CN114689704B - 1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析检测技术领域,尤其涉及1,3‑二羟基丙酮及相关杂质的检测方法。本发明采用HPLC法对1,3‑二羟基丙酮及相关杂质进行检测,所述HPLC的色谱条件包括:色谱柱:Carbomix Ca‑NP;检测器:RID检测器;流动相:水,等度洗脱。经验证,该方法检测的结果准确、可靠,具有良好的重复性。样品溶液也具有良好的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域,尤其涉及1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法。
背景技术
1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone),通常指二羟基丙酮(Dihydroxyacetone),简称DHA,结构式如下:
1,3-二羟基丙酮是最简单的三碳酮糖,也是一种重要的化工、生化原料,医药、农业合成中间体和多功能食品添加剂,用途十分广泛。
根据1,3-二羟基丙酮的合成路线,其合成过程中产生的相关杂质主要包含甘油、甘油醛等,为了保证下游产品的质量,需严格控制1,3-二羟基丙酮的杂质水平。但由相关杂质甘油和甘油醛的结构与1,3-二羟基丙酮的结构十分相似,理化性质也十分接近,且都无紫外吸收基团,文献报道的1,3-二羟基丙酮有关物质检测方法极少。
目前,中国药典2020版二部中收载了甘油质量标准,其有关物质检测方法中提到可以检测甘油的相关杂质,但经测试发现,其方法对于检测甘油主成分是有效的,但对于1,3-二羟基丙酮和甘油醛的检测时却出现杂质无法分离,1,3-二羟基丙酮易于分解,检测结果不稳定的情况。另外,一些其他现有技术中二羟基丙酮及相关物质的检测方法,也无法同时有效分离二羟基丙酮、甘油和甘油醛。
因此,本领域需要开发针对一种1,3-二羟基丙酮的有效质控检测方法,保证甘油、甘油醛等杂质可以有效分离,同时保证主成分检测过程中不能被分解,解决结果不准确的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供准确、稳定的1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法。
本发明提供的1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法,采用HPLC对待测样品进行检测,所述HPLC的色谱条件包括:
色谱柱:Carbomix Ca-NP;
检测器:RID检测器;
流动相:水,等度洗脱。
本发明对1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测采用HPLC法。实验表明,采用电喷雾检测器(CAD)虽然具有良好的分离度,但是甘油灵敏度低,达不到检测要求,因此,本发明的方案中,采用RID检测器进行检测。示差检测器也是一种通用型检测器,是连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值的检测器,是根据折射原理设计的,属偏转式类型,当参比池和测量池流过相同的溶剂时,使照在双光敏电阻的光量相同,此时桥路平衡,输出为零。当测量池中流过被测样品时,引起折射率变化使照在双光电阻上的光束发生偏转,使双光敏电阻阻值发生变化,此时由电桥输出讯号,即反映了样品浓度的变化情况。本发明中,使用RID检测器配合适宜的色谱柱和洗脱条件,能够实现对甘油、甘油醛和1,3-二羟基丙酮的良好分离和较高的灵敏度。一些实施例中,所述检测器的温度为55℃。
本发明检测方法中,采用的色谱柱为Carbomix Ca-NP色谱柱,该色谱柱中的填料在低交联度聚苯乙烯/二乙烯苯(PS/DVB)颗粒的表面修饰磺酸基团(-SO3H)。本发明中,所述色谱柱填料的交联度为8%。填料的粒径为10μm。极窄的粒径分布确保了高的分离效率,而较低的交联度保证其物质在流动相中发生溶胀,从而具有合适的比表面积和柱容量。一些实施例中,所述色谱柱尺寸为:7.8×300mm,10μm。具体实施例中,本发明所述的色谱柱为Carbomix Ca-NP 10(10μm,8%交联度,7.8×300mm)柱。本发明的检测方法中,所述色谱柱的柱温为60℃。
流动相对于色谱峰的峰形和分离度都存在显著的影响。因此,适宜流动相的选择对于获得良好分离效果是至关重要的。本发明中,以水作为流动相,采用等度洗脱。该方案能够使样品中的甘油、甘油醛和1,3-二羟基丙酮的良好分离,色谱图显示,甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮依次出峰,1,3-二羟基丙酮与甘油分离度为2.12,甘油与甘油醛峰的分离度为1.67。并且,该方法的洗脱程序非常简单,每个样品检测30min即可获得良好的检测效果。在一些实施例中,所述流动相的流速为0.5ml/min。所述流动相的洗脱时间为30min。
本发明中,所述1,3-二羟基丙酮的相关杂质为甘油和甘油醛。
本发明中,所述待测样品为1,3-二羟基丙酮原料药的水溶液,或为1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液。
本发明中,所述1,3-二羟基丙酮原料药的水溶液中1,3-二羟基丙酮原料药的浓度为50mg/mL。
所述1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液中,1,3-二羟基丙酮标准品的浓度为50mg/mL,甘油标准品的浓度为0.125~0.375mg/mL,甘油醛标准品的浓度为0.125~0.5mg/mL。
一些具体实施例中,所述1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液中,1,3-二羟基丙酮标准品的浓度为50mg/mL,所述甘油标准品的浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL或0.375mg/mL;所述甘油醛标准品的浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL或0.5mg/mL。
本发明中,采用本发明所述色谱条件,进行检测,1,3-二羟基丙酮的保留时间为20.8±0.2min;甘油的保留时间为18.8±0.2min;甘油醛的保留时间为17.3±0.2min。
本发明中,根据保留时间对甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮进行定性。采用标准曲线法对甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮进行定量。所述标准曲线法包括内标法或外标法。作为优选,本发明采用外标法对甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮进行定量。经检测,甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮的定量限依次为4.7μg/ml、5.0μg/ml、4.9μg/ml。
本发明采用HPLC法对1,3-二羟基丙酮及相关杂质进行检测,所述HPLC的色谱条件包括:色谱柱:Carbomix Ca-NP;检测器:RID检测器;流动相:水,等度洗脱。经验证,该方法检测的结果准确、可靠,具有良好的重复性。样品溶液也具有良好的稳定性。
附图说明
图1示实施例1色谱图;
图2示对比例1色谱图;
图3示对比例2色谱图;
图4示对比例3色谱图;
图5示对比例4色谱图;
图6示对比例5色谱图;
图7示对比例6色谱图。
具体实施方式
本发明提供了1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。本发明中,所述1,3-二羟基丙酮样品来自北京科福瑞德有限公司。Carbomix Ca-NP色谱柱来自苏州赛分科技。本发明实施例中,用于配置样品或加标溶液的水,以及用作流动相的水是指超纯水。下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1色谱方法构建
1、配制样品和加标溶液:
加标溶液:分别称取甘油、甘油醛、1,3-二羟基丙酮加水使溶解成每1ml中含甘油0.25mg、甘油醛0.5mg、1,3-二羟基丙酮50mg的混合溶液。
2、以如下色谱参数对1中配制的溶液进行检测
色谱柱:Carbomix Ca-NP 10:8%7.8×300mm,10μm
以水为流动相;柱温为60℃;流速为每分钟0.5ml;检测器温度为55℃;进样体积为20μl。
3检测效果
色谱图(图1)显示,该色谱条件符合验证要求。甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮依次出峰,1,3-二羟基丙酮与甘油分离度为2.12,甘油与甘油醛峰的分离度为1.67。
实施例2色谱准确性验证
1以水为稀释剂配制溶液
混合对照品溶液:取甘油和甘油醛对照品各适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含甘油0.25mg、甘油醛0.25mg的混合溶液,即得。
50%回收率溶液:取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.125mg、甘油醛0.125mg的混合溶液,即得。同法配制3份
100%回收率溶液:取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.25mg、甘油醛0.25mg的混合溶液,即得。同法配制3份
150%回收率溶液:取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.375mg、甘油醛0.375mg的混合溶液,即得。同法配制3份
2以如下色谱参数对1中配制的溶液进行检测
色谱柱:Carbomix Ca-NP 10:8%7.8×300mm,10μm;以水为流动相;柱温为60℃;流速为每分钟0.5ml;检测器温度为55℃;进样体积为20μl。
3、检测结果如下:
表1
表2
表1~2表明:不同浓度的甘油在1,3-二羟基丙酮中的回收率在91.9%~96.3%之间,平均回收率为93.6%,回收率RSD为2.0%;
不同浓度的甘油醛在1,3-二羟基丙酮中的回收率在94.8%~98.4%之间,平均回收率为96.6%,回收率RSD为1.3%,说明方法具有一定的准确度。
实施例3色谱重复性验证
1、以水为溶液,配制重复性溶液:
取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.25mg、甘油醛0.25mg的混合溶液,即得。同法配制6份
2、以实施例1记载的色谱条件进行检测,检测结果如表3~4:
表3
表4
由表3~4可知,6份重复性溶液中,甘油平均含量为0.49%,含量RSD为0.20%;甘油醛平均含量为0.54%,含量RSD为0.83%;说明该方法具有良好的重复性。
实施例4溶液稳定性验证
1、溶液配制:
稀释剂:水。
供试品溶液:取1,3-二羟基丙酮适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含50mg的溶液,即得。
样品加标溶液:取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮50mg、甘油0.25mg、甘油醛0.25mg的混合溶液,即得。
2、以上溶液分别在25℃条件下,于0h、20h、46h进样测试。色谱参数为实施例1记载,结果图表5~6:
表5
表6
结果表明,供试品溶液和样品加标溶液在室温条件下,46h内稳定。
实施例5检测限测定
溶液配制:
稀释剂:水
取1,3-二羟基丙酮、甘油、甘油醛各适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含1,3-二羟基丙酮4.9μg、甘油5.0μg、甘油醛4.7μg的混合溶液,即得。
色谱参数以实施例1记载,结果见表7:
表7
实施例6原料药检测
以实施例1建立的方法对3个不同批次的1,3-二羟基丙酮原料药进行检测,结果如表8:
表8
样品名称 | 甘油% | 甘油醛% | 未知杂质% | 总杂% |
样品1 | 0.06 | 0.16 | ND | 0.32 |
样品2 | 0.05 | 0.16 | 0.03 | 0.25 |
样品3 | 0.20 | 0.17 | 0.04 | 0.41 |
说明本发明提供的方法可以对原料药进行检测,准确分离并对甘油醛、甘油进行定量。
对比例1
参照中国药典2020年版甘油质量标准有关物质检测方法测定
1、配制样品和加标溶液:
溶剂:30%乙腈溶液
样品溶液:称取1,3-二羟基丙酮10.1g,置10ml量瓶中,溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。
甘油贮备液:称取甘油对照品0.1g,加溶剂溶解并稀释至每1ml中含甘油1mg的溶液。
加标溶液:称取1,3-二羟基丙酮0.1g,置10ml量瓶中,加甘油贮备液0.2ml,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。
2、采用GC方法对加标溶液进行检测,色谱参数如下:
色谱柱:Agilent DB-624 30m×0.53mm×3μm
进样量:1μl分流模式:分流分流比:10:1柱流量:8ml/min
进样口温度为200℃;检测器温度为250℃;
柱温箱升温程序:起始温度为100℃,维持4分钟,以每分钟50℃速率升至120℃,维持10分钟,再以每分钟50℃的速率升至220℃,维持10分钟。
进样加标溶液,色谱图(图2)显示,甘油醛峰与主峰重合。
对比例2
1、配制样品溶液:同对比例1
2、采用GC方法对加标溶液进行检测,色谱参数如下:
色谱柱:Agilent DB-624 75m×0.53mm×3μm
柱温箱升温程序:起始温度为100℃,以每分钟20℃速率升至240℃,维持5分钟。
其他色谱参数均同对比例1中所述色谱参数。进样样品溶液,色谱图(图3)显示甘油醛与主峰分离度为6.02,甘油醛含量为0.826%,未检测出甘油杂质。甘油醛杂质含量偏高,远超出常规分析检测中一般样品的浓度。分析样品在高温下分解。
对比例3
1、配制样品溶液:同对比例1
2、采用GC方法对加标溶液进行检测,色谱参数如下:
色谱柱:Agilent DB-624 75m×0.53mm×3μm
柱温箱升温程序:进样口温度为130℃,柱温箱升温程序为:起始温度为70℃,以8℃每分钟的速率升至220℃,维持10分钟。
其他色谱参数均同对比例1中所述色谱参数,进样样品溶液。色谱图(图4)显示,甘油醛含量为0.086%。
1,3-二羟基丙酮在接近最低限的气化温度下,仍然有甘油醛降解出,说明用GC方法监控1,3-二羟基丙酮的杂质水平不可行。
对比例4
1、配制加标溶液
加标溶液:分别称取甘油、甘油醛、1,3-二羟基丙酮加水使溶解成每1ml中含甘油10mg、甘油醛1mg、1,3-二羟基丙酮50mg的混合溶液。
2、采用HPLC配置CAD检测器方法对加标溶液进行检测,色谱参数如下:
以水为流动相;流速为每分钟0.5ml;柱温为40℃;进样体积为20μl;
雾化器温度为低(40℃)
进样加标溶液,色谱图(图5)显示,甘油醛和甘油峰重合,1,3-二羟基丙酮峰与2峰的分离度为0.9。
对比例5
1、配制加标溶液
加标溶液:分别称取甘油、甘油醛、1,3-二羟基丙酮加水使溶解成每1ml中含甘油10mg、甘油醛1mg、1,3-二羟基丙酮50mg的混合溶液。
2、采用HPLC方法配置CAD检测器对加标溶液进行检测,色谱参数如下:
色谱柱为Carbomix Ca-NP 10:8%7.8×300mm,10μm
以水为流动相等度洗脱;流速为每分钟0.5ml;柱温为40℃;进样加标溶液,进样体积为20μl;色谱图(图6)显示,甘油醛、甘油、1,3-二羟基丙酮依次出峰,分离度均大于2。但甘油响应低,峰高仅为1.79PA。
对比例6
1、配制加标溶液
加标溶液:分别称取甘油、甘油醛、1,3-二羟基丙酮加水使溶解成每1ml中含甘油10mg、甘油醛1mg、1,3-二羟基丙酮50mg的混合溶液。
2、采用HPLC方法配置RID检测器,检测器温度为55℃,色谱柱为Carbomix Ca-NP10:8%7.8×300mm,10μm
流动相为:乙腈-水(5:95)等度洗脱,
流速为每分钟0.5ml;柱温为50℃;
进样加标溶液,进样体积为20μl。
结果显示,甘油与1,3-二羟基丙酮的分离度小于1.0。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.1,3-二羟基丙酮及相关杂质的检测方法,其特征在于,采用HPLC对待测样品进行检测,所述HPLC的色谱条件包括:
色谱柱:Carbomix Ca-NP,色谱柱填料的交联度为8%,色谱柱尺寸为:7.8×300mm,10μm,柱温为60℃;
检测器:RID检测器,检测器温度为55℃;
流动相:水,等度洗脱,流速为0.5mL/min;
其中,所述1,3-二羟基丙酮的相关杂质为甘油和甘油醛。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述待测样品为1,3-二羟基丙酮原料药的水溶液,或为1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,
所述1,3-二羟基丙酮原料药的水溶液中1,3-二羟基丙酮原料药的浓度为50 mg/mL;
所述1,3-二羟基丙酮及相关杂质的标准品的水溶液中,1,3-二羟基丙酮标准品的浓度为50 mg/mL,甘油标准品的浓度为0.125~0.375 mg/mL,甘油醛标准品的浓度为0.125~0.5mg/mL。
4.根据权利要求1~3任一项所述的检测方法,其特征在于,
1,3-二羟基丙酮的保留时间为20.8±0.2min;
甘油的保留时间为18.8±0.2min;
甘油醛的保留时间为17.3±0.2min。
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