CN102604863B - 一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用 - Google Patents
一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1，3-丙二醇中的应用。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HSL4，该菌种已于2011年3月21日保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2011075。本发明从海洋红树林生态系统中分离、筛选的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4是肺炎克雷伯氏菌的一个新株，其具有较强的1，3-丙二醇生产能力；并且该菌株分离自海洋红树林生态系统，其对有机酸的耐受性较强。因此本发明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4对工业生产存在潜在的利用价值。
Description
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1，3-丙二醇中的应用。
背景技术：
1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂，应用于耐压高润滑剂、染料、油墨、防冻剂等行业。PDO可用来合成杂环、药物中间体、聚酯和聚氨酯，尤其是可作为聚酯PTT的单体。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性恢复性；在全范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性；抗内应力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可循还利用性等。由于PTT的具有以上优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。
生产PTT纤维的关键在于单体原料PDO的来源。PTT占领市场的关键在于价格，而PTT的价格主要取决于PDO的价格。由于不能廉价制得PDO，制约了PTT的研制和市场开拓。直到90年代中期PDO实现了工业化生产，使得PDO价格大大降低，PTT才开始工业化生产和应用。
Dupont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。化学合成法生产PDO的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备 投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。
目前1，3-丙二醇的生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1，3-丙二醇具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源(如甘油、玉米、淀粉)为原料；2、生产条件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。
生物合成法生产1，3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的1，3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1，3-丙二醇转化率和1，3-丙二醇生产强度，具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。
目前被用来生产1，3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分离自陆地土壤中。克雷伯氏菌发酵甘油生产1，3-丙二醇的同时会生产多种副产物如乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇、2，3-丁二醇等，其中乙酸、乳酸对发酵存在较强的抑制作用；由于发酵过程中自动控制pH需要流加碱液，会形成乙酸钠、乳酸钠等有机酸盐，对发酵过程也存在抑制作用；随着副产物有机酸与有机酸盐的积累，抑制了1，3-丙二醇的生产，到发酵后期，1，3-丙二醇增长缓慢。如果菌种对有机酸或有机酸盐耐受性增强，那么菌种发酵生产1，3-丙二醇的能力可以得到进一步提高。
红树林是海洋与陆地过渡的特殊生态环境，兼具有陆地和海洋的特征。红树林土壤的pH值低，呈酸性；由于海水的周期浸渍以及红树林与土壤间元素的循环作用，红树林土壤的含盐量较高，具有盐渍化特征；红树林土壤的有机质含量较高，其生态系统中具有丰富多样的微生物。如果能从红树林底泥中分离出克雷伯氏菌，其对有机酸和有机酸盐的耐受性可能较陆 地分离株更强，该特征对工业生产存在潜在的利用价值。
目前还没有利用来源于海洋或海洋与陆地过渡生境的克雷伯氏菌发酵生产1，3-丙二醇的报导。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种从海洋红树林生态系统中分离、筛选的具有生产1，3-丙二醇优良性能的克雷伯氏菌新菌株：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4，该菌种已于2011年3月21日保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2011075。
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4的分离、筛选和鉴定：
采集广东省深圳市红树林公园潮水退后的红树林间表层底泥，进行细菌富集、选择性培养，挑选菌落再进行纯培养，得到一系列不同的菌株。然后采用摇瓶发酵，初步测试所挑选的菌株发酵甘油产1，3-丙二醇的能力；挑选发酵能力最强的菌株HSL4，进行菌种鉴定。采用API 20E试剂条进行生理生化反应鉴定，API 20E试剂条鉴定结果表明所分离到的菌株HSL4属于肠杆菌科克雷伯氏菌属。常规提取菌株HSL4的基因组DNA，PCR其16S rDNA，并序列测定，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将16S rDNA序列通过GenBank中的BLAST软件与GenBank数据库中的序列进行比对，发现与数据库中已测序的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的16S rDNA相似性最高，超过99％；鉴定结果表明所分离的菌株HSL4为肺炎克雷伯氏菌的新菌株，命名为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4，该菌种已于2011年3月21日保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2011075。
采用流加补料批式发酵的方法，用分离的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4发酵甘油生产1，3-丙二醇，发酵36小时，发酵液中1，3-丙二醇浓度达到80.08g/l，生产强度达2.22g/lh，质量转化率达0.446g/g。表明该菌种具有较强的1，3-丙二醇生产能力，具备工业开发的潜力。
因此本发明的第二个目的是提供肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4在生产1，3-丙二醇中的应用。
本发明从海洋红树林生态系统中分离、筛选的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4是肺炎克雷伯氏菌的一个新株，其具有较强的1，3-丙二醇生产能力；该菌株分离自海洋红树林生态系统，其对有机酸的耐受性较强。本发明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4对工业生产存在潜在的利用价值。
本发明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4于2011年3月21日保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2011075。
附图说明：
图1是肺炎克雷伯氏菌HSL4发酵甘油生产1，3-丙二醇随发酵时间的变化图，其中PDO表示1，3-丙二醇，BDO表示2、3-丁二醇，SUC表示丁二酸，LAC表示乳酸，ACE表示乙酸，ETH表示乙醇。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、菌种的分离鉴定
1、采样：样品采自广东省深圳市红树林公园潮水退后的红树林间表层底泥，样品采集后装入灭菌的聚乙烯管中，带回实验室立即处理。
2、菌种分离、筛选：
(1)细菌分离：将样本与磷酸盐缓冲液PBS以质量比1∶50的比例混匀，静置30min，弃去下层沉淀，收集上层清液，5000g离心10min，取沉淀，用1ml PBS重悬沉淀。取100μl液体涂布于一种高效的克雷伯氏菌分离培养基MIAC，37℃培养18～24h。MIAC培养基的制备方法如下：蛋白胨20.0g、肌醇5.0g、阿东醇5.0g、氯化钠5.0g、猪胆盐5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000.0ml，将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节pH至7.0±0.2，加入0.1％结晶紫水溶液1ml，1％中性红水溶液5ml，分装适当容器，115℃高压灭菌15min，温度降至60℃左右，加入100mg/ml羧苄青霉素(经0.22μm滤膜过滤除菌)1ml，充分混匀，制成平板。选择培养18～24h后，挑选单个光滑、湿润、边缘整齐的红色菌落，直经为2～4m m，典型菌落突起、黏稠，相邻菌落会发生融合现象，从平板的背面观察，菌落具深红色心。将挑选的菌落再次进行平板划线，培养，挑选大克隆保存并进行进一步筛选。
(2)菌种筛选：将挑选的克隆进行摇瓶发酵，筛选生产1，3-丙二醇能力强的菌种进行进一步鉴定。
筛选所用培养基如下：
LB培养基(g·L-1)：酵母粉5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，NaCl 10g·L-1，琼脂10g·L-1，调节至pH 7.0。用于克雷伯氏菌菌种的短期保藏及活化。
种子及发酵培养基见表1：
表1：培养基组成表(L-1)
其中，微量元素溶液的配方见下表2。
表2：微量元素溶液配方(L-1)
菌种筛选过程：
(A)种子活化
将从步骤(1)筛选得到并甘油管保藏的菌种接种至LB培养基斜面活化，温度37℃下培养12小时活化种子。
(B)种子培养
种子培养：250mL三角瓶，装液量100mL(种子培养基)，接入步骤(A)活化的斜面菌苔一环，摇床中进行好氧种子培养，温度30℃，转速150r·min-1，培养12小时，由此获得种子培养液。
(C)发酵培养
摇瓶发酵培养：250mL三角瓶，100mL发酵培养基，将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量1％，培养温度37℃，150r·min-1摇床培养，CaC03调节pH。
(D)采用液相色谱分析发酵结果，挑选出1株生产1，3-丙二醇浓度、生产强度与得率最高的菌种，进一步进行菌种鉴定，由此筛选得到菌株HSL4。
3、菌种鉴定：
(1)API 20E生理生化试剂条鉴定
根据API 20E鉴定试剂条操作说明书，将菌株HSL4接种于API 20E生理生化反应鉴定试剂条，观察记录反应结果。反应结果如表3所示：
表3：API 20E试剂条鉴定菌株HSL4的结果
注：+阳性，-阴性
将反应结果输入数据库搜索，鉴定出所筛选的菌株HSL4属于肠杆菌科克雷伯氏菌属。
(2)16S rDNA序列测定与分析鉴定
常规提取菌株HSL4的基因组DNA，采用克雷伯氏菌16S rDNA基因引物，F：AGTTTGATCCTGGCTCA，R：TACCTTGTTACGACTTCA，进行PCR扩增，取5μl PCR反 应产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的PCR产物经过纯化进行测序，得到部分16SrDNA基因序列，序列如SEQ ID NO.1所示。
利用BLAST软件将测定得到的16S rDNA基因序列与GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行序列比对分析，结果表明所筛选的菌株HSL4的16S rDNA基因序列与已经测序并公布序列的肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae MGH 78578(GenBank：CP000647.1)、Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044(GenBank：AP006725.1)的16S rDNA序列最接近，相似性为99.8％(1494/1497)。
综合API 20E试剂条鉴定和16S rDNA序列测定与分析结果，鉴定所分离到的菌株HSL4为肠杆菌科克雷伯氏菌属肺炎克雷伯氏菌的新菌株，命名为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4，该菌于2011年3月21日保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2011075。
二、利用所分离的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4发酵甘油生产1，3-丙二醇。
将分离筛选到的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4采用5L搅拌罐进行流加补料发酵，考察其发酵甘油生产1，3-丙二醇的能力。
培养基：种子培养基同筛选菌种所用的种子培养基，发酵培养基除甘油浓度为15g/l外，其它组成同筛选菌种所用的发酵培养基。
培养方式：种子活化和种子培养同筛选菌种所用方式；发酵培养过程为：在5L搅拌发酵罐中进行时，装液量4L，接种量1％，通入0.5vvm空气进行微氧发酵培养，搅拌转速为250rpm；发酵温度均恒定在37℃，发酵过程中体系pH通过流加40％的NaOH溶液调控pH 至7.0。待菌株进入对数生长期后进行甘油补料，对数生产期甘油浓度控制在1-5g/l，进入平台期后，甘油浓度控制在10-30g/l。
发酵结果：发酵总共进行60小时，1，3-丙二醇及副产物生产情况结果见表4及图1。
表4：肺炎克雷伯氏菌HSL4发酵甘油生产1，3-丙二醇及副产物情况
采用分离的肺炎克雷伯氏菌HSL4株进行5L搅拌发酵罐流加甘油发酵结果表明，发酵36h进入平台期。发酵前36h，1，3-丙二醇浓度达到80.08g/l，生产强度达2.22g/lh，质量得率达0.446g/g。平台期后，菌种生产1，3-丙二醇缓慢，可以选择发酵36h停止发酵。
三、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4对有机酸的耐受性分析。
摇瓶培养条件下外源添加乙酸，考察乙酸对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4生产PDO的影响，分析菌株对有机酸的耐受性。
考察外源添加不同浓度的乙酸对发酵的影响。分别考察了发酵12，24小时，添加不同浓度乙酸后对生物量、甘油消耗速率、产物合成情况、生产强度、及质量得率的影响。摇瓶发酵12小时，结果见表5。
表5：添加不同浓度乙酸对发酵甘油生产1，3-丙二醇及副产物的影响
摇瓶发酵24小时，结果见表6。
表6：添加不同浓度乙酸对发酵甘油生产1，3-丙二醇及副产物的影响
从实验数据可以看出，添加不同乙酸，在发酵前期抑制菌体的生长，生物量比对照低，但后期甘油消耗完全，乙酸被部分消耗，菌体生物量比对照高，说明乙酸在发酵后期可以被菌体生长利用；乙酸对PDO生产表现出一定的抑制作用，随着添加乙酸浓度的增大，抑制作用增强，PDO的浓度、生产强度、得率都随添加乙酸浓度的增大而降低；摇瓶发酵24h，添 加1.2、3.6、6.0g/l乙酸后菌体生物量比分别对照提高41.39％、59.38％、48.07％；1，3-丙二醇浓度分别比对照降低4.34％、7.78％、29.43％；PDO得率分别比对照降低4.35％、7.83％、29.35％；发酵前期，乙酸表现出对副产物丁二酸、乳酸、2，3-丁二醇产生抑制作用，但发酵后期，乙酸表现出对副产物丁二酸、乳酸、乙醇的产生具有促进作用。
实验结果表明：在添加较高浓度乙酸的情况下，菌体生长仍然较好；虽然对PDO的浓度、生产强度、得率有一定影响，但与文献报道添加7.6g/l乙酸能抑制50％菌体生长(Chen et al.，Biotechnology Letters(2005)27：19-22)以及添加6g/l乙酸使PDO的浓度和得率较大幅度下降(Hartlep et al.，Appl Microbiol Biotechnol(2002)60：60-66)相比，本发明所分离的菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4对乙酸的耐受性较强。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4，其保藏编号：CCTCC NO：M 2011075。
2.权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4在生产1，3-丙二醇中的应用。
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