CN107574189A - 一种基于丁酸梭菌的1,3‑丙二醇的发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于丁酸梭菌的1，3‑丙二醇的发酵生产方法，在发酵培养基中添加活性炭进行发酵生产，通过该活性炭对发酵产物的吸附，解除产物抑制作用，从而提高菌体活性和1，3‑丙二醇生产强度，其中活性炭的添加量为每升发酵培养基添加30～100g活性炭。与未添加活性炭相比，本发明的1，3‑丙二醇产率得到较大的提升。

Description

一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇的发酵生产方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇的发酵生产方法。

背景技术

1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，还可用作药物合成中间体。其最主要的用途是作为聚合体单体合成性能优异的高分子材料，特别是作为单体与对苯二甲酸合成新型聚酯材料-聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。目前工业化生产PDO的方法主要有化学法和生物法，化学法具有高温高压，技术难度大，装置投资高等缺点。而生物法具有利用可再生资源，操作简便，反应条件温和，副产物少，环境污染小等优点，其中利用丁酸梭菌进行发酵生产1，3-丙二醇可以利用生物柴油肥料粗甘油，且不需要添加昂贵的维生素B12，但该方法在发酵过程中存在严重的产物抑制，生产效率的提高幅度一直很有限。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇的发酵生产方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇的发酵生产方法，在发酵培养基中添加活性炭进行发酵生产，通过该活性炭对发酵产物的吸附，解除产物抑制作用，从而提高菌体活性和1，3-丙二醇生产强度，其中活性炭的添加量为每升发酵培养基添加30～100g活性炭。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

(1)种子液制备：将丁酸梭菌甘油管接入灭菌的RCM培养基中，培养温度30～38℃，培养时间18～26h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3～10v/v％接种量接入种子培养基，30～37℃，培养18～26h，得到二级种子液；

(2)发酵培养：向发酵罐内装入发酵罐体积40-80％的发酵培养基，再加入活性炭，通氮气20～40min以除氧，然后接入步骤(1)制备的二级种子液进行发酵，接种量3～10％；发酵条件为：发酵温度34～38℃，转速0～300r/min，发酵过程通过通氮气保持厌氧环境；

(3)连续分批培养：步骤(3)中的发酵结束后，将发酵液倒出，留下活性炭，再加入发酵罐体积40～80％的发酵培养基，通氮气20～40min以除氧，然后将上一批发酵液作为种子液接入发酵培养基，发酵条件同(2)；

(4)发酵结束后继续重复步骤(3)。

进一步优选的，所述RCM培养基的配方如下：每升RCM培养基含有胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、氯化钠3g、无水乙酸钠3g、可溶性淀粉1g和一水半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH用2mol/L的NaOH调节为8.5。

进一步优选的，所述种子培养基的配方为：每升种子培养基中含有甘油20～40g、K₂HPO₄·3H₂O 4.45g、KH₂PO₄ 1.3g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL、Fe溶液1mL，pH＝6.8～7.2。

进一步优选的，每升所述微量元素溶液中各组分的含量如下：ZnCl₂ 0.07g、MnCl₂·4H₂O 0.1g、H₃BO₃ 0.06g、CoCl₂·6H₂O 0.2g、CuCl₂·2H₂O 0.02g、NiCl₂·6H₂O0.025g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.035g、浓度为37％的HCl 0.9mL。

进一步优选的，每升所述Fe溶液中含有FeSO₄·7H₂O 5g和浓度为37％的HCl 4mL。

在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基的配方如下：每升发酵培养基中含有甘油40～100g、K₂HPO₄·3H₂O 1g、KH₂PO₄ 0.5g、(NH4)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。

在本发明的一个优选实施方案中，所述活性炭为粉末状或颗粒状的竹炭、木炭、果壳炭或椰壳炭。

本发明的有益效果：本发明的通过在发酵培养基中添加适量的活性炭，通过活性炭对菌体的吸附，能够明显减少产物抑制作用，从而延长菌体连续分批发酵批次和1，3-丙二醇产率，与未添加活性炭相比，本发明的1，3-丙二醇产率得到较大的提升。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

菌种：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)；

发酵方式：机械搅拌罐，连续分批发酵；

具体过程如下：

(1)种子液制备：将丁酸梭菌甘油管接入灭菌的RCM培养基中，培养温度30～38℃，培养时间18～26h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3～10v/v％接种量接入种子培养基，30～37℃，培养18～26h，得到二级种子液；

(2)发酵培养：向5L发酵罐内装入发酵罐体积60％的发酵培养基，再加入150g活性炭，通氮气20～40min以除氧，然后接入步骤(1)制备的二级种子液进行发酵，接种量3～10％；发酵条件为：发酵温度37℃，转速0～300r/min，发酵过程通过通氮气保持厌氧环境，pH通过氢氧化钠控制在7.00；

(3)连续分批培养：步骤(3)中的发酵结束后，将发酵液倒出，留下活性炭，再加入发酵罐体积40～80％的发酵培养基，通氮气20～40min以除氧，然后将上一批发酵液以5％的体积比作为种子液接入发酵培养基，发酵条件同(2)；

(4)发酵结束后继续重复步骤(3)3次。

上述发酵过程以相同条件不加活性炭培养一罐作为空白对照。

上述RCM培养基的配方如下：每升RCM培养基含有胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、氯化钠3g、无水乙酸钠3g、可溶性淀粉1g和一水半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH用2mol/L的NaOH调节为8.5。

上述种子培养基的配方为：每升种子培养基中含有甘油20～40g、K₂HPO₄·3H₂O4.45g、KH₂PO₄ 1.3g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL、Fe溶液1mL，pH＝6.8～7.2。每升所述微量元素溶液中各组分的含量如下：ZnCl₂0.07g、MnCl₂·4H₂O 0.1g、H₃BO₃ 0.06g、CoCl₂·6H₂O 0.2g、CuCl₂·2H₂O 0.02g、NiCl₂·6H₂O 0.025g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.035g、浓度为37％的HCl 0.9mL。每升所述Fe溶液中含有FeSO₄·7H₂O 5g和浓度为37％的HCl 4mL。

上述发酵培养基的配方如下：每升发酵培养基中含有甘油80g、K₂HPO₄·3H₂O1g、KH₂PO₄ 0.5g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。

发酵结果：第一批1，3-丙二醇浓度为34.29g/L，生产强度为1.91g/(L·h)；第二批1，3-丙二醇浓度为35.74g/L，生产强度为1.93g/(L·h)；第三批1，3-丙二醇浓度为32.67g/L，生产强度为1.81g/(L·h)；第四批1，3-丙二醇浓度为33.43g/L，生产强度为1.86g/(L·h)。空白对照组在第三批后期菌体大量休眠。证明此方法有利于菌体长时间培养稳定性。

实施例2

菌种：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)；

发酵方式：机械搅拌罐，连续分批发酵；

具体过程如下：

(1)种子液制备：将丁酸梭菌甘油管接入灭菌的RCM培养基中，培养温度30～38℃，培养时间18～26h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3～10v/v％接种量接入种子培养基，30～37℃，培养18～26h，得到二级种子液；

(2)发酵培养：向5L发酵罐内装入发酵罐体积60％的发酵培养基，再加入150g活性炭，通氮气20～40min以除氧，然后接入步骤(1)制备的二级种子液进行发酵，接种量3～10％；发酵条件为：发酵温度37℃，转速0～300r/min，发酵过程通过通氮气保持厌氧环境，pH通过氢氧化钠控制在7.00；

(3)连续分批培养：步骤(3)中的发酵结束后，将发酵液倒出，留下活性炭，再加入发酵罐体积40～80％的发酵培养基，通氮气20～40min以除氧，然后将上一批发酵液以5％的体积比作为种子液接入发酵培养基，发酵条件同(2)；

(4)发酵结束后继续重复步骤(3)3次。

上述发酵过程以相同条件不加活性炭培养一罐作为空白对照。

上述RCM培养基的配方如下：每升RCM培养基含有胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、氯化钠3g、无水乙酸钠3g、可溶性淀粉1g和一水半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH用2mol/L的NaOH调节为8.5。

上述种子培养基的配方为：每升种子培养基中含有甘油20～40g、K₂HPO₄·3H₂O4.45g、KH₂PO₄ 1.3g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL、Fe溶液1mL，pH＝6.8～7.2。每升所述微量元素溶液中各组分的含量如下：ZnCl₂0.07g、MnCl₂·4H₂O 0.1g、H₃BO₃ 0.06g、CoCl₂·6H₂O 0.2g、CuCl₂·2H₂O 0.02g、NiCl₂·6H₂O 0.025g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.035g、浓度为37％的HCl 0.9mL。每升所述Fe溶液中含有FeSO₄·7H₂O 5g和浓度为37％的HCl 4mL。

上述发酵培养基的配方如下：每升发酵培养基中含有甘油100g、K₂HPO₄·3H₂O 1g、KH₂PO₄ 0.5g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。

发酵结果：第一批1，3-丙二醇浓度为42.89g/L，生产强度为2.14g/(L·h)；第二批1，3-丙二醇浓度为45.78g/L，生产强度为1.91g/(L·h)；第三批1，3-丙二醇浓度为44.48g/L，生产强度为1.85g/(L·h)；第四批1，3-丙二醇浓度为42.39g/L，生产强度为2.12g/(L·h)。空白对照组在第三批后期菌体大量休眠。证明此方法有利于菌体长时间培养稳定性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇的发酵生产方法，其特征在于：在发酵培养基中添加活性炭进行发酵生产，通过该活性炭对发酵产物的吸附，解除产物抑制作用，从而提高菌体活性和1，3-丙二醇生产强度，其中活性炭的添加量为每升发酵培养基添加30～100g活性炭。

2.如权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)种子液制备：将丁酸梭菌甘油管接入灭菌的RCM培养基中，培养温度30～38℃，培养时间18～26h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3～10v/v％接种量接入种子培养基，30～37℃，培养18～26h，得到二级种子液；

(2)发酵培养：向发酵罐内装入发酵罐体积40-80％的发酵培养基，再加入活性炭，通氮气20～40min以除氧，然后接入步骤(1)制备的二级种子液进行发酵，接种量3～10％；发酵条件为：发酵温度34～38℃，转速0～300r/min，发酵过程通过通氮气保持厌氧环境；

(3)连续分批培养：步骤(3)中的发酵结束后，将发酵液倒出，留下活性炭，再加入发酵罐体积40～80％的发酵培养基，通氮气20～40min以除氧，然后将上一批发酵液作为种子液接入发酵培养基，发酵条件同(2)；

(4)发酵结束后继续重复步骤(3)。

3.如权利要求2所述的发酵生产方法，其特征在于：所述RCM培养基的配方如下：每升RCM培养基含有胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、氯化钠3g、无水乙酸钠3g、可溶性淀粉1g和一水半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH用2mol/L的NaOH调节为8.5。

4.如权利要求2所述的发酵生产方法，其特征在于：所述种子培养基的配方为：每升种子培养基中含有甘油20～40g、K₂HPO₄·3H₂O 4.45g、KH₂PO₄ 1.3g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL、Fe溶液1mL，pH＝6.8～7.2。

5.如权利要求4所述的发酵生产方法，其特征在于：每升所述微量元素溶液中各组分的含量如下：ZnCl₂ 0.07g、MnCl₂·4H₂O 0.1g、H₃BO₃ 0.06g、CoCl₂·6H₂O 0.2g、CuCl₂·2H₂O0.02g、NiCl₂·6H₂O 0.025g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.035g、浓度为37％的HCl 0.9mL。

6.如权利要求4所述的发酵生产方法，其特征在于：每升所述Fe溶液中含有FeSO₄·7H₂O5g和浓度为37％的HCl 4mL。

7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的发酵生产方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方如下：每升发酵培养基中含有甘油40～100g、K₂HPO₄·3H₂O 1g、KH₂PO₄ 0.5g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。

8.如权利要求1至6中任一权利要求所述的发酵生产方法，其特征在于：所述活性炭为粉末状或颗粒状的竹炭、木炭、果壳炭或椰壳炭。