K. pneumoniae
pequeña gi|4063704 109 diol
Clostridium pasteurianum
grande gi|3360389 135 glicerol Macis y col., FENS Microbiol Lett. 1998; 164(1):21-8
C. pasteurianum
mediana gi|3360390 136 glicerol
C. pasteurianum
pequeña gi|3360391 137 glicerol
Escherichia blattae
grande gi|60099613 138 glicerol Sönke y col., J. de Mol. Micro. y Biotech. 2004; 8:150-168
E. blattae
mediana gi|57340191 139 glicerol
E. blattae
pequeña gi|57340192 140 glicerol
Klebsialla pneumoniae
grande gi|24158719 146 glicerol Willard, Thesis (1994), U of Wisconsin-Madison
K. pneumoniae
mediana gi|24158720 148 glicerol
K. pneumoniae
pequeña gi|24158721 150 glicerol
Citrobacter freundii
grande gi|169287 141 glicerol Seyfried, Gottstiza; J. Bacteriol. 178:5793-5796 (1996)
C. freundii
mediana gi|1229154 142 glicerol
C. freundii
pequeña gi|1229155 143 glicerol
Lactobacillus brevis
grande gi|116334196 164 diol Schuetz y Radler 1984; Arch. Microbiol). 139, 366-370
L. brevis
mediana gi|116334195 165 diol
L. brevis
pequeña gi|16334194 166 diol
Lactobacillus collinoides
grande gi|18857678 99 diol Sauvageot y col., 2002; Eur J Biochem. 269(22):5731-7.
L. collinoides
mediana gi|18857679 101 diol
L. collinoides
pequeña gi|18857680 103 diol
El conjunto de 8 secuencias de aminoácidos de cada subunidad de diol/glicerol deshidratasas con función experimentalmente determinada, enumerado en la Tabla 10, se comparó haciendo un alineamiento múltiple de secuencias usando ClustalW con parámetros por defecto. El % de identidad para las secuencias de subunidad 5 grande osciló del 97,6 % al 58,4 %. El % de identidad para las secuencias de subunidad mediana osciló del 89,5 % al 41,7 %. El % de identidad para las secuencias de subunidad pequeña osciló del 83,3 % al 36,4 %. Así, la cantidad de identidad de secuencias entre algunas secuencias de subunidad fue muy baja (tal como 36,4 %, 41,7 %) aún cuando se sabía que estas subunidades eran componentes de enzimas conocidos por datos experimentales que realizaban la misma función. El bajo nivel de % de identidad de secuencias hizo poco práctico usar este criterio para
10 correlaciones estructura/función.
Relación de secuencias de diol/glicerol experimentalmente verificado
Deshidratasas con respecto a otras diol/glicerol deshidratasas
Para realizar este análisis, secuencias altamente redundantes que son >95 % idénticas se eliminaron del conjunto de secuencias para subunidades grandes, medianas o pequeñas, excepto que se retuvieran todas las secuencias de 15 función experimentalmente verificada. También se eliminaron las secuencias de proteínas truncadas o parciales. Se realizó un alineamiento múltiple de secuencias en las restantes secuencias usando ClustalW con parámetros por defecto. El % de identidad para las subunidades grandes osciló del 97,6 % (el mayor % es de secuencias múltiples experimentalmente verificadas) al 42,8 %. El % de identidad para las subunidades medianas osciló del 91,9 % al 26,4 %. El % de identidad para las subunidades pequeñas osciló del 85,2 % al 20,5 %. Estos % de identidades son
intervalos similares a los % de identidades para las secuencias experimentalmente verificadas.
Basándose en los alineamientos múltiples de secuencias se construyeron árboles filogenéticos usando el algoritmo de unión de vecinos (como se ha implementado en el paquete de software MEGA versión 3.1; Kumar y col., 2004 Briefings in Bioinformatics 5:150-163.) Los árboles filogenéticos se muestran en las Figuras 2 (subunidad grande), 3 (subunidad mediana) y 4 (subunidad pequeña), con las identidades de las secuencias mapeadas enumeradas en una clave para cada figura. Como se observa de las posiciones marcadas para las secuencias de función experimentalmente verificada (en círculos grises oscuros y claros para diol deshidratasa y glicerol deshidratasa, respectivamente), estas secuencias se extienden sobre la mayoría del árbol. Sin embargo, cada árbol incluye una rama con miembros no experimentalmente verificados, pero que parece que pertenece a la familia de diol/glicerol deshidratasa.
Construcción de un perfil de modelo oculto de Markov (HMM) de la familia de diol/glicerol deshidratasa basado en los conjuntos de ocho secuencias de subunidad
Se realizó una caracterización de estructura/función alternativa de los conjuntos de subunidades de la familia diol/glicerol deshidratasa de enzimas usando el paquete de software HMMER (la teoría tras los perfiles HMM se describe en R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh y G. Mitchison, Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh y col., 1994; J. Mol. Biol. 235:1501-1531), siguiendo la guía de usuario que está disponible de HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA).
Cada conjunto de 8 secuencias de aminoácidos para las subunidades grandes, medianas y pequeñas de diol/glicerol deshidratasas funcionalmente caracterizadas (en la Tabla 10) se analizó por separado usando el programa de software HMMER. La salida del programa de software HMMER es un perfil de modelo oculto de Markov (HMM) que caracteriza las secuencias de entrada. Como se ha establecido en la guía de usuario, el perfil d HMM son modelos estadísticos de alineamientos múltiples de secuencias. Capturan información específica de la posición sobre cómo de conservada está cada columna del alineamiento y qué residuos de aminoácidos son lo más probables que se produzcan en cada posición. Así, los HMM tienen una base probabilística formal. Los perfiles HMM para un gran número de familias de proteínas están públicamente disponibles en la base de datos PFAM Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA).
Cada perfil HMM se construyó del siguiente modo:
Etapa 1. Construcción de un alineamiento de secuencias
Las ocho secuencias para la subunidad grande de las diol/glicerol deshidratasas funcionalmente verificadas (SEC ID Nº: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164) se alinearon usando Clustal W con parámetros por defecto. Se hizo lo mismo para el conjunto de secuencias de la subunidad mediana (SEC ID Nº: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165) y el conjunto de secuencias de la subunidad pequeña de (SEC ID Nº: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166).
Etapa 2. Construcción de un perfil HMM
Se ejecutó el programa hmmbuild en cada conjunto de las secuencias alineadas usando parámetros por defecto. hmmbuild lee el archivo de alineamiento múltiple de secuencias, construye un nuevo perfil de HMM y guarda el perfil HMM en el archivo. Usando este programa se generó un perfil no calibrado de los alineamientos múltiples para cada conjunto de secuencias de subunidad descritas anteriormente.
La siguiente información basada en la guía de usuario del software HMMER da alguna descripción de la forma en la que el programa hmmbuild prepara un perfil HMM. Un perfil HMM puede modelar alineamientos con huecos, por ejemplo, que incluyen inserciones y deleciones, que permite que el software describa un dominio conservado completo (en vez de solo un pequeño dominio con huecos). Las inserciones y deleciones se modelan usando estados de inserción (I) y estados de deleción (D). Todas las columnas que contienen más de una cierta fracción x de caracteres de hueco se asignarán como una columna de inserción. Por defecto, x se fija a 0,5. Cada estado de coincidencia tiene un estado de I y D asociado a él. HMMER llama a un grupo de tres estados (M/D/I) en la misma posición consenso en el alineamiento un “nodo”. Estos estados están conectados entre sí con flechas llamadas probabilidades de transición de estados. Los estados M y I son emisores, mientras que los estados D son silenciosos. Las transiciones se disponen de manera que en cada nodo tanto se use el estado M (y un residuo está alineado y puntuado) como se use el estado D (y ningún residuo está alineado, produciendo un carácter de hueco de deleción, '-'). Las inserciones se producen entre nodos, y los estados I tienen una transición propia, permitiendo que se produzcan uno o más residuos insertados entre columnas consenso.
Las puntuaciones de residuos en un estado coincidente (es decir, puntuaciones de emisión de estado coincidente), o en un estado insertado (es decir, puntuaciones de emisión de estado insertado) son proporcionales a Log_2 (p_x) / (null_x). En la que p_x es la probabilidad de que un residuo de aminoácido, en una posición particular en el alineamiento, según el perfil HMM y null_x es la probabilidad según el modelo Null. El modelo Null es un modelo probabilístico de un estado simple con conjunto precalculado de probabilidades de emisión para cada uno de los 20 aminoácidos derivados de la distribución de aminoácidos en la publicación 24 de SWISSPROT.
Las puntuaciones de transición de estados también se calculan como parámetros de logaritmos de las probabilidades y son proporcionales a Log_2 (t_x). En la que t_x es la probabilidad de pasar a un estado emisor o no emisor.
Etapa 3. Calibrar el perfil HMM
Cada perfil HMM se leyó usando hmmcalibrate que puntúa un gran número de secuencias aleatorias sintetizadas con el perfil (el número por defecto de secuencias de sintéticas usadas es 5.000), se ajusta a una distribución de valores extremos (EVD) en el histograma de aquellas puntuaciones y vuelve a guardar el archivo de HMM ahora que incluye los parámetros de EVD. Estos parámetros de EVD ( y ) se usan para calcular los valores de E de puntuaciones de bit cuando el perfil se busca por comparación con una base de datos de secuencias de proteínas. hmmcalibrate escribe dos parámetros en el archivo HMM sobre una línea marcada “EVD”: estos parámetros son los parámetros  (localización) y  (escala) de una distribución de valores extremos (EVD) que se ajusta mejor a un histograma de puntuaciones calculadas en secuencias generadas aleatoriamente de aproximadamente la misma longitud y composición de residuos que SWISS-PROT. Esta calibración se hizo una vez para cada perfil HMM.
Los perfiles HMM calibrados para la subunidad grande, subunidad mediana y la subunidad pequeña de conjuntos de secuencias se proporcionan en el apéndice como los diagrama de Excel de perfil HMM alfa, perfil HMM beta y perfil HMM gamma. Cada perfil HMM se proporciona en un diagrama que da la probabilidad de que cada aminoácido se produzca en cada posición en la secuencia de aminoácidos. La mayor probabilidad está resaltada para cada posición. La Tabla 11 muestra algunas líneas del perfil HMM preparado para las subunidades grandes de diol/glicerol deshidratasas con función experimentalmente verificada.
Tabla 11
Una porción de la subunidad grande del perfil HMM
Los aminoácidos se representan por el código de una letra.
La primera línea para cada posición informa de las puntuaciones de emisión coincidentes: probabilidad de que cada aminoácido esté en ese estado (se resalta la mayor puntuación). La segunda línea informa de las puntuaciones de emisión insertadas y la tercera línea informa de las puntuaciones de transiciones de estados: M→M, M→I, M→D; I→M, I→I; D→M, D→D; B→M; M→E.
La Tabla 11 muestra que para las subunidades grandes, la metionina tiene una probabilidad de 4141 de estar en la primera posición, la mayor probabilidad que está resaltada. En la segunda posición la lisina tiene la mayor probabilidad, que es 1954. En la tercera posición la arginina tiene la mayor probabilidad, que es 3077.
Etapa 4. Prueba de la especificidad y sensibilidad de los perfiles HMM construidos
Cada perfil HMM se evaluó usando hmmsearch, que lee un perfil HMM de hmmfile y busca un archivo de secuencias para coincidencias de secuencias significativamente similares. El archivo de secuencias buscado fue la base de datos de proteínas no redundantes GenBank. El tamaño de la base de datos (parámetro Z) se fijó a 1 billón. Este parámetro de tamaño garantiza que valores de E significativos contra la actual base de datos seguirán siendo significativos en el futuro predecible. El corte del valor E se fijo en 10.
Los perfiles HMM para las subunidades grandes, medianas y pequeñas de diol/glicerol deshidratasas con función experimentalmente verificada fueron específicos porque solo se recuperaron subunidades de diol/glicerol deshidratasa, como se indica por la anotación de las secuencias coincidentes, y sensibles porque se recuperaron incluso secuencias parciales de subunidades de diol/glicerol deshidratasa. Cada una de las secuencias recuperadas tuvo un valor de E de 0,01 o menos.
Todas las secuencias en los árboles filogenéticos en las Figuras 2, 3 y 4 se recuperaron en la coincidencia de perfiles HMM. Se hicieron coincidir todas las secuencias en las ramas de los árboles que no contenían secuencia
con función experimentalmente verificada. Así todas las diol y glicerol deshidratasas se ligaron a las 8 diol y glicerol deshidratasas con función experimentalmente verificada mediante coincidencia con los perfiles HMM para las subunidades grandes, medianas o pequeñas de las enzimas. Las subunidades de diol y glicerol deshidratasa de longitud completa que coinciden con los perfiles HMM tienen las siguientes SEC ID Nº:
Subunidades grandes (alfa): 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259.
Subunidades grandes + medianas fusionadas (la porción de subunidad grande y subunidad mediana coinciden con el perfil grande y el perfil mediano, respectivamente): 233, 235, 237, 239, 241, 246 y 247.
Subunidades medianas (beta): 10, 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167.
Subunidades pequeñas (gamma): 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199,202,205,208,211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274.
Este análisis muestra que el perfil HMM para cada subunidad, que se preparó usando secuencias con función experimentalmente verificada, proporciona una estructura que está ligada a la función de enzimas diol/glicerol deshidratasa. La coincidencia de todas las secuencias anteriores con los perfiles HMM proporciona a su vez un enlace de estructura/función para estas secuencias.
Ejemplo 19
Expresión recombinante de una diol deshidratasa independiente de B12 para la conversión de 2,3-butanodiol en 2butanona
Las secuencias que codifican una propanodiol deshidratasa independiente de B12 putativa (dependiente de Sadenosilmetionina (SAM)) (SEC ID Nº: 277) y su reactivasa asociada putativa (SEC ID Nº: 279) en la bacteria Roseburia inulinivorans (Scott y col. (2006) J. Bacteriol, 188:4340-9), denominada más adelante rdhtA y rdhtB, respectivamente, se sintetizaron como un fragmento de ADN (SEC ID Nº: 284) mediante procedimientos convencionales y se clonaron en un vector de E. coli (por DNA2.0, Inc., Menlo Park, CA). El clon resultante se llamó pJ206::rdhtAB. El fragmento de ADN sintético también contuvo un sitio de unión a ribosoma consenso 5' de la región codificante de rdhtA y sitios de restricción terminales reconocidos por BamHI (extremo 5') y SalI (extremo 3'). El fragmento de ADN se transfirió a pTrc99a (Amann y col. (1988) Gene 69:301-315) entre el promotor Trc y la secuencia de terminación de rrnB para la expresión en E. coli como un operón de rdhtAB. La construcción sintética (aproximadamente 150 ng) y el vector pTrc99a (aproximadamente 50 ng) se digirieron con BamHI y SalI y se ligaron para formar pTrc99a::rdhtAB, que se usó para transformar células TOP10 de E. coli. La estructura del plásmido se verificó por cribado por PCR usando los cebadores Trc99a_For y Trc99a_Rev (proporcionados como SEC ID Nº: 285 y 286), y entonces el plásmido se usó para transformar la cepa MG1655 de E. coli (cepa tipo, ATCC47076). La cepa resultante (MG1655/pTrc99a::rdhtAB) se probó para su capacidad para metabolizar 1,2-propanodiol (5 g/l) durante el crecimiento en medio mínimo M9 (Davis y col., 1980, A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) complementado con 2 g/l de extracto de levadura y 50 µg/ml de ampicilina. Los cultivos (40 ml en viales de suero de 50 ml tapados con tapones de goma encajados mantenidos por plegado con aluminio) se incubaron a 37 ºC. El propionaldehído, el producto esperado de la deshidratación del 1,2-propanodiol, y sus metabolitos relacionados propanol y propionato, se identificaron en los sobrenadantes de cultivo por el procedimiento de HPLC descrito en Procedimientos generales dando los siguientes tiempos de retención: propionaldehído 32,6 min; propanol 38,4 min; y propionato 26,6 min; confirmando que la expresión de los genes rdhta y RdhtB proporciona actividad de 1,2-propanodiol deshidratasa.
Después de confirmarse la función de la RdhtAB diol deshidratasa con el sustrato fisiológico propuesto, la actividad in vivo se probó contra dos isómeros de 2,3-butanodiol: meso-BDO y (2S,3S)-(+)-BDO bajo las mismas condiciones de cultivo que se han descrito anteriormente, con cualquiera de los isómeros BDO suministrados a 5 g/l. A las 24 horas, las muestras de sobrenadante se recogieron y se analizaron por HPLC, y se identificó 2-butanona en el cultivo que contenía meso-2,3-BDO, pero no en el cultivo que contenía (+)-2,3-BDO o en cultivos de control de cepas que no contenían el operón de rdhtAB. Estos datos demostraron que esta enzima independiente de B12 es una butanodiol deshidratasa.
Ejemplo 20
Construcción de una cepa de E. coli productora de 2-butanol
El vector pCL1925-ter (descrito en el Ejemplo 9 anterior) se linealizó por digestión con restricción con HindIII, se trató con el fragmento de Klenow de ADN polimerasa (New England Biolabs, Beverly MA, nº de cat. M0210) y se digirió con XhoI. El fragmento de 4,6 kb resultante se trató entonces con fosfatasa alcalina (New England Biolabs, nº de cat. M0290). Se preparó un fragmento del gen rdhtAB digiriendo primero pJ206::rdhtAB, descrito en el Ejemplo 19, con
BamHI y luego tratando con fragmento de Klenow. El producto se digirió con SalI y el fragmento de rdhtAB de 3,4 kb se aisló por purificación en gel. Los fragmentos de 3,4 kb y 4,6 kb se ligaron para generar pCL1925::rdhtAB, y este plásmido se usó para transformar células químicamente competentes TOP10 de E. coli (Invitrogen, nº de cat. C404003) según las instrucciones del fabricante. En esta construcción, el operón de rdhtAB se expresa a partir del promotor de glucosa isomerasa. Las colonias transformadas (obtenidas por selección con espectinomicina) se cribaron por PCR usando los cebadores N712 y N713 (SEC ID Nº: 287 y 288). Se preparó el plásmido verificado (pCL1925::RdhtAB) y se transfirió a MG1655 de E. coli por electroporación y la cepa resultante se llamó MG1655/pCL1925:rdhtAB. La actividad in vivo de la diol deshidratasa se confirmó en esta cepa como se ha descrito en el Ejemplo 19.
Se construyó un segundo plásmido para codificar los genes restantes necesarios para la producción de 2-butanol a partir de glucosa. Primero, un fragmento de ADN que codifica una butanol deshidrogenasa (sadB; proteína de SEC ID Nº: 289) de Achromobacter xylosoxidans (desvelada en la solicitud de patente de EE.UU. del mismo solicitante y en tramitación junto con la presente CL3926) se clonó en pTrc99a. La región codificante (SEC ID Nº: 290) se amplificó usando condiciones convencionales de ADN genómico de A. xylosoxidans, preparado usando un kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Mineápolis, MN; número de catálogo D-5500A) siguiendo el protocolo recomendado para organismos Gram-negativos usando los cebadores directos e inversos N473 y N469 (SEC ID Nº: 291 y 292), respectivamente. El producto de PCR se clonó con TOPO-Blunt en PCR4 BLUNT (Invitrogen) para producir pCR4Blunt:sadB, que se transformó en células Mach-1 de E. coli. El plásmido se aisló posteriormente de cuatro clones, y se verificó la secuencia. Entonces, el plásmido se digirió con EcoRI, liberando el fragmento sadB, que se ligó con pTrc99a digerido con EcoRI (véase el Ejemplo 19) para generar pTrc99a:sadB. El gen sadB se añadió a pTrc99a::budABC (descrito en el Ejemplo 9) digiriendo pTrc99a:budABC y pTrc99a:sadB con EcoRI y luego ligando el fragmento de sadB con pTrc99a:budABC linealizado, dando pTrc99a:sadBbudABC.
Ejemplo 21
Producción de 2-butanol por cepa de E. coli recombinante que expresa diol deshidratasa independiente de B12
El plásmido pTrc99a:sadBbudABC (descrito en el Ejemplo 20) se usó para transformar MG1655/pCL1925:rdhtAB de
E. coli (descrito en el Ejemplo 20) para generar MG1655/pCL1925:rdhtAB/pTrc99aaadBbudABC, una cepa que contiene todos los genes requeridos para la producción de 2-butanol a partir de glucosa. La cepa se cultivó en 25 ml de medio M9 + 2 g/l de extracto de levadura + 100 µg/ml de ampicilina + 50 µg/ml de espectinomicina en viales de suero de 50 ml cerrados, en cuatro cultivos separados. Se añadió IPTG a 0,4 mM después de 6 h y se tomaron muestras para análisis de HPLC a 24, 48 y 96 h. Una cepa de control que contenía pCL1925:budAB y pTrc99a se cultivó bajo las mismas condiciones. Se detectó 2-butanol en los 4 cultivos de la cepa de producción y en ninguno de los dos cultivos de la cepa de control, que indica que la ruta era completamente funcional y produjo 2-butanol en ausencia de la coenzima B12.
Ejemplo 22 (profético)
Producción de 2-butanol por cepa de S. cerevisiae recombinante que expresa diol deshidratasa independiente de B12
El clon descrito en el Ejemplo 19 con un fragmento de ADN sintético que contiene las secuencias que codifican RdhtA y RdhtB se usó como molde de PCR para preparar fragmentos de la región codificante de RdhtA y RdhtB separados. La región codificante de RdhtA para la diol deshidratasa se amplificó por PCR usando los cebadores N695 y N696 (SEC ID Nº: 293 y 294). La región codificante de RdhtB para la diol deshidratasa activasa se amplificó por PCR usando los cebadores N697 y N698 (SEC ID Nº: 295 y 296). Los dos fragmentos de ADN se combinaron con un fragmento de ADN terminador dual (SEC ID Nº: 297) que tenía un terminador ADH (SEC ID Nº: 298) y un terminador CYC1 (SEC ID Nº: 299) adyacentes entre sí en orientación opuesta usando PCR de SOE (Horton y col. (1989) Gene 77:61-68). El fragmento terminador dual se aisló como un fragmento de 0,6 kb tras la digestión con Pacl de pRS426::FBA-ILV5+GPM-kivD (descrito en la publicación de patente de EE.UU. del mismo solicitante y en tramitación junto con la presente nº 20070092957 A1, Ejemplo 17). El fragmento de ADN de 4 kb resultante tuvo las regiones codificantes de RdhtA y RdhtB en orientación opuesta en cualquier lado del terminador dual, con el extremo 3' de cada región codificante adyacente a la secuencia terminadora dual. Este fragmento de ADN se clonó entonces por metodología de reparación de huecos (Ma y col. (1987) Genetics 58:201-216) en el vector lanzadera de levadura pRS426::FBA-ILV5+GPM-kivD que se preparó por digestión con BbvCl para eliminar las regiones codificantes de ILV5 y kivD y la secuencia terminadora dual entre sus extremos 3'. El plásmido resultante, pRS426::RdhtAB, contuvo el gen RdhtA bajo el control del promotor FBA (SEC ID Nº: 300) y el gen RdhtB bajo el control del promotor GPM (SEC ID Nº: 301). La actividad de la diol deshidratasa en varios de los clones de levadura se confirmó cultivando las células de levadura anaeróbicamente en presencia de 1,2-propanodiol y analizando los sobrenadantes de cultivo para la presencia de propanol por CG o HPLC (como se describe en Procedimientos generales).
La porción FBA-RdhtA+GPM-RdhtB de pRS426::RdhtAB se integra entonces en el genoma de levadura por recombinación homóloga, del siguiente modo. La región se amplifica a partir de la construcción de plásmido usando los cebadores N742A y N743A (SEC ID Nº: 302 y 303). Similarmente, el marcador MET15 se amplifica a partir de pRS421 (ATCC nº 87475) usando los cebadores N657 y N653A (SEC ID Nº: 304 y 305). Estos dos fragmentos de
ADN se combinan entonces usando PCR de SOE (Horton y col. (1989) Gene 77:61-68). El producto lineal se transforma en la cepa BY4741. Los transformantes se obtienen sobre medio que carece de metionina. La integración en el sitio met15 se confirma por PCR. Los clones se prueban para la actividad de diol deshidratasa como se ha descrito anteriormente.
La cepa resultante, BY4741 Δmet15::RdhtAB::MET15, se transforma entonces con los plásmidos de la ruta del butanodiol pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA y pRS426::FBA-budC+GPM-sadB que se construyeron del siguiente modo.
Construcción de pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA
El gen budA, que codifica acetolactato descarboxilasa, se amplificó a partir de ADN genómico preparado a partir de Klebsiella pneumonia (ATCC nº 25955) usando la ADN polimerasa Phusion™ Hot Start High-Fidelity (New England Biolabs, Inc.). Los cebadores usados (N579 y N580: SEC ID Nº: 306 y 307) se añadieron a la secuencia en la dirección 5' del codón de iniciación que era homólogo al promotor FBA de levadura y la secuencia en la dirección 3' del codón de terminación que era homólogo al terminador ADH de levadura. El plásmido pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3, que tiene un gen quimérico que contiene el promotor CUP1 (SEC ID Nº: 308), región codificante de alsS de Bacillus subtilis (SEC ID Nº: 309) y terminador CYC1 (SEC ID Nº: 299), además de un gen quimérico que contiene el promotor FBA (SEC ID Nº: 300), región codificante de ILV3 de S. cerevisiae (SEC ID Nº: 310) y terminador ADH1 (SEC ID Nº: 298) (descrito en la publicación de patente de EE.UU. del mismo solicitante y en tramitación junto con la presente nº US20070092957 A1, Ejemplo 17) se digirió con restricción con NcoI y PmlI para eliminar la región codificante de ILV3. La banda de vector de 11,1 kb se purificó en gel. Aproximadamente 1 µg de ADN de vector cortado se combinó con 1 µg del producto de PCR de budA y se transformó en la cepa BY4741 de S. cerevisiae. El inserto y el vector se combinaron por recombinación homóloga in vivo para formar un vector circular (también conocido como “clonación de reparación de huecos”; descrita en Ma y col. (1987) Genetics 58:201-216) que permite la retención del marcador de selección (en este caso, HIS3). Los transformantes se seleccionaron sobre medio sintético completo que carece de histidina. Las colonias se aplicaron en parches a una nueva placa y las células de estos parches se usaron para preparar ADN de plásmido (kit Zymoprep™ Yeast Plasmid Miniprep, Zymo Research). Se usó PCR para cribar plásmidos para la presencia de alsS (cebadores N98SeqF1 y N99SeqR2: SEC ID Nº: 311 y 312) y para la apropiada inserción de budA (N160SeqF1 y N84SeqR2, SEC ID Nº: 313 y 314).
Construcción de pRS426::FBA-budC
El gen budC, que codifica butanodiol deshidrogenasa, se amplificó a partir de ADN genómico preparado a partir de Klebsiella pneumonia (ATCC nº 25955) usando la ADN polimerasa Phusion™ Hot Start High-Fidelity (New England Biolabs, Inc.). Los cebadores usados (N581 y N582; SEC ID Nº: 315 y 316) se añadieron a la secuencia en la dirección 5' del codón de iniciación que era homólogo al promotor FBA de levadura y la secuencia en la dirección 3' del codón de terminación que era homólogo al terminador CYC1 de levadura.
El plásmido de expresión pRS426::FBA::alsS se construyó mediante las siguientes etapas. El fragmento de la región codificante de alsS de 1,7 kb de pRS426::GPD::alsS::CYC se aisló por purificación en gel siguiendo digestión con BbvCl y PacI. Este plásmido tiene un gen quimérico que contiene el promotor GPD (SEC ID Nº: 317), la región codificante de alsS de Bacillus subtilis (SEC ID Nº: 309]) y el terminador CYC1 (SEC ID Nº: 299) y se describió en la publicación de patente de EE.UU. del mismo solicitante y en tramitación junto con la presente nº US20070092957 A1, Ejemplo 17). El fragmento de ILV5 del plásmido pRS426::FBA::ILV5::CYC, también descrito en el documento US20070092957 A1, Ejemplo 17, se eliminó por digestión con restricción con BbvCI y PacI y el fragmento de vector de 6,6 kb restante se purificó en gel. Este plásmido tiene un gen quimérico que contiene el promotor FBA (SEC ID Nº: 300) y el terminador CYC1 (SEC ID Nº: 299) que unen la región codificante del gen ILV5 de S. cerevisiae (SEC ID Nº: 318). Estos dos fragmentos purificados se ligaron durante la noche a 16 ºC y se transformaron en células TOP10 químicamente competentes de E. coli (Invitrogen). Los transformantes se obtuvieron sembrando las células sobre medio LB Amp100. La inserción de alsS en el vector se confirmó por patrón de digestión con restricción y PCR usando los cebadores N98SeqF1 y N99SeqR2 (SEC ID Nº: 311 y 312).
El plásmido pRS426::FBA::alsS se digirió con BbvCl y PacI para liberar el fragmento alsS. El vector lineal restante se purificó en gel. Aproximadamente 1 µg de vector se combinó con 1 µg del producto de PCR budC y se transformó en BY4741 para obtener clones de reparación de huecos (véase anteriormente). Los transformantes se seleccionaron sobre medio completo sintético que carece de uracilo. Los plásmidos se prepararon a partir de parches de 5 colonias transformantes. La presencia de FBA-budC se cribó usando PCR usando los cebadores N160SeqF1 y N582 (SEC ID Nº: 313 y 314).
Construcción de pRS425::GPM-sadB
El gen sadB, que codifica alcohol deshidrogenasa secundaria, se amplificó por PCR a partir de pCR4Blunt:sadB, descrito en el Ejemplo 20. Los cebadores de PCR contuvieron secuencias de 5' adicionales que solapan con el promotor GPM1 de levadura y el terminador ADH (N583 y N584: SEC ID Nº: 322 y 323). El producto de PCR se clonó entonces usando metodología de “reparación de huecos” en Saccharomyces cerevisiae (Ma y col., véase arriba) del siguiente modo. La vector lanzadera de E. coli de levadura pRS425::GPM::kivD::ADH que contiene el
promotor GPM (SEC ID Nº: 31), región codificante de kivD de Lactococcus lactis (SEC ID Nº: 321) y terminador ADH1 (SEC ID Nº: 298) (descrito en la publicación de patente de EE.UU. del mismo solicitante y en tramitación junto con la presente nº US20070092957 A1, Ejemplo 17) se digirió con enzimas de restricción BbvCI y PacI para liberar la región codificante de kivD. Aproximadamente 1 µg del fragmento de vector restante se transformó en la cepa BY4741 de S. cerevisiae junto con 1 µg de producto de PCR de sadB. Los transformantes se seleccionaron sobre medio completo sintético que carece de leucina. El evento de recombinación apropiado, que genera pRS425::GPMsadB, se confirmó por PCR usando los cebadores N142 y N459 (SEC ID Nº: 322 y 323).
Construcción de pRS426::FBA-budC+GPM-sadB
El casete de promotor-gen-terminador GPM-sadB-ADH se transfirió a pRS426 (ATCC nº 77107), un vector lanzadera de E. coli de levadura que lleva el marcador de selección URA3, por clonación por reparación de huecos. El casete se aisló por digestión con SalI y SacII y el vector se linealizó con BamHI antes de la ligación. El vector resultante, pRS426::GPM-sadB, se confirmó por PCR usando los cebadores N142 y N459 (SEC ID Nº: 322 y 323). Con el fin de añadir el gen budC que codifica acetoína reductasa de Klebsiella pneumonia a este vector, un fragmento que contiene budC se escindió de pRS423::FBA-budC+FBA-budA usando SphI y SapI.
Para la construcción de pRS423::FBA-budC+FBA-budA, el vector pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA descrito anteriormente se digirió con SacII y MluI para eliminar CUP1-alsS. También se usó digestión con SacII/MluI para aislar FBA-budC de pRS426::FBA-budC (descrito anteriormente). Los fragmentos apropiados (fragmento de vector de 7,6 kb y fragmento de FBA-budC de 1,6 kb) se purificaron en gel, se ligaron y se transformaron en células competentes TOP10 de E. coli (Invitrogen). Las colonias transformantes se cribaron por PCR para confirmar la incorporación del fragmento de budC usando los cebadores N581 y N582 (SEC ID Nº: 315 y 316).
El fragmento de budC SphI - SapI de pRS423::FBA-budC+FBA-budA lleva porciones del vector en la dirección 5' del promotor FBA, además de parte del terminador ADH para permitir la clonación por clonación por reparación de huecos en el vector pRS426::GPM-sadB que se linealizó con SacII. Los transformantes se sembraron sobre medio que carece de uracilo para seleccionar la recombinación de las dos secuencias lineales. El vector resultante, pRS426::FBA-budC+GPM-sadB, se confirmó por PCR usando los cebadores N581 y N582 (SEC ID Nº: 315 y 316).
Las cepas de BY4741 Δmet15::RdhtAB::MET15 que se transforman con plásmidos de la ruta de butanodiol pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA y pRS426::FBA-budC+GPM-sadB se cultivan y los medio de cultivo se ensayan como se describe en Procedimientos generales. Se confirma la producción de BDO y/o de 2-butanol. Se espera que las células cultivadas con aireación vigorosa sobre glucosa produzcan BDO y etanol, y esas células cultivadas bajo condiciones más anaerobias convertirán algún BDO en 2-butanol.
Tabla 12
HMMER 2.0 [2.3.2]
Nombre y versión del programa
NAME alpha_exp_seqs
Nombre del archivo de entrada con el alineamiento de las secuencias
LENG 557
Longitud del alineamiento: incluye indels
ALPH Amino
Tipo de restos
MAP yes
Mapa de los estados de la concordancia con las columnas del alineamiento
COM hmmbuild apha.hmm alpha_exp_seqs.aln
Comandos utilizados para generar el archivo: este significa que se aplicó hmmbuild (con los parámetros por defecto) al
archivo de alineamiento.
COM hmmcalibrate alpha.htm
Comandos utilizados para generar el archivo: este significa que se aplicó hmmcalibrate (con los parámetros por defecto) al
perfil de HMM.
NSEQ 8
Número de secuencias en el archivo de alineamiento.
DATE Fri Mar 30 19:02:15 2007
Cuando se generó el archivo.
XT -8455 -4 -1000 -1000 -8455 -4 –8455 -4
NULT -4 -8455
La distribución de probabilidad de transición para el modelo nulo (estado G único)
NULE
595 -1558 85 338 -294 453 -1158 197 249 902 -1085 -142 -21 -313 45 531 201 384 -1998 -644
La distribución de la probabilidad de emisión del símbolo para el modelo nulo (estado G); (p. ej., 4 o 20) enteros. La
probabilidad de nulo que se utiliza para convertirlos en las probabilidades del modelo es 1/K.
EVD-264.989197 0.112643
Los parámetros de distribución de valores extremos μ y λ, respectivamente; ambos valores son de punto flotante. λ es
positivo y diferente de cero. Estos valores se fijan cuando el modelo se calibra con hmmcalibrate.
62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131
TABLA 13
HMMER 2.0 [2.3.2]
NAME beta_exp_seqs
LENG 238
ALPH Amino
RF no
CS no
MAP yes
COM hmmbuild beta_hmm2 beta_exp_seqs.a
COM hmmcalibrate beta_hmm2
NSEQ 8
DATE Fri Mar 30 18:30:25 2007
CKSUM 9853
XT
-8455 -4 -1000 -1000 -8455 -4 -8455 -4
NULT
-4 -8455
NULE
595 -1558 85 338 -294 453 -1158 197 249 902 -1085 -142 -21 -313 45 531 201 384 -1998 -644
Evd-152.743744 0.132052
132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 TABLA 14
HMMER 2.0 [2.3.2]
NAME gamma_exp_seqs
LENG 175
ALPH Amino
RF no
CS no
MAP yes
COM hmmbuild gamma_hmm3 gamma_exp_seqs.a
COM hmmcalibrate gamma_hmm3
NSEQ 8
DATE Fri Mar 30 18:50:16 2007
CKSUM 2849
XT
-8455 -4 -1000 -1000 -8455 -4 -8455 -4
NULT
-4 -8455
NULE
595 -1558 85 338 -294 453 -1158 197 249 902 -1085 -142 -21 -313 45 531 201 384 -1998 -644
EVD—145.815587 0.162883
161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181
Listado de Secuencias
<110> E.I. du Pont de Nemours and Co.
<120> Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos
<130> CL3893PCT1 5 <160> 323
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 780
<212> ADN 10 <213> Klebsiella pneumoniae
<400>
1
<400>
3
15
<210> <211> <212> <213> 2 259 PRT Klebsiella pneumoniae
<400>
2
5
<210> <211> <212> <213> 3 1680 ADN Klebsiella pneumoniae
183
5
<210> <211> <212> <213> 4 559 PRT Klebsiella pneumoniae
<400>
4
<210> <211> <212>
5 771 ADN
5
<213> Klebsiella pneumoniae
<400>
5
<210>
6
<211>
256
10
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 6
<210> 7
<211>
1665
<212>
ADN
<213>
Klebsiella oxytoca
<210>
8
<211>
554
<212>
PRT
10
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 8
5
<210> <211> <212> <213> 9 675 ADN Klebsiella oxytoca
<400>
9
5
<210> <211> <212> <213> 10 224 PRT Klebsiella oxytoca
<400>
10
5
<210> <211> <212> <213> 11 522 ADN Klebsiella oxytoca
<400>
11
10
<210> <211> <212> <213> 12 173 PRT Klebsiella oxytoca
<400>
12
5
<210> <211> <212> <213> 13 1041 ADN Rhodococcus ruber
<400>
13
<210> <211> <212> <213>
14 346 PRT Klebsiella oxytoca
5
<400> 14
5
<210> <211> <212> <213> 15 29 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 15 caccatggac aaacagtatc cggtacgcc
29
10
<210> <211> <212> <213> 16 25 ADN Secuencia Artificial
15
<220> <223> Cebador
<400> 16 cgaagggcga tagctttacc aatcc
25
20
<210> <211> <212> 17 32 ADN
<213> Secuencia Artificial <223> Cebador
<220> <223>
Cebador
<400> 17 caccatgaat cattctgctg aatgcacctg cg
32
<210> <211> <212> <213>
18 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 18 gatactgttt gtccatgtga cc
22
<210> <211> <212> <213>
19 28 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 19 caccatgaaa aaagtcgcac ttgttacc
28
<210> <211> <212> <213>
20 15 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 20 ttagttaaat accat
15
<210> <211> <212> <213>
21 23 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 21 caccatgaga tcgaaaagat ttg
23
<210> <211> <212> <213>
22 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 22 cttagagaag ttaatcgtcg cc
22
<210> <211> <212> <213>
23 25 ADN Secuencia Artificial
<220>
<400> 23 caccatgaaa gccctccagt acacc
25
<210> <211> <212> <213>
24 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 24 cgtcgtgtca tgcccggg
18
<210> <211> <212> <213>
25 36 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 25 gatcgaattc gtttaaactt agttttctac cgcacg
36
<210> <211> <212> <213>
26 34 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 26 gatcgcatgc aagctttcat atagtcggaa ttcc
34
<210> <211> <212> <213>
27 43 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 27 gatcgaattc gtttaaacaa aggaggtctg attcatgaga tcg
43
<210> <211> <212> <213>
28 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 28 gatcggattc ttaatcgtcg cc
22
<210> <211> <212> <213>
29 36 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
29
gatcggatcc aaaggaggtc gggcgcatga aagccc
36
<210> <211> <212> <213>
30 32 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 30 gatctctaga aagctttcag cccgggacga cc
32
<210> <211> <212> <213>
31 21 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 31 actttctttc gcctgtttca c
21
<210> <211> <212> <213>
32 79 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
32
<210> <211> <212> <213>
33 39 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador BABC F
<400> 33 gagctcgaat tcaaaggagg aagtgtatat gaatcattc
39
<210> <211> <212> <213>
34 35 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador BAB R
<400> 34 ggatcctcta gaattagtta aataccatcc cgccg
35
<210> <211> <212> <213>
35 17 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador M13 Directo
<400> 35 gtaaaacgac ggccagt
17
<210> <211> <212> <213>
36 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador M13 Inverso
<400> 36 aacagctatg accatg
16
<210> <211> <212> <213>
37 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador N83 SeqF2
<400> 37 gctggattac cagctcgacc
20
<210> <211> <212> <213>
38 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador N83SeqF3
<400> 38 cggacgcatt accggcaaag
20
<210> <211> <212> <213>
39 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador N84 SeqR4
<400> 39 cgaagcgaga gaagttatcc
20
<210> <211> <212> <213>
40 38 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador BC Spe F
<400> 40 actagtaaag gaggaaagag tatgaagaag gtcgcact
38
<210> <211> <212> <213>
41 26 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador BC Xba R
<400> 41 tctagaaagc aggggcaagc catgtc
26
<210> <211> <212>
42 20 ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador Trc F
<400> 42 ttgacaatta atcatccggc
20
<210> <211> <212> <213>
43 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador Trc R
<400> 43 cttctctcat ccgccaaaac
20
<210> <211> <212> <213>
44 38 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDo For
<400> 44 aagcttaaag gaggctgatt catgagatcg aaaagatt
38
<210> <211> <212> <213>
45 27 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDo Rev
<400> 45 tctagattat tcatcctgct gttctcc
27
<210> <211> <212> <213>
46 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDko seq F2
<400> 46 gcatggcgcg gatttgacga ac
22
<210> <211> <212> <213>
47 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDko seq F5
<400> 47 cattaaagag accaagtacg tg
22
<210> <211> <212> <213>
48 24 ADN Secuencia Artificial
<220>
<223>
Cebador DDko seq F7
<400> 48 atatcctggt ggtgtcgtcg gcgt
24
<210> <211> <212> <213>
49 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDko seq F9
<400> 49 tctttgtcac caacgccctg cg
22
<210> <211> <212> <213>
50 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDko seq R1
<400> 50 gcccaccgcg ctcgccgccg cg
22
<210> <211> <212> <213>
51 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDko seq R3
<400> 51 cccccaggat ggcggcttcg gc
22
<210> <211> <212> <213>
52 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDko seq R7
<400> 52 gggccgacgg cgataatcac tt
22
<210> <211> <212> <213>
53 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador DDko seq R10
<400> 53 ttcttcgatc cactccttaa cg
22
<210> <211> <212> <213>
54 56 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador ChnA F
<400>
54
catcaattga ctacgtagtc gtacgtgtaa ggaggtttga aatggaaaaa attatg 56
<210> 55
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador ChnA R
<400> 55 catgctagcc ccgggtatct tctactcatt ttttatttcg 40
<210> 56
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial Squence
<220>
<223> Cebador chnSeq F1
<400> 56 ctcaacaggg tgtaagtgta gt 22
<210> 57
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador chnseq R1
<400> 57 cgttttgata tagccaggat gt 22
<210> 58
<211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador Top ter F1
<400> 58 ctagaagtca aaagcctccg accggaggct tttga 35
<210> 59
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador Top ter F2
<400> 59 ctgctcgagt tgctagcaag tttaaacaaa aaaaagcccg ctcattaggc gggctgagct 60
<210> 60
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador Bot ter R1
<400> 60 cagcccgcct aatgagcggg cttttttttg tttaaac
<210>
61
<210>
78
<211> <212> <213>
50 ADN Secuencia Artificial
5
<220> <223> Cebador Bot ter R2
<400> 61 ttgctagcaa ctcgagcagt caaaagcctc cggtcggagg cttttgactt
50
10
<210> <211> <212> <213> 62 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador pCL1925 vec F
15
<400> 62 cggtatcatc aacaggctta cc 22
<210> <211> <212> <213>
63 22 ADN Secuencia Artificial
20
<220> <223> Cebador pCL1925 vec R1
<400> 63 agggttttcc cagtcacgac gt
22
25
<210> <211> <212> <213> 64 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador pCL1925 vec R2
30
<400> 64 cgcaatagtt ggcgaagtaa tc 22
35
<210> <211> <212> <213> 65 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador N84 Seq R2
<400> 65 gcatcgagat tatcgggatg
20
40
<210> <211> <212> <213> 66 208 ADN Escherichia coli
<210> <211> <212> <213>
67 42 ADN Secuencia Artificial
5
<220> <223> variante del promotor 1.6GI
<400> 67 gcccttgaca atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct
42
10
<210> <211> <212> <213> 68 42 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Promotor 1.5 GI
15
<400> 68 gcccttgact atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct 42
20
<210> <211> <212> <213> 69 3240 ADN Klebsiella oxytoca
<400>
69
5
<210> <211> <212> <213> 70 2640 ADN Klebsiella oxytoca
<400>
70
5
<210> <211> <212> <213> 71 756 ADN Acinetobacter sp.
<400>
71
5
<210> <211> <212> <213> 72 251 PRT Acinetobacter sp.
<400>
72
5
<210> <211> <212> <213> 73 17417 ADN Acinetobacter sp.
<400>
73
5
<210> <211> <212> <213> 74 1164 ADN Escherichia coli
<400>
74
10
<210> <211> <212> <213> 75 387 PRT Escherichia coli
<400>
75
5
<210> <211> <212> <213> 76 1623 ADN Bacillus subtilis
<400>
76
5
<210> <211> <212> <213> 77 540 PRT Bacillus subtilis
<400>
77
<211>
1680
<212>
ADN
<213>
Klebsiella terrigena
<400>
78
<210>
79
<211>
559
<212>
PRT
10
<213> Klebsiella terrigena
<400>
79
<400>
84
<400>
94
<400>
104
5
<210> <211> <212> <213> 80 768 ADN Bacillus subtilis
<400>
80
<212>
PRT
<213>
Bacillus subtilis
<400>
81
5
<210> <211> <212> <213> 82 780 ADN Klebsiella terrigena
<400>
82
10
<210> <211> <212> <213> 83 259 PRT Klebsiella terrigena
<400>
83
5
<210> <211> <212> <213> 84 1053 ADN Bacillus cereus
233
5
<210> <211> <212> <213> 85 350 PRT Bacillus cereus
<400>
85
5
<210> <211> <212> <213> 86 1053 ADN Bacillus cereus
<400>
86
10
<210> <211> <212> <213> 87 350 PRT Bacillus cereus
<400>
87
5
<210> <211> <212> <213> 88 1113 ADN Lactococcus lactis
<400>
88
5
<210> <211> <212> <213> 89 370 PRT Lactococcus lactis
<400>
89
<210>
90
<211>
705
<212>
ADN
5
<213> Pyrococcus furiosus
5
<210> <211> <212> <213> 91 234 PRT Pyrococcus furiosus
<400>
91
5
<210> <211> <212> <213> 92 1665 ADN Salmonella typhimurium
<400>
92
5
<210> <211> <212> <213> 93 554 PRT Salmonella typhimurium
<400>
93
5
<210> <211> <212> <213> 94 675 ADN Salmonella typhimurium
245
5
<210> <211> <212> <213> 95 224 PRT Salmonella typhimurium
<400>
95
5
<210> <211> <212> <213> 96 522 ADN Salmonella typhimurium
<400>
96
<210>
97
<211>
173
10
<212> PRT
<213>
Salmonella typhimurium
5
<210> <211> <212> <213> 98 1677 ADN Lactobacillus collinoides
<400>
98
5
<210> <211> <212> <213> 99 558 PRT Lactobacillus collinoides
<400>
99
5
<210> <211> <212> <213> 100 693 ADN Lactobacillus collinoides
<400>
100
10
<210> <211> <212> <213> 101 230 PRT Lactobacillus collinoides
<400>
101
5
<210> <211> <212> <213> 102 522 ADN Lactobacillus collinoides
<400>
102
5
<210> <211> <212> <213> 103 173 PRT Lactobacillus collinoides
<400>
103
<210>
104
10
<211> 1665
<212>
ADN
<213>
Klebsiella pneumoniae
5
<210> <211> <212> <213> 105 554 PRT Klebsiella pneumoniae
<400>
105
5
<210> <211> <212> <213> 106 687 ADN Klebsiella pneumoniae
<400>
106
<210>
107
<211>
228
10
<212> PRT
<213>
Klebsiella pneumoniae
<400> 107
<210> 108
<211>
525
<212>
ADN
<213>
Klebsiella pneumoniae
<210> <211> <212> <213>
109 174 PRT Klebsiella pneumoniae
10
<400> 109
5
<210> <211> <212> <213> 110 1833 ADN Klebsiella oxytoca
<400>
110
5
<210> <211> <212> <213> 111 610 PRT Klebsiella oxytoca
<400>
111
5
<210> <211> <212> <213> 112 378 ADN Klebsiella oxytoca
<400>
112
10
<210> <211> <212> <213> 113 125 PRT Klebsiella oxytoca
<400>
113
15 <210> 114
<211>
1833
<212>
ADN
<213>
Salmonella typhimurium
5
<210> <211> <212> <213> 115 610 PRT Salmonella typhimurium
<400>
115
5
<210> <211> <212> <213> <400> 116 372 ADN Salmonella typhimurium 116
269
5
<210> <211> <212> <213> 117 123 PRT Salmonella typhimurium
<400>
117
10
<210> <211> <212> <213> 118 1833 ADN Lactobacillus collinoides
<400>
118
5
<210> <211> <212> <213> 119 610 PRT Lactobacillus collinoides
271
<400> 119
5
<210> <211> <212> <213> 120 351 ADN Lactobacillus collinoides
<400>
120
<210>
121
10
<211> 116
<212>
PRT
<213> Lactobacillus collinoides
<400>
121
<400>
137
5
<210> <211> <212> <213> 122 453 PRT Vibrio fluvialis
<400>
122
5
<210> <211> <212> <213> 123 1122 ADN Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400>
123
5
<210> <211> <212> <213> 124 374 PRT Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400>
124
5
<210> <211> <212> <213> 125 1272 ADN Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400>
125
10
<210> <211> <212> <213> 126 424 PRT Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400>
126
5
<210> <211> <212> <213> 127 35 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 127 ctccggaatt catgtctgac ggacgactca ccgca
35
10
<210> 128
<211> <212> <213>
46 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 128 ttccaatgca ttggctgcag ttatctctgt gcacgagtgc cgatga
46
<210> <211> <212> <213>
129 40 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 129 aacagccaag cttggctgca gtcatcgcgc attctccggg
40
<210> <211> <212> <213>
130 40 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 130 tctccggaat tcatgacgtc tgaaatgaca gcgacagaag
40
<210> <211> <212> <213>
131 33 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 131 gctaacagga ggaagaattc atggggggtt ctc
33
<210> <211> <212> <213>
132 33 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 132 gagaaccccc catgaattct tcctcctgtt agc
33
<210> <211> <212> <213>
133 723 ADN Klebsiella terrigena
<400>
133
5
<210> <211> <212> <213> 134 241 PRT Klebsiella terrigena
<400>
134
5
<210> <211> <212> <213> 135 554 PRT Clostridium pasteurianum
<400>
135
5
<210> <211> <212> <213> 136 179 PRT Clostridium pasteurianum
<400>
136
<210>
137
<211>
146
10
<212> PRT
<213>
Clostridium pasteurianum
5
<210> <211> <212> <213> 138 555 PRT Escherichia blattae
<400>
138
5
<210> <211> <212> <213> 139 196 PRT Escherichia blattae
<400>
139
5
<210> <211> <212> <213> 140 141 PRT Escherichia blattae
<400>
140
10
<210> <211> <212> <213> 141 555 PRT Citrobacter freundii
<400>
141
5
<210> <211> <212> <213> 142 194 PRT Citrobacter freundii
<400>
142
5
<210> <211> <212> <213> 143 142 PRT Citrobacter freundii
<400>
143
10
<210> <211> <212> <213> 144 1359 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Condón optimizado para la amina Vibrio fluvialis: piruvato transminasa
<400>
144
5
<210> <211> <212> <213> 145 1668 ADN Klebsiella pneumoniae
<400>
145
5
<210> <211> <212> <213> 146 555 PRT Klebsiella pneumoniae
<400>
146
5
<210> <211> <212> <213> 147 585 ADN Klebsiella pneumoniae
<400>
147
10
<210> <211> <212> <213> 148 194 PRT Klebsiella pneumoniae
<400>
148
5
<210> <211> <212> <213> 149 426 ADN Klebsiella pneumoniae
<400>
149
<210> <211> <212> <213>
150 141 PRT Klebsiella pneumoniae
5
<400> 150
10
<210> <211> <212> <213> 151 1824 ADN Klebsiella pneumoniae
<400>
151
5
<210> <211> <212> <213> <400> 152 607 PRT Klebsiella pneumoniae 152
305
5
<210> <211> <212> <213> 153 354 ADN Klebsiella pneumoniae
<400>
153
10
<210> <211> <212> <213> 154 117 PRT Klebsiella pneumoniae
<400>
154
5
<210> <211> <212> <213> 155 1125 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Codón optimizado para la amino alcohol cinasa de Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400>
155
5
<210> <211> <212> <213> 156 1275 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Codón optimizado para la alcohol O-fosfato liasa de Erwinia caratovora subsp. Atroseptica
<400>
156
5
<210> <211> <212> <213> 157 77 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400>
157
10 <210> 158
<211> 77
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> 15 <223> Cebador
<400> 158
20
<210> <211> <212> <213> 159 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
25
<400> 159 ggacctgctt cgctttatcg 20
<210> <211> <212> <213>
160 15 ADN Secuencia Artificial
30
<220> <223> Cebador
<400> 160 gctagagatg atagc
15
35
<210> <211> <212> <213> 161 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 161 ggaagagact atccagcg
18
5
<210> <211> <212> <213> 162 50 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
10
<400> 162 gcgcgcccgg gaagaaggag ctcttcacca tgaacaaacc acagtcttgg 50
<210> <211> <212> <213>
163 28 ADN Secuencia Artificial
15
<220> <223> Cebador
<400> 163 gcgcgcccgg gttcatgcca cctctgcg
28
20
<210> <211> <212> <213> 164 558 PRT Lactobacillus brevis
<400>
164
<210> <211> <212> <213>
165 239 PRT Lactobacillus brevis
5
<400> 165
5
<210> <211> <212> <213> 166 175 PRT Lactobacillus brevis
<400>
166
<210>
167
<211>
554
10
<212> PRT
<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis
<400>
167
<400>
174
5
<210> <211> <212> <213> 168 224 PRT Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67
<400>
168
5
<210> <211> <212> <213> 169 173 PRT Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67
<400>
169
5
<210> <211> <212> <213> 170 554 PRT Escherichia coli
<400>
170
5
<210> <211> <212> <213> 171 222 PRT Escherichia coli
<400>
171
5
<210> <211> <212> <213> 172 172 PRT Escherichia coli
<400>
172
5
<210> <211> <212> <213> 173 554 PRT Shigella sonnei
<400>
173
5
<210> <211> <212> <213> 174 222 PRT Shigella sonnei
327
5
<210> <211> <212> <213> 175 172 PRT Shigella sonnei
<400>
175
5
<210> <211> <212> <213> 176 554 PRT Yersinia bercovieri
<400>
176
5
<210> <211> <212> <213> 177 221 PRT Yersinia bercovieri
<400>
177
5
<210> <211> <212> <213> 178 174 PRT Yersinia bercovieri
<400>
178
<210> <211> <212> <213>
179 551 PRT Yersinia mollaretii
5
<400> 179
5
<210> <211> <212> <213> 180 224 PRT Yersinia mollaretii
<400>
180
5
<210> <211> <212> <213> 181 175 PRT Yersinia mollaretii
<400>
181
5
<210> <211> <212> <213> 182 554 PRT Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
<400>
182
5
<210> <211> <212> <213> 183 223 PRT Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
<400>
183
5
<210> <211> <212> <213> 184 174 PRT Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
<400>
184
5
<210> <211> <212> <213> 185 554 PRT Yersinia intermedia
<400>
185
5
<210> <211> <212> <213> 186 224 PRT Yersinia intermedia
<400>
186
<210> <211> <212> <213>
187 175 PRT Yersinia intermedia
5
<400> 187
10
<210> <211> <212> <213> 188 554 PRT Listeria welshimeri
<400>
188
5
<210> <211> <212> <213> 189 219 PRT Listeria welshimeri
<400>
189
5
<210> <211> <212> <213> 190 170 PRT Listeria welshimeri
<400>
190
5
<210> <211> <212> <213> 191 554 PRT Listeria innocua
<400>
191
5
<210> <211> <212> <213> 192 219 PRT Listeria innocua
<400>
192
5
<210> <211> <212> <213> 193 170 PRT Listeria innocua
<400>
193
5
<210> <211> <212> <213> 194 554 PRT Listeria monocytogenes
<400>
194
5
<210> <211> <212> <213> 195 219 PRT Listeria monocytogenes
<400>
195
5
<210> <211> <212> <213> <400> 196 170 PRT Listeria monocytogenes 196
358
5
<210> <211> <212> <213> 197 554 PRT Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi
<400>
197
5
<210> <211> <212> <213> 198 224 PRT Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi
<400>
198
5
<210> <211> <212> <213> 199 173 PRT Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi
<400>
199
<210> <211> <212> <213>
200 554 PRT Escherichia coli
5
<400> 200
5
<210> <211> <212> <213> 201 222 PRT Escherichia coli
<400>
201
5
<210> <211> <212> <213> 202 172 PRT Escherichia coli
<400>
202
5
<210> <211> <212> <213> 203 554 PRT Listeria monocytogenes
<400>
203
5
<210> <211> <212> <213> 204 219 PRT Listeria monocytogenes
<400>
204
5
<210> <211> <212> <213> 205 170 PRT Listeria monocytogenes
<400>
205
5
<210> <211> <212> <213> 206 553 PRT Streptococcus sanguinis
<400>
206
5
<210> <211> <212> <213> 207 222 PRT Streptococcus sanguinis
<400>
207
<212>
PRT
<213>
Streptococcus sanguinis
<400>
208
<210> 209
<211> 555
<212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400>
209
<400>
215
<400>
247
5
<210> <211> <212> <213> 210 196 PRT Escherichia blattae
<400>
210
5
<210> <211> <212> <213> 211 140 PRT Escherichia blattae
<400>
211
10
<210> <211> <212> <213> 212 554 PRT Clostridium perfringens
<400>
212
5
<210> <211> <212> <213> 213 190 PRT Clostridium perfringens
<400>
213
5
<210> <211> <212> <213> 214 141 PRT Clostridium perfringens
<400>
214
<210>
215
<211>
408
10
<212> PRT
<213>
Yersinia frederiksenii
5
<210> <211> <212> <213> 216 224 PRT Yersinia frederiksenii
<400>
216
5
<210> <211> <212> <213> 217 175 PRT Yersinia frederiksenii
<400>
217
5
<210> <211> <212> <213> 218 554 PRT Thermoanaerobacter ethanolicus
<400>
218
5
<210> <211> <212> <213> 219 229 PRT Thermoanaerobacter ethanolicus
<400>
219
5
<210> <211> <212> <213> 220 182 PRT Thermoanaerobacter ethanolicus
<400>
220
5
<210> <211> <212> <213> 221 558 PRT Lactobacillus hilgardii
<400>
221
5
<210> <211> <212> <213> 222 217 PRT Lactobacillus hilgardii
<400>
222
5
<210> <211> <212> <213> 223 176 PRT Lactobacillus hilgardii
<400>
223
5
<210> <211> <212> <213> 224 558 PRT Lactobacillus reuteri
<400>
224
5
<210> <211> <212> <213> 225 236 PRT Lactobacillus reuteri
<400>
225
5
<210> <211> <212> <213> 226 172 PRT Lactobacillus reuteri
<400>
226
<210>
227
<211>
558
<212>
PRT
5
<213> Lactobacillus diolivorans
<400>
227
5
<210> <211> <212> <213> 228 245 PRT Lactobacillus diolivorans
<400>
228
5
<210> <211> <212> <213> 229 180 PRT Lactobacillus diolivorans
<400>
229
5
<210> <211> <212> <213> 230 558 PRT Lactobacillus reuteri
<400>
230
5
<210> <211> <212> <213> 231 236 PRT Lactobacillus reuteri
<400>
231
5
<210> <211> <212> <213> 232 171 PRT Lactobacillus reuteri
<400>
232
5
<210> <211> <212> <213> 233 756 PRT Mesorhizobium loti
<400>
233
5
<210> <211> <212> <213> 234 139 PRT Mesorhizobium loti
<400>
234
5
<210> <211> <212> <213> 235 746 PRT Mycobacterium vanbaalenii
<400>
235
5
<210> <211> <212> <213> 236 119 PRT Mycobacterium vanbaalenii
<400>
236
5
<210> <211> <212> <213> 237 739 PRT Mycobacterium sp.
<400>
237
5
<210> <211> <212> <213> 238 110 PRT Mycobacterium sp.
<400>
238
5
<210> <211> <212> <213> 239 746 PRT Mycobacterium flavescens
<400>
239
5
<210> <211> <212> <213> 240 109 PRT Mycobacterium flavescens
<400>
240
10
<210> <211> <212> <213> 241 739 PRT Mycobacterium sp.
<400>
241
5
<210> <211> <212> <213> 242 110 PRT Mycobacterium sp.
<400>
242
10
<210> <211> <212> <213> 243 570 PRT Mycobacterium smegmatis
<400>
243
5
<210> <211> <212> <213> 244 200 PRT Mycobacterium smegmatis
<400>
244
5
<210> <211> <212> <213> 245 114 PRT Mycobacterium smegmatis
<400>
245
10
<210> <211> <212> <213> 246 754 PRT Mycobacterium smegmatis
<400>
246
5
<210> <211> <212> <213> 247 757 PRT Mycobacterium smegmatis
436
5
<210> <211> <212> <213> 248 142 PRT Mycobacterium smegmatis
<400>
248
10
<210> <211> <212> <213> 249 119 PRT Mycobacterium smegmatis
<400>
249
5
<210> <211> <212> <213> 250 224 PRT Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi
<400>
250
5
<210> <211> <212> <213> 251 173 PRT Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi
<400>
251
5
<210> <211> <212> <213> 252 188 PRT Clostridium perfringens
<400>
252
5
<210> <211> <212> <213> 253 141 PRT Clostridium perfringens
<400>
253
<210> <211> <212> <213>
254 554 PRT Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium
5
<400> 254
5
<210> <211> <212> <213> 255 524 PRT Listeria monocytogenes
<400>
255
5
<210> <211> <212> <213> 256 555 PRT Escherichia blattae
<400>
256
5
<210> <211> <212> <213> 257 555 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
257
5
<210> <211> <212> <213> 258 555 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
258
5
<210> <211> <212> <213> 259 556 PRT Lactobacillus collinoides
<400>
259
5
<210> <211> <212> <213> 260 224 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
260
5
<210> <211> <212> <213> 261 224 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
261
5
<210> <211> <212> <213> 262 194 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
262
5
<210> <211> <212> <213> 263 194 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
263
5
<210> <211> <212> <213> 264 194 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
264
5
<210> <211> <212> <213> 265 188 PRT Clostridium perfringens
<400>
265
5
<210> <211> <212> <213> 266 146 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
266
5
<210> <211> <212> <213> 267 148 PRT Escherichia blattae
<400>
267
5
<210> <211> <212> <213> 268 172 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
268
5
<210> <211> <212> <213> 269 121 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
269
5
<210> <211> <212> <213> 271 142 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
271
5
<210> <211> <212> <213> 272 142 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
272
5
<210> <211> <212> <213> 273 142 PRT desconocido
<220> <223>
organismo citado como no identificado de referencia
<400>
273
10 <210> 274
<211> 170
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 274
5
<210> <211> <212> <213> 275 2432 ADN Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400>
275
5
<210> <211> <212> <213> 276 843 PRT Roseburia inulinivorans
<400>
276
5
<210> <211> <212> <213> 277 2532 ADN Roseburia inulinivorans
<400>
277
5
<210> <211> <212> <213> 278 264 PRT roseburia inulinivorans
<400>
278
5
<210> <211> <212> <213> 279 794 ADN Roseburia inulinivorans
<400>
279
5
<210> <211> <212> <213> 280 787 PRT Clostridium butyricum
<400>
280
5
<210> <211> <212> <213> 281 2364 ADN Clostridium butyricum
<400>
281
5
<210> <211> <212> <213> 282 304 PRT Clostridium butyricum
<400>
282
5
<210> <211> <212> <213> 283 915 ADN Clostridium butyricum
<400>
283
10
<210> <211> <212> <213> 284 3378 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
región codificante doble sintetizada
<400>
284
5
<210> <211> <212> <213> 285 20 ADN Secuencia Artificial
<220>
489
<223>
Cebador
<400> 285 ttgacaatta atcatccggc
20
<210> <211> <212> <213>
286 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 286 cttctctcat ccgccaaaac
20
<210> <211> <212> <213>
287 33 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 287 ttggatccag gaaggaaaaa cgcgttatga aag
33
<210> <211> <212> <213>
288 33 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 288 ggctcgagac caccgatttg gcaatgtagg gaa
33
<210> <211> <212> <213>
289 348 PRT Achromobacter xylosoxidans
<400>
289
5
<210> <211> <212> <213> 290 1047 ADN Achromobacter xylosoxidans
<400>
290
<210> 291
<211> 30
<212> <213>
ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 291 ggaattcaca catgaaagct ctggtttatc
30
<210> <211> <212> <213>
292 28 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 292 gcgtccaggg cgtcaaagat caggcagc
28
<210> <211> <212> <213>
293 60 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 293 aaccaagtaa tacatattca aatctagagc tgaggatggg caattacgat tcaacaccga
60
<210> <211> <212> <213>
294 60 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 294 gtaagcgtga cataactaat tacatgatta attaactatc tattgtctgc ttgttcggta
60
<210> <211> <212> <213>
295 60 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 295 aatccaaaca aacacacata ttacaatagc tgaggatgaa agaatatctt aatacttcag
60
<210> <211> <212> <213>
296 60 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 296 cataaatcat aagaaattcg cttactctta attaataacc accgatttgg caatgtaggg
60
<210> <211> <212> <213>
297 594 ADN Secuencia Artificial
<220>
<223>
fragmento terminador doble sintético
<400>
297
<210> 298
<211> 316
<212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae
<210> <211> <212> <213>
299 270 ADN Saccharomyces cerevisiae
15
<400> 299
20
<210> <211> <212> <213> 300 643 ADN Saccharomyces cerevisiae
<400>
300
5
<210> <211> <212> <213> 301 753 ADN Saccharomyces cerevisiae
<400>
301
10
<210> <211> <212> <213> 302 55 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
15
<400> 302
cacgtgaagc tgtcgatatt ggggaactgt cgcggataga tctgaaatga ataac 55
<210>
303
<211>
68
<212>
ADN
<213>
Secuencia Artificial
<220>
<223>
Cebador
<400>
303
<210> 304
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 304 tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gag 33
<210> 305
<211> 61
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 305
<210> <211> <212> <213>
306 55 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 306 agtaatacat attcaaatct agagctgagg atgaatcatt ctgctgaatg cacct
55
<210> <211> <212> <213>
307 55 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 307 atcataagaa attcgcttac tcttaattaa ttaactttct acggaacgga tggcg
55
<210> <211> <212> <213>
308 448 ADN Saccharomyces cerevisiae
<400>
308
5
<210> <211> <212> <213> 309 1716 ADN Bacillus subtilis
<400>
309
5
<210> <211> <212> <213> 310 1758 ADN Saccharomyces cerevisiae
498
<400> 310
<210> 311
<211> 20
<212> <213>
ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 311 cgtgttagtc acatcaggac
20
<210> <211> <212> <213>
312 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 312 catcgactgc attacgcaac tc
22
<210> <211> <212> <213>
313 19 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 313 aaaacgtgg catcctctc
19
<210> <211> <212> <213>
314 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 314 gcatcgagat tatcgggatg
20
<210> <211> <212> <213>
315 55 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 315 agtaatacat attcaaatct agagctgagg atgaaaaaag tcgcacttgt taccg
55
<210> <211> <212> <213>
316 55 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
<400> 316 cgtgacataa ctaattacat gattaattaa ttagttaaac accatcccgc cgtcg
55
<210> <211> <212> <213>
317 672 ADN Saccharomyces cerevisiae
<400> 317
5
<210> <211> <212> <213> 318 1188 ADN Saccharomyces cerevisiae
<400>
318
<210> 319
<211> 55
<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 319 aaacaaacac acatattaca atagctgagg atgaaagctc tggtttatca cggtg 55
10 <210> 320
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> 15 <223> Cebador
<400> 320 atcataagaa attcgcttac tcttaattaa tcaggcagcg cctgcgttcg agagg 55
<210> 321
<211> 1662 20 <212> ADN
<213> Lactococcus lactis
<400> 321
5
<210> <211> <212> <213> 322 28 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
503
<400> 322 ggatccgcat gcttgcattt agtcgtgc
28
5
<210> <211> <212> <213> 323 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Cebador
10
<400> 323 gggatgcgga cgtattcggc 20

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3butanodiol en 2-butanona en la célula huésped en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona o 2-butanol, y adicionalmente en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
  2. 2.
    La célula huésped microbiana recombinante según la reivindicación 1, en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276.
  3. 3.
    La célula huésped microbiana recombinante según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende además una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa reactivasa independiente de B12.
  4. 4.
    La célula huésped microbiana recombinante según la reivindicación 3, en la que la reactivasa tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 278 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.
  5. 5.
    La célula huésped microbiana recombinante según la reivindicación 3 o la reivindicaciones 4, en la que la reactivasa tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 278.
  6. 6.
    Un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende:
    a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3butanodiol en 2-butanona en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, y una fuente de 2,3-butanodiol;
    en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y
    b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada se expresa y el 2,3-butanodiol se convierte en 2-butanona; y
    c) opcionalmente recuperar la 2-butanona.
  7. 7. Un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende:
    a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,3butanodiol en 2-butanona en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, actividad de butanol deshidrogenasa y una fuente de 2,3-butanodiol;
    en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y
    b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada se expresa y el 2,3-butanodiol se convierte en 2-butanona y la 2-butanona se convierte en 2-butanol; y
    c) opcionalmente recuperar el 2-butanol.
  8. 8. La célula huésped microbiana recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan la conversión de sustrato en productos:
    i) piruvato en alfa-acetolactato;
    ii) alfa-acetolactato en acetoína;
    iii) acetoína en 2,3-butanodiol;
    iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol.
  9. 9. La célula huésped microbiana recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan la conversión de sustrato en productos: i) piruvato en alfa-acetolactato; 5 ii) alfa-acetolactato en acetoína;
    iii) acetoína en 2,3-butanodiol; y iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona.
  10. 10. Uso de una célula huésped microbiana recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 8 ó 9 para la producción de 2-butanona o 2-butanol.
ES08769487.3T 2008-04-29 2008-05-16 Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos Active ES2491093T3 (es)

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