CN110438052A - 一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌及一种序列接种发酵工艺 - Google Patents

一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌及一种序列接种发酵工艺 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产1,3‑丙二醇的丁酸梭菌及其序列接种发酵方法。菌株命名为丁酸梭菌DL07(Clostridium butyricum DL07)，保藏号为CGMCC NO.17934。本发明菌株利用纯甘油和粗甘油进行发酵可分别产104.78g/L和94.23g/L 1,3‑丙二醇，均是目前已报到的自然微生物利用纯、粗甘油发酵生产1,3‑丙二醇的最高产量。本发明还提供了一种序列接种发酵工艺及自动流加底物发酵控制方法，节省种子培养时间，实现多级连续发酵，为微生物发酵生产1,3‑丙二醇提供了一种自动化程度高、经济性优异的新的发酵调控模式，具有较好的工业应用前景。

Description

一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌及一种序列接种发酵工艺
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌及一种序列接种发酵方法。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-PDO)是一种重要的化工原料，广泛应用于制药、食品、化妆品和纺织行业等多个行业。同时，1,3-丙二醇可作为聚合单体用于合成高性能的高分子材料，特别是合成生物可降解的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)，PTT作为一种新型的聚酯纤维，具有良好的柔软性、蓬松性和抗污性，加上本身固有的弹性，以及能常温染色等良好的特性，在地毯和纺织行业具有巨大的市场潜力，从而成为当前国际上最新开发的热门高分子新材料之一，因此1,3丙二醇拥有巨大的市场需求。
目前工业化生产1,3-丙二醇的方法有化学法和生物法。化学法主要是丙烯醛水合加氢法和环氧乙烷羰基化法，化学法需要高温高压催化剂合成1,3-丙二醇，因此具有技术难度大、设备投资较高等缺点。生物法是利用天然微生物或者经过基因工程改造的菌株，以葡萄糖或甘油为底物，在常温常压条件下进行发酵生产1,3-丙二醇。与化学法相比，生物法生产1,3-丙二醇具有原料可再生、操作过程简便、反应条件温和安全、产生的副产物少且对环境污染小等优点，从而得到学者们的广泛关注。较高的1,3-丙二醇浓度、生产效率和转化率是工业应用生物法生产1,3-丙二醇的挑战。
在自然界能产1,3-丙二醇的菌株中，克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)因具有较高的底物耐受力和1,3-丙二醇生产能力而引起较多关注。其中，克雷伯氏杆菌是兼性厌氧菌，易于基因改造，可以在微氧条件下迅速生长，已有较多相关报道。但其属于条件致病菌、维生素B12依赖型且副产物较多，副产物中包括2,3-丁二醇，这给1,3-丙二醇的分离纯化带来了挑战，阻碍了克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的工业应用。而作为益生菌的丁酸梭菌得到了很多学者的青睐，其优点是属于安全菌株、生长不依赖于维生素B12、副产物简单、不产2,3-丁二醇，这使得1,3-丙二醇的生产更加经济、安全、绿色环保，发酵后的丁酸梭菌还可作为动物饲料，因此丁酸梭菌作为工业生产1,3-丙二醇最具潜力的菌株而得到越来越多的关注。但丁酸梭菌生产1,3-丙二醇的最大局限在于其严格厌氧而生长缓慢、种子培养时间长、生产强度低，这些指标直接限制了其工业化生产，因此缩短丁酸梭菌的培养时间、降低生产成本、进一步提高其生产强度，并开发一套适于丁酸梭菌高效生产1,3-丙二醇的工艺才能推动其工业化生产。
目前的报道中，野生的丁酸梭菌利用纯甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇的最高产量达到93.7g/L，生产强度为3.30g/(L·h)(Applied Microbiologyand Biotechnology,2012,93:1057-1063)。而利用粗甘油为底物时，最高可产80.1g/L 1,3-丙二醇，生产强度只有1.8g/(L·h)(Landbauforschung Volkenrode,2005,55:261-267)。有报道通过循环接种工艺进行重复分批发酵可缩短丁酸梭菌的种子培养时间，实现1,3-丙二醇的半连续生产。该工艺用粗甘油(90％)为底物，在添加活性炭的条件下可稳定运行4个循环，1,3-丙二醇的产量分别为42.89,45.78,44.48,42.39g/L，生产强度分别为2.14,1.91,1.85,2.12g/(L·h)；而在无活性炭添加时则无法实现重复批次发酵以半连续生产1,3-丙二醇的目标(Biotechnology and Bioengineering,2018,115(3):684-693)。此工艺省略了单独的种子培养步骤，一定程度上简化了发酵过程，提高了1,3-丙二醇的生产效率，但1,3-丙二醇的浓度较低、循环接种周期较长、只能独立单罐发酵、活性炭的添加增加了生产成本和分离步骤。上述重复分批发酵中主要是利用了发酵末期的菌种作为种子液，注入新鲜培养基进行重复发酵，发酵末期的菌株生长延滞期长、代谢缓慢及发酵能力差是导致循环接种重复分批发酵只能重复进行4批次的原因。进一步想要通过重复批式补料发酵获得高浓度的1,3-丙二醇将更加困难，而目前也未见有实现丁酸梭菌重复批式补料发酵的报道。因此，克服上述重复发酵中种子质量差的问题是推动丁酸梭菌连续生产高浓度1,3-丙二醇的关键。
综上，在获得高性能菌种的基础上开发利用丁酸梭菌更高效率、高经济性、强稳定性地生产高浓度的1,3-丙二醇，并且配套完善的自动化程度高的发酵调控模式，对工业化生产1,3-丙二醇具有重要的现实意义。
发明内容
为解决上述现有技术中的缺陷，本发明提供了一株利用甘油高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌，并提供了一套序列接种发酵工艺及自动流加底物发酵1,3-丙二醇的控制方法，以使丁酸梭菌更高效率、高经济性、强稳定性地安全生产1,3-丙二醇。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌，其特征在于：所述丁酸梭菌命名为Clostridiumbutyricum DL07，保藏编号为CGMCC NO：17934；
进一步地，所述该丁酸梭菌可以利用纯甘油或粗甘油为底物采用批式流加发酵制备高浓度1,3-丙二醇。
进一步地，在上述技术方案中，所述的粗甘油为甘油含量75-95％的生物柴油副产甘油或油脂水解产物。
进一步地，提供了一套适用于工业生产的序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，该方法包括了将上述丁酸梭菌接入至甘油为底物的发酵培养基中进行序列接种发酵步骤，即在接种后的发酵罐中，当所述菌株处于指数生长期时，作为种子接种至下一级发酵罐中，重复循环此接种过程至下一级发酵。
上述一种适于工业生产的序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，所述方法包括：
(1)制备种子液：将权利要求1所述的丁酸梭菌DL07接种于种子培养基制备一级种子液，或根据工业生产所需放大倍数制备一级以上种子液；
(2)发酵培养：将上述对应种子液接入发酵罐中进行一级批式流加发酵；
(3)序列接种：当一级发酵进行至OD650>1时，发酵3-14h时，将一级发酵液中1-5％作为种子液接种至下一发酵罐中进行二级发酵，一级发酵继续进行至发酵结束；当二级发酵进行至OD650>1时，发酵3-14h时，重复以上步骤开始三级发酵，一、二级发酵继续进行至结束；同样地，当三级发酵进行至OD650>1时，发酵3-14h时，作为种子液继续重复以上接种步骤，开始四级发酵；如此进行序列接种和重复发酵，可保证多个发酵罐在同时进行发酵生产1,3-丙二醇。更优选地，各级发酵进行至10h，接种量为2％进行下一级发酵。
上述一种适于工业生产的序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，所述步骤(1)具体为：将丁酸梭菌DL07接入活化培养基培养9-12h，按1-10％接种量接入种子培养基中，初始甘油浓度15-40g/L，培养温度32-38℃，转速150-300r/min，通过5M NaOH溶液控制pH为6-7，培养时间3-5h，获得一级种子液；然后将一级种子液按1-8％接种量接入种子培养基中，初始甘油浓度15-40g/L，在32-38℃，培养3-6h，获得二级种子液；接着将二级种子液接入种子培养基中，初始甘油浓度20-50g/L，在32-38℃，培养5-9h，得到三级种子液。更高级的种子液的制备方法同三级种子液制备方法相同；
进一步地，在上述技术方案中，所述的种子培养基成分(g/L)：甘油20-45,KH2PO4·3H2O1.3,K2HPO4 4.454,(NH4)2SO4 2,MgSO4·7H2O 0.2,酵母粉1，另外加入2mL微量元素A溶液，1mL Fe2+溶液和1mL Ca2+溶液，其中微量元素A溶液的组成(mg/L)：CuCl2·2H2O 20，ZnCl2 70，MnCl2·4H2O 100，H3BO3 60，CoCl2·6H2O 200，NiCl2·6H2O 25，NaMoO4·2H2O 35，饱和盐酸9mL。Fe2+溶液是用4mL饱和盐酸配制的5g/L FeSO4·7H2O。Ca2+溶液是20g/L CaCl2溶液。活化培养基中外加0.5g/L L-半胱氨酸盐酸盐和2g/L CaCO3。
上述一种适于工业生产的序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，所述步骤(2)发酵条件为：发酵罐中装体积分数30-70％已灭菌的发酵培养基，接种前后1h内或发酵全程通入0.05-0.10vvm氮气营造罐内厌氧环境，将上述种子液按1-5％接种量接入到发酵罐中进行一级批式补料发酵。发酵温度32-38℃，转速150-300r/min，通过5M NaOH溶液控制pH为7，培养时间16-30h；
进一步地，在上述技术方案中，所述的发酵培养基成分(g/L)：甘油35-80，KH2PO4·3H2O1.36，(NH4)2SO4 6.61，MgCl2·6H2O 0.26，CaCl2 0.29，柠檬酸0.42，酵母粉2-8或者玉米浆干粉4-6，另外添加5mL微量元素B溶液，其中微量元素B溶液的组成(g/L)：ZnCl2 0.68，MnCl2·4H2O 0.17，H3BO3 0.06，CuCl2·2H2O 0.47，NaMoO4·2H2O 0.005，FeCl2·4H2O3.97,CoCl2·6H2O 0.47，饱和盐酸10mL。所述的批式补料采用甘油或甘油与酵母粉(w:w＝20:1)混合成的补料液。
上述一种适于工业生产的序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺所述步骤(2)发酵过程中控制底物流加，使甘油浓度在所需范围内。控制底物流加的方法为连续补料或间歇补料；在间歇补料中，初始甘油浓度为35-80g/L，分为三个阶段补料，第一阶段：当甘油浓度在15-20g/L时，补料至甘油浓度为30-45g/L；第二阶段：当甘油浓度低于15g/L时，补料至甘油浓度为50-80g/L；第三阶段：当甘油浓度在13-20g/L，补料至50-70g/L。
优选地，初始甘油浓度为40g/L，在连续补料发酵控制中，甘油浓度控制在15-25g/L。在间歇补料发酵中，第一阶段：当甘油浓度在15-20g/L时，补料至甘油浓度为40g/L；第二阶段：当甘油浓度低于15g/L时，补料至甘油浓度为65g/L；第三阶段：当甘油浓度在13-20g/L，补料至60g/L。
进一步地，上述连续补料发酵控制为根据碱液消耗量自动控制底物流加量。
具体地，在连续补料发酵中自动控制底物流加的方法为：
(1)在整个发酵过程中，消耗的碱液X(g)与流加的底物Y(g)之间存在线性关系：
Y＝k1X-b；其中，k1,b为常数，其数值通过实验数据拟合得到；
(2)将上述函数关系输入发酵控制系统中，根据pH可在线控制发酵过程；该系统包括计算机、发酵罐、pH电极、碱液输送泵和底物流加泵；通过该系统自动控制发酵pH为7，同时检测碱液输送泵输送速率，计算机根据碱液输送速率和上述函数关系式可计算出底物流加速率，通过自动流加底物控制发酵罐中甘油浓度；控制底物浓度范围为10-35g/L，直至发酵进行到16-24h，关闭补料系统，等剩余底物浓度降为2-8g/L时结束发酵。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌DL07，其生产1,3-丙二醇产量可达到104.78g/L，是目前已报道的自然微生物发酵生产1,3-丙二醇的最高产量，并且它可以利用廉价的粗甘油为底物发酵制备高浓度1,3-丙二醇。
(2)本发明提供了一套适用于工业生产的序列接种发酵工艺，可减少发酵步骤和发酵设备投资，节省种子培养时间，解决了微生物工业发酵时间长、步骤繁琐的问题，很大程度上降低了生产成本、提高了发酵生产效率，为工业微生物发酵提供了一种高经济性的发酵生产工艺；以生产1,3-丙二醇为例，应用本发明的序列接种发酵工艺，可以节省种子培养和放大过程，提高了1,3-丙二醇生产效率；简化了发酵步骤，降低了染菌机率；节省了各级种子罐的运行、灭菌能耗等，降低了生产成本，并且可实现多个发酵罐同时进行发酵以半连续生产1,3-丙二醇。因此，此工艺对工业化生产1,3-丙二醇具有非常大的实用价值。
(3)本发明提供了一种丁酸梭菌发酵生产1,3-丙二醇的自动流加底物控制方法，实现了发酵过程中底物流加在线自动化控制，解决了人工控制不稳定性，解放了人力，可实现丁酸梭菌稳定连续发酵生产1,3-丙二醇。
附图说明
图1丁酸梭菌DL07在固体种子培养基上的生长形态；
图2间歇补料发酵中甘油浓度随发酵时间变化图；
图3甘油消耗质量和发酵时间关系图；
图4为丁酸梭菌DL07以粗甘油为底物和4g/L酵母粉为有机氮的连续补料批式流加发酵；
图5为丁酸梭菌DL07以粗甘油为底物和2g/L酵母粉为有机氮的间歇补料批式流加发酵；
图6为丁酸梭菌DL07以纯甘油为底物和4g/L酵母粉为有机氮的连续补料批式流加发酵；
图7为丁酸梭菌DL07以纯甘油为底物和2g/L酵母粉为有机氮的间歇补料批式流加发酵；
图8为丁酸梭菌DL07以纯甘油为底物的连续补料混合培养基的批式流加发酵；
图9为丁酸梭菌DL07以粗甘油为底物的连续补料混合培养基的批式流加发酵；
图10丁酸梭菌DL07以粗甘油为底物和4g/L玉米浆干粉为氮源的连续补料批式流加发酵；
图11序列接种发酵工艺流程图；
图12实验拟合碱液消耗与底物消耗的线性关系图；
图13丁酸梭菌DL07以纯甘油为底物自动流加底物的发酵结果。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。
1.下述实施例使用的培养基：
种子培养基(g/L)：甘油20-45,KH2PO4·3H2O 1.3,K2HPO4 4.454,(NH4)2SO4 2,MgSO4·7H2O 0.2,酵母粉1，另外加入2mL微量元素A溶液，1mL Fe2+溶液和1mL Ca2+溶液，其中微量元素A溶液的组成(mg/L)：CuCl2·2H2O 20，ZnCl2 70，MnCl2·4H2O 100，H3BO3 60，CoCl2·6H2O 200，NiCl2·6H2O 25，NaMoO4·2H2O 35，饱和盐酸9mL。Fe2+溶液是用4mL饱和盐酸配制的5g/LFeSO4·7H2O。Ca2+溶液是20g/LCaCl2溶液。固体培养基另外添加1.5g/L琼脂粉，厌氧瓶活化使用的液体种子培养基中外加0.5g/L L-半胱氨酸盐酸盐和2g/LCaCO3。
发酵培养基(g/L)：甘油35-80，KH2PO4·3H2O 1.36，(NH4)2SO4 6.61，MgCl2·6H2O0.26，CaCl2 0.29，柠檬酸0.42，酵母粉2-8或者玉米浆干粉4-6，另外添加5mL微量元素B溶液，其中微量元素B溶液的组成(g/L)：ZnCl2 0.68，MnCl2·4H2O 0.17，H3BO3 0.06，CuCl2·2H2O0.47，NaMoO4·2H2O 0.005，FeCl2·4H2O 3.97,CoCl2·6H2O 0.47，饱和盐酸10mL。
2.种子活化培养条件：厌氧培养，厌氧活化种子使用250mL西林瓶，装液量为100mL。待装入培养基后，每瓶持续通3min普通氮气除氧，之后用丁基胶塞封顶。实验过程中用一次性无菌注射器接种及取样，接种量1-10％(v/v)，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养时间15-24h。
3.1-3级种子液及发酵培养条件：采用5L全自动发酵罐，装液量2L，接种量1-8％，温度37℃，转速250r/min，发酵过程用5M NaOH控制pH为7.0。接种前后1h内通入0.10vvm氮气营造罐内厌氧环境。
粗甘油：油脂水解的产物，组成为(w/w)：78％甘油、15-17％水、0.87％灰分、<0.1％游离脂肪酸，pH 6.91。
连续补料：当初始底物浓度降低到20g/L左右时，开始连续流加底物。在间歇补料实验中，各个时间段取样，进行液相色谱分析底物浓度(图2)，可以得出每个时间段消耗的底物浓度，进而根据发酵体积得出间歇补料实验中消耗的甘油质量与时间的关系图(图3)，根据图3进行补料操作。以1h为补料分段点，根据图3可得到每分段点需补料甘油质量A(g)，实验室发酵罐底物流加泵每运行一次补入0.5g甘油，计算得出n＝3600s/(A/0.5)为每个分段点的补料周期，因此连续补料只需设置发酵过程每个补料分段点的补料周期1次/n秒可将底物浓度维持在15-35g/L。
实施例1产1,3-丙二醇的丁酸梭菌DL07的筛选与驯化
厌氧活性污泥来自于大连东泰污水处理厂厌氧池1。在厌氧箱中，取1mL厌氧活性污泥，加入装有9mL无菌除氧水的厌氧瓶中，摇动混合均匀，置于80℃水浴热处理10min以杀死非芽孢菌。用无菌注射器取100μL悬液涂布于固体种子培养基平板上，37℃厌氧培养，挑选厌氧条件下正常生长的单菌落，进行后续的平板划线以纯化得到单菌。经过7次平板划线，最终分离得到单菌DL07，菌落形态如图1所示。用液体种子培养基富集单菌DL07后，采用发酵培养基对该菌进行驯化。初始甘油浓度为40g/L，将富集得到的丁酸梭菌DL07以2％接种量接入装有种子培养基的厌氧瓶中，培养12h后，以2％接种量转接新的种子培养基中，培养12h。两轮培养完成后，以10％接种量接入发酵罐中培养，全程通入0.10vvm的氮气以维持厌氧环境，当甘油浓度剩余20g/L，流加甘油使甘油浓度维持在10-30g/L，当菌的OD值超过7时，用无菌注射器取出1mL快速注射到新鲜种子培养基中，培养12h后，以2％接种量转接新的种子培养基中，培养12h。两轮培养完成后，重复上述发酵罐培养过程。经过3轮重复培养，将驯化得到丁酸梭菌DL07采用40％甘油保存作为种子存储于-70℃低温冰箱中。经过16SrDNA鉴定，结果表明该菌为丁酸梭菌，16S rDNA序列详见序列SEQ ID NO.1，该菌命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)DL07，于2019年6月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.17934；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2以粗甘油为底物的连续补料的批式流加发酵
将低温保存在甘油瓶中的丁酸梭菌DL07以4％接种量接入装有种子培养基的厌氧瓶中，培养12h后，以2％接种量转接新的种子培养基中，培养12h。两轮活化完成后，以10％接种量接入发酵罐中进行发酵。接种前1h以0.1vvm速率通入氮气，接种后1h，通气速率调整为0.05vvm，直到发酵结束。发酵培养基使用粗甘油，初始甘油浓度为40g/L，酵母粉4g/L，发酵过程中不断流加粗甘油以维持甘油浓度为10-25g/L，发酵时间为34h，结果如图4所示。最终1,3-丙二醇浓度为91.70g/L，质量转化率为0.515g/g，生产强度为2.70g/(L·h)。
实施例3以粗甘油为底物的间歇补料批式流加发酵
将活化的种子培养液以10％接种量接入发酵罐中进行发酵，发酵培养基为初始粗甘油浓度为40g/L，酵母粉2g/L。在间歇补料发酵中，分为三个阶段补料，第一阶段：当甘油浓度低于20g/L时，补料粗甘油至甘油浓度为40g/L；第二阶段：当甘油浓度低于15g/L时，补料粗甘油至甘油浓度为65g/L；第三阶段：当甘油浓度低于20g/L，补料粗甘油至60g/L；发酵时间为30h，结果如图5所示。最终1,3-丙二醇浓度为84.86g/L，质量转化率为0.521g/g，生产强度为2.83g/(L·h)。
实施例4以纯甘油为底物的连续补料批式流加发酵
将活化的种子培养液以10％接种量接入发酵罐中进行发酵，发酵培养基为初始纯甘油浓度为40g/L，酵母粉4g/L，接种前1h以0.1vvm速率通入氮气，接种后1h，通气速率调整为0.05vvm，直到发酵结束。发酵过程中不断流加粗甘油以维持甘油浓度为10-25g/L，发酵时间为31h，结果如图6所示。最终1,3-丙二醇浓度为99.83g/L，质量转化率为0.528g/g，生产强度为3.22g/(L·h)。
实施例5以纯甘油为底物的间歇补料批式流加发酵
将活化的种子培养液以10％接种量接入发酵罐中进行发酵，发酵培养基为初始纯甘油浓度为40g/L，酵母粉2g/L。在间歇补料发酵中，分为三个阶段补料，第一阶段：当甘油浓度低于20g/L时，补料纯甘油至甘油浓度为40g/L。第二阶段：当甘油浓度低于15g/L时，补料纯甘油至甘油浓度为65g/L，第三阶段：当甘油浓度低于20g/L，补料纯甘油至甘油浓度60g/L。发酵时间为30h，结果如图7所示。最终1,3-丙二醇浓度为88.32g/L，质量转化率为0.524g/g，生产强度为2.944g/(L·h)。
实施例6以纯甘油为底物的连续补料混合培养基的批式流加发酵
将活化的种子培养液以10％接种量接入发酵罐中进行发酵，接种前1h以0.1vvm速率通入氮气，接种后1h，通气速率调整为0.05vvm，直到发酵结束。发酵培养基为初始纯甘油浓度为40g/L，酵母粉2g/L，发酵过程中不断流加纯甘油与酵母粉(w:w＝20:1)混合成的补料培养基以维持甘油浓度为10-25g/L，发酵时间为31h，结果如图8所示。最终1,3-丙二醇浓度为104.78g/L，质量转化率为0.539g/g，生产强度为3.38g/(L·h)。
实施例7以粗甘油为底物的连续补料混合培养基的批式流加发酵
将活化的种子培养液以10％接种量接入发酵罐中培养，发酵培养基为初始纯甘油浓度为40g/L，酵母粉2g/L，发酵过程中不断流加粗甘油与酵母粉(w:w＝20:1)混合成的补料培养基以维持甘油浓度为10-25g/L，发酵时间为30h，结果如图9所示。最终1,3-丙二醇浓度为94.23g/L，质量转化率为0.516g/g，生产强度为3.04g/(L·h)。
实施例8以玉米浆干粉为氮源的连续补料的批式流加发酵
将活化的种子培养液以10％接种量接入发酵罐中进行发酵，发酵培养基为初始粗甘油浓度为40g/L，玉米浆干粉4g/L，发酵过程中不断流加粗甘油以维持甘油浓度为10-25g/L，发酵时间为30h，结果如图10所示。最终1,3-丙二醇浓度为82.05g/L，质量转化率为0.512g/g，生产强度为2.65g/(L·h)。
实施例9序列接种工艺下半连续发酵生产1,3-丙二醇
具体过程如下：
(1)种子液制备：将厌氧瓶中活化完成的丁酸梭菌Clostridium butyricum DL07按10％接种量接入盛有灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照1-3级种子液的培养条件进行培养，培养时间4h，获得一级种子液；然后将一级种子液按5％接种量接入种子培养基中，培养4.5h，获得二级种子液；接着将二级种子液按照4％接种量接入种子培养基中，培养7h，得到三级种子液。
(2)发酵：发酵涉及4个罐，5L发酵罐装载2L已灭菌的发酵培养基，将上述三级种子液按2％接种量接入到上述任一发酵培养基中进行一级发酵。发酵条件为：发酵温度37℃，转速250r/min，接种前后通入0.10vvm氮气，通过5M NaOH溶液控制pH为7，培养时间23-30h。所述发酵过程采用间歇补料的批式流加发酵，在间歇补料发酵中，分为三个阶段补料，第一阶段：当甘油浓度在15-20g/L时，补料至甘油浓度为30-45g/L；第二阶段：当甘油浓度低于15g/L时，补料至甘油浓度为50-80g/L；第三阶段：当甘油浓度在13-20g/L，补料至50-70g/L。
(3)序列接种步骤：当一级发酵进行至10h时，将一级发酵液中2％作为种子液接种至装有已灭菌的新鲜发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，一级发酵继续进行至发酵结束；当二级发酵进行至10h时，重复以上步骤开始三级发酵，一、二级发酵继续进行至结束；同样地，当三级发酵进行至10h时，作为种子液继续重复以上接种步骤，开始四级发酵，此时一级发酵结束，二、三、四级发酵同时在进行。结束发酵的发酵罐可以装载新鲜培养基进行下一级发酵，如此进行序列接种和重复发酵，使用4个发酵罐可以保证序列接种持续进行，三个发酵罐同时进行发酵。序列接种工艺如图11所示，发酵结果如表1所示。8级发酵中1,3-丙二醇浓度最低为80.65g/L，最高达88.59g/L，转化率最低为0.50g/g，最高为0.54g/g，生产强度最低为2.74g/(L·h)，最高可达3.83g/(L·h)。8级发酵的1,3-丙二醇平均浓度为84.62g/L，平均转化率为0.52g/g，单罐1,3-丙二醇平均生产强度为3.05g/(L·h)。该工艺可在100小时内完成8罐次发酵。
表1序列接种发酵生产1,3-PDO产物浓度分布
实施例10以纯甘油为底物的间歇补料发酵过程碱液消耗量X(g)与底物流加量Y(g)之间的关系
将碱液瓶和甘油瓶放置于电子秤上，每个取样点记录下碱瓶的示数，得到每个取样点时刻碱液的消耗质量。用高效液相色谱检测每个取样点的甘油浓度，根据5M NaOH溶液和纯甘油的密度及碱液消耗和脉冲补入的甘油质量，计算得到每个取样点时刻发酵罐内的发酵液体积，进而可以计算出每个时刻甘油消耗质量，结果如图12所示。根据实验结果得出消耗的碱液X(g)与消耗的底物Y(g)之间的函数关系式：Y＝0.7702X+11.742；R2＝0.995。
实施例11以纯甘油为底物自动流加底物的发酵
将活化的种子培养液以10％接种量接入发酵罐中进行发酵。接种前后1h以0.1vvm速率通入氮气，接种1h后停止通气，直到发酵结束。发酵培养基为初始甘油浓度为40g/L，酵母粉2g/L，发酵过程中根据实施例9消耗的碱液X(g)与消耗的底物Y(g)之间的函数关系式：Y＝0.7702X+11.742；R2＝0.995，不断流加纯甘油以实现发酵过程中底物流加在线自动化控制，即将上述函数关系式输入发酵控制系统中，根据pH值在线控制发酵过程，发酵控制系统包括计算机、发酵罐、pH电极、碱液输送泵和底物流加泵，通过该系统自动控制发酵pH值为7，同时检测碱液输送泵输送速率，计算机根据碱液输送速率和上述函数关系式可计算出底物流加速率，通过自动流加底物控制发酵罐中甘油浓度在20g/L左右，当发酵20h时关闭补料系统停止流加底物，终止发酵时间为30h，结果如图13所示。发酵过程中甘油浓度维持在17.72-21.66g/L，最终1,3-丙二醇浓度为82.18g/L，质量转化率为0.511g/g，生产强度为2.74g/(L·h)。也可将此自动流加底物的方式应用在实施例8的序列接种发酵中，实现自动半连续发酵生产1,3-丙二醇。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 大连理工大学
<120> 一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌及一种序列接种发酵工艺
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acatgcaagt cgagcgatga agctccttcg ggagtggatt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctca tagaggggaa tagcctttcg aaaggaagat taataccgca 120
tatggtagct ttatcgcatg gtagtgctat taaaggagta atccgctatg agatggaccc 180
gcgtcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc 240
tgagagggtg atcggccaca ttgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300
agtggggaat attgcacaat gggggaaacc ctgatgcagc aacgccgcgt gagtgatgac 360
ggccttcggg ttgtaaaact ctgtctttgg ggacgataat gacggtaccc aaggaggaag 420
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 480
ttactgggcg taaagggagc gtaggtggat atttaagtgg gatgtgaaat actcgggctt 540
aacctgggtg ctgcattcca aactggatat ctagagtgca ggagaggaaa ggagaattcc 600
tagtgtagcg gtgaaatgcg tagagattag gaagaatacc agtggcgaag gcgcctttct 660
ggactgtaac tgacactgag gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 720
tagtccacgc cgtaaacgat gaatactagg tgtaggggtt gtcatgacct ctgtgccgcc 780
gctaacgcat taagtattcc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat 840
tgacgggggc ccgcacaagc agcggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 900
ttacctagac ttgacatctc ctgaattact ctgtaatgga ggaagccact tcggtggcag 960
gaagacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1020
caacgagcgc aacccttatt gttagttgct accatttagt tgagcactct agcgagactg 1080
cccgggttaa ccgggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgtctag 1140
ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca atgagatgca acctcgcgag agtgagcaaa 1200
actataaaac cgatctcagt tcggattgta ggctgaaact cgcctacatg aagctggagt 1260
tgctagtaat cgcgaatcag aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1320
cccgtcacac catgagagtt ggcaataccc aaagttcgtg agctaaccc 1369

Claims (10)

1.一株高产1,3-丙二醇的丁酸梭菌，其特征在于：所述丁酸梭菌命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)DL07，保藏编号为CGMCC NO.17934。
2.一种序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，其特征在于，所述工艺以权利要求1所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)DL07进行序列接种发酵，即在接种后的发酵罐中，当所述丁酸梭菌处于指数生长期时，作为种子接种至下一级发酵罐中，重复循环此接种过程至下一级发酵，从而多个发酵罐同时发酵生产1,3-丙二醇。
3.根据权利要求2所述的一种序列接种发酵生产1,3-丙二醇工艺，其特征在于，所述工艺包括：
(1)制备种子液：将权利要求1所述的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)DL07接种于种子培养基制备一级种子液，或根据工业生产所需放大倍数制备一级以上种子液；
(2)发酵培养：将上述对应种子液接入发酵罐中进行一级发酵；
(3)序列接种：当一级发酵进行至OD650>1时，将1-5％的一级发酵液作为种子液接种至下一发酵罐中进行二级发酵，一级发酵继续进行至发酵结束；当二级发酵进行至OD650>1时，将1-5％的二级发酵液作为种子液接种至下一发酵罐中进行三级发酵，一、二级发酵继续进行至结束；重复以上接种步骤开始下一级发酵，如此循环进行序列接种和重复发酵，保证多个发酵罐同时发酵生产1,3-丙二醇。
4.根据权利要求3所述的一种序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，其特征在于，所述方法步骤(1)具体为：将丁酸梭菌(Clostridium butyricum)DL07接入活化培养基培养9-12h，按1-10％接种量接入种子培养基中，初始甘油浓度15-40g/L，培养温度32-38℃，转速150-300r/min，通过5M NaOH溶液控制pH为7，培养时间3-5h，获得一级种子液；然后将一级种子液按1-8％接种量接入种子培养基中，初始甘油浓度15-40g/L，在32-38℃下培养3-6h，获得二级种子液；接着将二级种子液按1-8％接种量接入种子培养基中，初始甘油浓度20-50g/L，在32-38℃下培养5-9h，得到三级种子液；更高级的种子液的制备方法同三级种子液。
5.根据权利要求3所述的一种序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，其特征在于，所述方法步骤(2)的发酵条件为：发酵罐中装入体积分数30-70％的已灭菌发酵培养基，接种前后1h内或发酵全程通入0.05-0.10vvm氮气营造罐内厌氧环境，将上述种子液按1-5％接种量接入到发酵罐中进行一级批式发酵；发酵温度32-38℃，转速150-300r/min，通过5M NaOH溶液控制pH为7，培养时间16-30h。
6.根据权利要求3所述的一种序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，其特征在于，所述步骤(2)发酵过程中控制底物流加，使甘油浓度在所需范围内；控制底物流加的方法为连续补料或间歇补料。
7.根据权利要求6所述的一种序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，其特征在于，所述间歇补料中，初始甘油浓度为35-80g/L，分为三个阶段补料，第一阶段：当甘油浓度在15-20g/L时，补料至甘油浓度为30-45g/L；第二阶段：当甘油浓度低于15g/L时，补料至甘油浓度为50-80g/L；第三阶段：当甘油浓度在13-20g/L，补料至50-70g/L。
8.根据权利要求6所述的一种序列接种发酵生产1,3-丙二醇的工艺，其特征在于，所述连续补料为根据碱液消耗量自动控制底物流加量：
(1)在整个发酵过程中，消耗的碱液X(g)与流加的底物Y(g)之间存在线性关系：
Y＝k1X-b；其中，k1,b为常数，其数值通过实验数据拟合得到；
(2)将上述函数关系输入发酵控制系统中，根据pH可在线控制发酵过程；所述发酵控制系统包括计算机、发酵罐、pH电极、碱液输送泵和底物流加泵；通过该系统自动控制发酵pH为7，同时检测碱液输送泵输送速率，计算机根据碱液输送速率和上述函数关系式可计算出底物流加速率，通过自动流加底物控制发酵罐中甘油浓度；控制底物浓度范围为10-35g/L，直至发酵进行到16-24h，关闭补料系统，等剩余底物浓度降为2-8g/L时结束发酵。
9.一种适于工业生产的序列接种发酵工艺，其特征在于，所述工艺为：在接种后的发酵罐进行发酵进程中，当所述发酵罐中菌株处于指数生长期时，将其作为种子接种至下一级发酵罐中进行发酵，重复循环此接种过程至下一级发酵罐中发酵，从而多个发酵罐同时发酵。
10.根据权利要求9所述的一种适于工业生产的序列接种发酵工艺，其特征在于，所述工艺包括：
(1)制备种子液：将菌株接种于种子培养基制备一级种子液，或根据工业生产所需放大倍数制备一级以上种子液；
(2)发酵培养：将上述对应种子液接入发酵罐中进行一级发酵；
(3)序列接种：当一级发酵进行至OD650>1时，将1-5％的一级发酵液作为种子液接种至下一发酵罐中进行二级发酵，一级发酵继续进行至发酵结束；当二级发酵进行至OD650>1时，将1-5％的二级发酵液作为种子液接种至下一发酵罐中进行三级发酵，一、二级发酵继续进行至结束；重复以上接种步骤开始下一级发酵，如此循环进行序列接种和重复发酵，保证多个发酵罐同时发酵。
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