CN104560779A - 一种丁酸梭菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丁酸梭菌及其应用，该丁酸梭菌于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.9626。本发明的丁酸梭菌易于培养，具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强度，而且对底物和产物具有较高的耐受性。

Description

一种丁酸梭菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌及其应用。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-propanediol，简写：1,3-PD)是一种重要的化工原料，作为一种典型的二醇化合物，被广泛地应用于润滑剂、染料、油墨、防冻剂、溶剂和制药工业等行业，还可合成聚氨酯等聚合物。1,3-丙二醇脱水和脱氢可以生产与四氢呋喃和γ-丁内酯化学性质类似的产品，如氧杂环丁烷，并通过开环聚合反应生产类似于聚四亚甲基醚二醇(PTMEG)的新型聚合物，或作为涂料中的反应溶剂。1,3-丙二醇和对苯二甲酸能够合成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)，使得1,3-丙二醇倍受世人关注。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。PTT与PET、PBT相比除具有聚酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如良好回弹性、抗污性、抗褶皱性，且易于染色、手感柔软、富有弹性、易干、低静电性、生物降解性等特性，由于PTT的具有以上优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。
现有技术中，1,3-丙二醇生产方法主要为化学合成法。化学法路线是化工原料经过一系列化学催化反应最终合成1,3-丙二醇，该方法原料成本高、所用试剂容易造成环境污染。生物法是指微生物，故成为现在1,3-丙二醇的主要生产方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌。
本发明的另一目的在于提供上述丁酸梭菌的筛选方法。
本发明的再一目的在于提供上述丁酸梭菌的应用。
本发明的具体技术方案如下：
一种丁酸梭菌(Clostridium butyricum)M01，于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.9626，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
上述丁酸梭菌M01从土壤样品中筛选得到，具体的筛选方法包括如下步骤：
取采集样品1g，加入到9mL梭菌增殖液体培养基中，37℃密封富集培养24h后转入种子培养基，37℃厌氧选择性富集培养24h后进行高效液相色谱分析发酵产物，选取能够生产1,3-丙二醇的阳性菌；于厌氧工作箱内，平板划线分离出单菌落，选取能够生产1,3-丙二醇和培养特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16SrDNA序列分析鉴定；
上述梭菌增殖液体培养基为：胰蛋白胨，10g/L；牛肉膏，10g/L；酵母粉，3g/L；葡萄糖，5g/L；NaCl，3g/L；NaAc，3g/L；可溶性淀粉，1g/L；半胱氨酸盐酸盐，0.5g/L；pH 7.5；
在本发明的一个优选实施方案中，所述种子培养基为：甘油，10～40g/L；K2HPO4·3H2O，2～5g/L；KH2PO4，1～3g/L；(NH4)2SO4，2～5g/L；MgSO4·7H2O，2～5g/L；CaCl2·2H2O，2～5g/L；酵母粉，1～10g/L；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液，1～10mL/L；自然pH。
进一步优选的，每升所述Fe溶液中含有FeSO4·7H2O1～10g；37％HCl1～40mL。
进一步优选的，每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2，0.01～0.2g；MnCl2·4H2O，0.01～0.2g；H3BO3，0.01～0.1g；CoCl2·6H2O，0.1～0.5g；CuCl2·2H2O，0.01～0.05g；NiCl2·6H2O，0.02～0.05g；Na2MoO4·2H2O，0.01～0.06g；37％HCl，1～9mL。
一种应用上述丁酸梭菌M01生产1,3-丙二醇的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：用无菌注射器取1～10mL丁酸梭菌M01菌液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养8～16h，以获得一级种子培养液；
(2)种子扩大培养：用无菌注射器取1～10mL种子液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养2～8h，以获得二级种子培养液；
(3)发酵罐培养：在33～39℃、100～250rpm(优选150-250rpm)、氮气0.5～10vvm条件下，将所述一级或二级种子培养液与发酵培养基以1:10～100的体积比进行发酵罐培养，并使发酵液的pH保持为6.5～7.5(优选向所述发酵液中流加浓度为1～15mol/L的NaOH)，以生产所述1,3-丙二醇(可用高效液相色谱对所生产的1,3-丙二醇进行定性和定量分析)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述种子培养基为：甘油，10～40g/L；K2HPO4·3H2O，2～5g/L；KH2PO4，1～3g/L；(NH4)2SO4，2～5g/L；MgSO4·7H2O，2～5g/L；CaCl2·2H2O，2～5g/L；酵母粉，1～10g/L；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液，1～10mL/L；自然pH。
在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基为：甘油30～500g/L； K2HPO4·3H2O，0.1～2.0g；KH2PO4，0.1～2.0g；(NH4)2SO4，0.5～5.0g；MgSO4·7H2O，0.1～1.0g；CaCl2·2H2O，0.01～0.2g；酵母粉，0.5～5.0g；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液1～10mL/L。
进一步优选的，每升所述Fe溶液中含有FeSO4·7H2O1～10g；37％HCl1～40mL。
进一步优选的，每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2，0.01～0.2g；MnCl2·4H2O，0.01～0.2g；H3BO3，0.01～0.1g；CoCl2·6H2O，0.1～0.5g；CuCl2·2H2O，0.01～0.05g；NiCl2·6H2O，0.02～0.05g；Na2MoO4·2H2O，0.01～0.06g；37％HCl，1～9mL。
本发明的有益效果是：
1、本发明的丁酸梭菌易于培养，具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强度，而且对底物和产物具有较高的耐受性；
2、本发明的方法通过丁酸梭菌利用可再生的原料甘油或者葡萄糖合成1,3-丙二醇，相对化学法工艺路线，微生物发酵法具有原料可再生、污染小和成本低等优点。
说明书附图
图1为本发明实施例3中发酵罐培养阶段的发酵曲线，其中■为甘油，□为1,3-丙二醇，▲为乙酸，△为丁酸，○为菌体干重；
图2为本发明实施例4中发酵罐培养阶段的发酵曲线，其中■为甘油，□为1,3-丙二醇，▲为乙酸，△为丁酸，○为菌体干重；
图3为本发明实施例4获得的1,3-丙二醇的高效液相色谱分析结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
1、菌种的分离和纯化
(1)取采集样品1g，加入到9mL梭菌增殖液体培养基中，37℃密封富集培养24h；
(2)转入种子培养基，37℃厌氧选择性富集培养24h后进行高效液相色谱分析发酵产物，选取能够生产1,3-丙二醇的阳性菌；
(3)于厌氧工作箱内，平板划线分离出单菌落，选取能够生产1,3-丙二醇和培养特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16SrDNA序列分析鉴定，最终获得一株能够生产1,3-丙二醇的丁酸梭菌M01；
上述梭菌增殖液体培养基为：胰蛋白胨，10g/L；牛肉膏，10g/L；酵母粉，3g/L；葡萄糖，5g/L；NaCl，3g/L；NaAc，3g/L；可溶性淀粉，1g/L；半胱氨酸盐酸盐，0.5g/L；pH 7.5；上述种子培养基为：甘油，10～40g/L；K2HPO4·3H2O，2～5g/L；KH2PO4，1～3g/L；(NH4)2SO4，2～5g/L；MgSO4·7H2O，2～5g/L；CaCl2·2H2O，2～5g/L；酵母粉，1～10g/L；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液，1～10mL/L；自然pH。每升所述Fe溶液中含有FeSO4·7H2O1～10g；37％HCl1～40mL。每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2，0.01～0.2g；MnCl2·4H2O，0.01～0.2g；H3BO3，0.01～0.1g；CoCl2·6H2O，0.1～0.5g；CuCl2·2H2O，0.01～0.05g；NiCl2·6H2O，0.02～0.05g；Na2MoO4·2H2O，0.01～0.06g；37％HCl，1～9mL。
2、菌种鉴定，将上述丁酸梭菌M01进行形态特征和16S rDNA序列鉴定，具体过程如下：
所筛选菌株M01菌体两端钝圆，中间部分轻度膨胀，菌体呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，短链，有丝状菌体，带鞭毛，为革兰氏阳性杆菌。在琼脂平板上形成白色或奶油色的不规则圆形菌落，稍突，直径为1～3mm，发酵过程中产1,3-丙二醇、产酸、产气。根据《伯杰细菌鉴定手册》，判断所筛选出的菌株的形态学复合丁酸梭菌的特性，初步判断为丁酸梭菌；
所述菌株M01的16S rDNA核苷酸序列如附录中序列表的SEQ ID 01所示，其与丁酸梭菌的16S rDNA同源性可达99％；
基于以上特征将筛选得到的菌株M01鉴定为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
实施例2
应用实施例1获得的丁酸梭菌M01生产1,3-丙二醇的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：用无菌注射器取1～10mL丁酸梭菌M01菌液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养8～16h，以获得一级种子培养液；
(2)种子扩大培养：用无菌注射器取1～10mL种子液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养2～8h，以获得二级种子培养液；
(3)发酵罐培养：在33～39℃、100～250rpm(优选150-250rpm)、氮气0.5～10vvm条件下，将所述一级或二级种子培养液与发酵培养基以1:10～100的体积比进行发酵罐培养，并使发酵液的pH保持为6.5～7.5(优选向所述发酵液中流加浓度为1～15mol/L的NaOH)，以生产所述1,3-丙二醇(可用高效液相色谱对所生产的1,3-丙二醇进行定性和定量分析)。
所述种子培养基为：甘油，10～40g/L；K2HPO4·3H2O，2～5g/L；KH2PO4，1～3g/L；(NH4)2SO4，2～5g/L；MgSO4·7H2O，2～5g/L；CaCl2·2H2O，2～5g/L；酵母粉，1～10g/L；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液，1～10mL/L；自然pH。所述发酵培养基为：甘油30～500g/L；K2HPO4·3H2O，0.1～2.0g；KH2PO4，0.1～2.0g；(NH4)2SO4，0.5～5.0g；MgSO4·7H2O，0.1～1.0g；CaCl2·2H2O，0.01～0.2g；酵母粉，0.5～5.0g；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液1～10mL/L。每升所述Fe溶液中含有FeSO4·7H2O1～10g；37％HCl1～40mL。每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2，0.01～0.2g；MnCl2·4H2O，0.01～0.2g；H3BO3，0.01～0.1g；CoCl2·6H2O，0.1～0.5g；CuCl2·2H2O，0.01～0.05g；NiCl2·6H2O，0.02～0.05g；Na2MoO4·2H2O，0.01～0.06g；37％HCl，1～9mL。
实施例3
利用实施例1获得的丁酸梭菌M01在5L发酵罐中生产1,3-丙二醇，包括如下步骤：
(1)种子培养：用无菌注射器取1～10mL丁酸梭菌M01菌液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养8～16h，以获得一级种子培养液；
(2)种子扩大培养：用无菌注射器取1～10mL种子液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养2～8h，以获得二级种子培养液；
(3)发酵罐培养：在37℃、150rpm、氮气0.5vvm条件下，将所述一级或二级种子培养液与发酵培养基以1:10的体积比进行发酵罐培养，发酵培养基用量为2L，并向所述发酵液中流加浓度为4mol/L的NaOH使发酵液的pH保持为7.0，以生产所述1,3-丙二醇(可用高效液相色谱对所生产的1,3-丙二醇进行定性和定量分析)，该步骤的发酵曲线如图1所示。
所述种子培养基为：甘油，20g/L；K2HPO4·3H2O，4.45g/L；KH2PO4，1.3g/L；(NH4)2SO4，2g/L；MgSO4·7H2O，2g/L；CaCl2·2H2O，2g/L；酵母粉，1g/L；微量元素溶液，1mL/L；Fe溶液，1mL/L；自然pH。所述发酵培养基为：甘油50g/L；K2HPO4·3H2O，1g；KH2PO4，0.5g；(NH4)2SO4，2g；MgSO4·7H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，0.02g；酵母粉，1g；微量元素溶液，1mL/L；Fe溶液1mL/L。每升所述Fe溶液中含有FeSO4·7H2O 5g；37％HCl 4mL。每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2，0.07g；MnCl2·4H2O，0.1g；H3BO3，0.06g；CoCl2·6H2O，0.2g；CuCl2·2H2O，0.02g；NiCl2·6H2O，0.025g；Na2MoO4·2H2O，0.035g；37％HCl，9mL。
实施例4
利用实施例1获得的丁酸梭菌M01在100L发酵罐中生产1,3-丙二醇，包括如下步骤：
(1)种子培养：用无菌注射器取1～10mL丁酸梭菌M01菌液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养8～16h，以获得一级种子培养液；
(2)种子扩大培养：用无菌注射器取1～10mL种子液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养2～8h，以获得二级种子培养液；
(3)发酵罐培养：在37℃、250rpm、氮气2.5vvm条件下，将所述一级或二级种子培养液与发酵培养基以1:20的体积比进行发酵罐培养，发酵培养基用量为60L，并向所述发酵液中流加浓度为4mol/L的NaOH使发酵液的pH保持为7.0，以生产所述1,3-丙二醇(可用高效液相色谱对所生产的1,3-丙二醇进行定性和定量分析，结果如图3所示，其中1,3-丙二醇出峰时间为20.228min)，该步骤的发酵曲线如图2所示。
各培养基同实施例1。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种丁酸梭菌M01，其特征在于：于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.9626。
2.一种权利要求1所述的丁酸梭菌M01的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
取采集样品1g，加入到9mL梭菌增殖液体培养基中，37℃密封富集培养24h后转入种子培养基，37℃厌氧选择性富集培养24h后进行高效液相色谱分析发酵产物，选取能够生产1,3-丙二醇的阳性菌；于厌氧工作箱内，平板划线分离出单菌落，选取能够生产1,3-丙二醇和培养特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16SrDNA序列分析鉴定；
上述梭菌增殖液体培养基为：胰蛋白胨，10g/L；牛肉膏，10g/L；酵母粉，3g/L；葡萄糖，5g/L；NaCl，3g/L；NaAc，3g/L；可溶性淀粉，1g/L；半胱氨酸盐酸盐，0.5g/L；pH 7.5。
3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：所述种子培养基为：甘油，10～40g/L；K2HPO4·3H2O，2～5g/L；KH2PO4，1～3g/L；(NH4)2SO4，2～5g/L；MgSO4·7H2O，2～5g/L；CaCl2·2H2O，2～5g/L；酵母粉，1～10g/L；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液，1～10mL/L；自然pH。
4.如权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于：每升所述Fe溶液中含有FeSO4·7H2O1～10g；37％HCl1～40mL。
5.如权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于：每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2，0.01～0.2g；MnCl2·4H2O，0.01～0.2g；H3BO3，0.01～0.1g；CoCl2·6H2O，0.1～0.5g；CuCl2·2H2O，0.01～0.05g；NiCl2·6H2O，0.02～0.05g；Na2MoO4·2H2O，0.01～0.06g；37％HCl，1～9mL。
6.一种应用权利要求1所述的丁酸梭菌M01生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)种子培养：用无菌注射器取1～10mL丁酸梭菌M01菌液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养8～16h，以获得一级种子培养液；
(2)种子扩大培养：用无菌注射器取1～10mL种子液接种于装有50～100mL种子培养基的血清瓶中，33～39℃、120～200rpm摇床培养2～8h，以获得二级种子培养液；
(3)发酵罐培养：在33～39℃、100～250rpm、氮气0.5～10vvm条件下，将所述一级或二级种子培养液与发酵培养基以1:10～100的体积比进行发酵罐培养，并使发酵液的pH保持为6.5～7.5，以生产所述1,3-丙二醇。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述种子培养基为：甘油，10～40g/L；K2HPO4·3H2O，2～5g/L；KH2PO4，1～3g/L；(NH4)2SO4，2～5g/L；MgSO4·7H2O，2～5g/L；CaCl2·2H2O，2～5g/L；酵母粉，1～10g/L；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液，1～10mL/L；自然pH。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基为：甘油30～500g/L；K2HPO4·3H2O，0.1～2.0g；KH2PO4，0.1～2.0g；(NH4)2SO4，0.5～5.0g；MgSO4·7H2O，0.1～1.0g；CaCl2·2H2O，0.01～0.2g；酵母粉，0.5～5.0g；微量元素溶液，1～10mL/L；Fe溶液1～10mL/L。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：每升所述Fe溶液中含有FeSO4·7H2O1～10g；37％HCl1～40mL。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2，0.01～0.2g；MnCl2·4H2O，0.01～0.2g；H3BO3，0.01～0.1g；CoCl2·6H2O，0.1～0.5g；CuCl2·2H2O，0.01～0.05g；NiCl2·6H2O，0.02～0.05g；Na2MoO4·2H2O，0.01～0.06g；37％HCl，1～9mL。
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