CN101270374B - 微生物转化油脂生产饱和及不饱和α,ω-二羧酸的方法 - Google Patents

微生物转化油脂生产饱和及不饱和α,ω-二羧酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用微生物转化油脂生产饱和及不饱和α、ω-二羧酸的方法，特别是生产9烯-十八碳二元酸(Δ9DC18)的方法。所用微生物为ou-3突变菌株，属于热带假丝酵母(Candida tropicalis)。其特点是在微生物菌种接入含有油醇、油酸或油酸甲酯为基质的培养基后，第一阶段，控制体系以菌体生长为主，也转化油脂生产二元酸；第二阶段，控制反应系统，以产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，控制系统只产酸，不长菌体。本方法用于转化油醇生产9烯-十八碳二元酸(Δ9DC18)时，在16L发酵罐中，转化144小时，Δ9DC18的产量达到110.5g/L。

Description

微生物转化油脂生产饱和及不饱和α,ω-二羧酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物转化油脂生产饱和及不饱和α，ω-二羧酸，尤其是转化油脂中的油酸、油酸甲酯和油醇生产9烯-十八碳二元酸(Δ9DC18)的方法。
背景技术
长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、树脂和医药等的重要原料。饱和及不饱和长链二元酸分别是化工上合成麝香型香料和灵猫香等名贵香料的重要原料。过去4种名贵的动物香料(麝香、龙诞香、灵猫香、海狸香)只能从野生动物身上获得，例如麝香只能从麝猫、麝鹿等的睾丸中取得，极其昂贵。如今天然麝香中具有生理活性的主要有效成分——麝香酮(即3-甲基环十五酮)可以用十五碳二元酸(DC15)进行合成，而灵猫香可以用9烯-十八碳二元酸进行化学合成。而长链二元酸在自然界不单独不存在，化工上难以合成，陈远童等从20世纪90年代以来，先后获得用微生物发酵石油正烷烃生产长链二元酸的7项国家发明专利。并已形成大规模工业生产。但是，石油是一种不可再生资源，根据国家的战略需求，科学家们正在研究以油脂(可再生资源)为原料，代替石油正烷烃，进行微生物转化生产饱和及不饱和长链二元酸的方法和工艺。
发明内容    本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ou-3，是以一株氧化正烷烃生产混合二元酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)：88～93，1980)为出发菌株，通过硝基胍、亚硝酸、紫外线和N+注入等多种诱变方法，经过多次反复诱变筛选培育出来的，能从油脂中的各种饱和及不饱和脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪醇，尤其是从油酸、油酸甲酯和油醇生产相应链长的二元酸。热带假丝酵母(Candida tropicalis)ou-3(以下简称ou-3)已于2008年5月14日保藏在北京朝阳区大屯路甲3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.2496。ou-3的生理特征如下：
一、糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。
二、同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤鲜醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。
三、生长素的需要：生物素++，维生素B1++，维生素B2+，维生素B6+，维生素B12+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。
四、其它：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。
形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征：在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。
本发明的种子培养基：
(1)10Be’糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；
(2)10Be’糖度的麦芽汁液体培养基；
(3)种子培养基包含：KH2PO4 6～12g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，蔗糖10～30g/L，自来水配置，自然pH。
培养种子的过程为：取一接种环ou-3酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(φ15×180试管，每支装6～7mL培养基，灭菌后放成斜面)，于28～30℃培养40小时。取一支上述培养好的ou-3菌种全部刮入装有30mL麦芽汁种子培养基的250mL三角瓶中，于28～30℃220转/分的旋转摇床上培养40～48小时，作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的ou-3斜面菌种全部刮入装有500mL培养基的5000mL三角瓶中，于200转/分的旋转摇床28～30℃培养44～48小时，作为一级种子罐的种子。
用本发明的ou-3菌株转化油脂生产长链二元酸，特别是9烯-十八碳二元酸的具体方法是：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液接入pH5.5～9.0，最好是6.0～8.0的含有10～30％(v/v)的油醇、油酸或油酸甲酯和90～70％(v/v)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4～12g/L，最好为6～10g/L，氯化钠0.5～2.5g/L，最好为1.0～2.0g/L，硝酸盐5～15g/L，最好是6～10g/L，吐温602～5g/L，最好是2～3g/L，尿素1～4g/L，最好是1.5～2.5g/L，蔗糖15～30g/L，丙烯酸0.5～3g/L及一些其他公知的营养源，在pH6.0～7.5下将上述混合物在25～34℃，最好在27～31℃通气发酵72～170小时。第一阶段，体系pH控制在6.0～6.8，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系pH控制7.0～8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体。从72小时开始，每天补加一定量的油醇等，使发酵液中油醇浓度始终＞5％(v/v)，碱金属磷酸盐可从KH2PO4或NaH2PO4中选一种。
发酵结束后，进行破乳分层，上层残油回收再用，放出中间清液，下层菌体层再处理一次或压滤；合并清液，加入适量活性炭在85～90℃脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至70～80℃，加HCl或H2SO4至pH3进行酸化结晶，冷却至30℃，压滤，空气吹干，烘干，得白色二元酸。
用本发明的ou-3菌株和发酵方法，可生产C11～C18的各种单一饱和及不饱和二元酸。其中在16L发酵罐，从油醇转化生产Δ9DC18时，发酵144小时，产酸量达110.5g/L。
具体完成方式
实例1.
(1)取一接种环ou-3菌种，涂布在Φ15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天。
(2)取上述菌种一支，接入装有30mL麦芽汁种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃在220转/分的旋转摇床上培养46小时。
(3)在装有15mL发酵培养基的500mL三角瓶中，接入3.5mL上述种子液，在220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH调一次pH至7.5～8.0。发酵培养基中含KH2PO4 8g/L，KNO3 4g/L，吐温60 3g/L，酵母膏2g/L，玉米浆2.5g/L，NaCl 1g/L，尿素1.8g/L，蔗糖20g/L，丙烯酸1g/L，油醇150mL/L，自来水配制，pH7.1，110℃灭菌30分钟。发酵结束后，用6mol HCl调pH至3。用有机溶剂萃取，先除去残存原料油，再用乙醚提取二元酸，除去乙醚，得白色结晶，用标准NaOH溶液滴定，计算二元酸含量。结果Δ9DC18产量为55.1g/L。
实例2.
按照实例1的方法，只是原料用月桂酸，结果DC12产量为46.5g/L。
实例3.
按照实例1的方法，只是原料用棕榈油酸，结果9烯-十六碳二元酸(Δ9DC16)产量为43g/L。
实例4.
按照实例1的方法，只是原料用芥酸(13-二十二烯酸)，结果Δ13-二十二碳烯二酸(Δ13DC22)产量为17.2g/L。
实例5.
(1)种子培养基及培养方法和发酵培养基同实例1。
(2)把2.5L培养两天，OD(×30，620nm)为0.81 pH 4.2，健壮，无杂菌种液接入装有10L发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的16L发酵罐中，29±1℃650转/分，罐压1.0kg/cm2，通气量1∶1。开始时，油醇1.5L，30小时内，体系pH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生6.5g/LΔ9DC18，然后体系pH在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到25.1g/L，70小时后每天补加一定量油醇，使发酵液中油醇浓度始终＞5％(v/v)。发酵144小时，产酸量达110.5g/L。发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余油醇，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H2SO4至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干，得白色Δ9DC18产品。油醇转化率为82.1％，后处理总收率达到84.5％。

Claims (2)

1.热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC No.2496菌株。
2.利用权利要求1所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC No.2496转化油醇生产9-烯-十八碳二元酸的方法，其特征在于：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液接入pH6.0～8.0的含有10～30％(v/v)的油醇和90～70％(v/v)发酵培养基的混合液中，发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐6～10g/L，氯化钠1.0～2.0g/L，硝酸盐6～10g/L，吐温60
2～3g/L，尿素1.5～2.5g/L，蔗糖15～30g/L，丙烯酸0.5～3g/L及一些其他公知的营养源，在pH6.0～8.0下将上述混合物在27～31℃通气发酵72～170小时，第一阶段，体系pH控制在6.0～6.8，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系pH控制7.0～8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体，从72小时开始，每天补加一定量的油醇，使发酵液中油醇浓度始终＞5％(v/v)，所述碱金属磷酸盐选自KH2PO4或NaH2PO4。 
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