CN110564653B - 一株密歇根克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用 - Google Patents

一株密歇根克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株密歇根克雷伯氏菌及其在生产1,3‑丙二醇中的应用，属于生物工程技术领域。本发明产1,3‑丙二醇的菌株，其分类命名为密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY‑8，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2019672。本发明还提供上述菌株在1,3‑丙二醇生产中的应用。本发明所筛选的菌株密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY‑8(CCTCC M 2019672)具有较强的利用甘油为底物合成1,3‑丙二醇的能力，安全性高，好氧发酵，即使直接利用生物柴油副产的粗甘油也能高效生产1,3‑丙二醇。

Description

一株密歇根克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株密歇根克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-Propanediol，PDO)是一种重要的化工原料，作为有机溶剂应用于润滑油、染料、油墨、抗冻剂等行业，也可作为单体应用于新型聚酯对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的合成。PTT具有许多独特的性质：尼龙样的弹性恢复、良好的着色性、抗紫外、抗静电等。这些优良的性质使PTT受到了广泛的关注，进一步促进了其合成单体PDO的研究和开发。
为了角逐新型聚酯材料PTT的巨大市场，DuPont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯醛为原料生产PDO。但化学合成法生产PDO副产物较多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备投资巨大，而且其原料来源不稳定，致使化学法生产PDO的技术存在很大的难点，直接导致长期以来PDO来源受限，而限制了新型聚酯材料PTT的发展。为了应对这一问题，DuPont公司开发了一种利用生物工程生产PDO的方法，采用谷物来源的葡萄糖为底物，以基因工程改造的大肠杆菌为菌株发酵制备PDO，在全球范围内形成了技术垄断和专利封锁(US Patent US6013494A,Method for the production of1,3-propanediol by recombinant microorganisms)，目前其只在美国本土生产PDO，将其作为原料出口至世界其它国家和地区。为了打破DuPont公司的垄断，人们积极寻找DuPont公司的生物工程方法的替代路线，人们发现，自然界存在一些细菌可以利用甘油为底物合成PDO，这些细菌包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)等(BiotechnologyAdvances,2009,27:895-913)；同时，随着生物柴油产业的不断发展，其副产的甘油可以为这些细菌提供底物生产PDO，因此，利用这种甘油为底物的路线生产PDO具有较好的开发前景，得到了较多的关注。
然而，目前研究所采用的这些天然利用甘油产PDO的菌株均存在着一些缺点：
1.肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)属于条件致病，其种名中的“肺炎”二字让人闻其名而产生恐惧心理，不适合于工业化生产。
2.产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，以底物甘油发酵合成过程中产生大量有机酸，不仅不利于底物转化率和PDO得率的提高，而且有机酸的存在也不利于下游分离过程的进行。
3.丁酸梭菌(Clostridium butyricum)属于严格厌氧菌，需要严格的厌氧发酵装备和措施，给实际生产过程带来了大量的不便。
因此，从自然界中筛选出与上述菌株不同的PDO生产新菌株，对巩固甘油为底物的PDO生物发酵生产路线是十分必要的。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种从土壤中分离筛选的1,3-丙二醇生产菌株：密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8，该菌种安全性高，在好氧发酵条件下能够高效生产1,3-丙二醇。
本发明的第二个目的是提供上述菌株在1,3-丙二醇生产中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
本发明提供一株产1,3-丙二醇的菌株，其分类命名为密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM 2019672。
密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8采用如下方法分离、筛选和鉴定：采集江苏省南京市浦口区南京工业大学江浦校区内食堂污水排污口表层底泥，进行细菌富集、选择性培养，挑选菌落再进行纯培养，得到一系列不同的菌株。然后采用摇瓶发酵，初步测试所挑选的菌株发酵甘油产1,3-丙二醇的能力；挑选发酵能力最强的菌株ZY-8，进行菌种鉴定。提取菌株ZY-8的基因组DNA，PCR其16S rRNA，进行序列测定，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将16S rRNA序列通过GenBank中的BLAST软件与GenBank数据库中的序列进行比对，发现与数据库中已测序的密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)的16S rRNA相似性最高，超过99％；鉴定结果表明所分离的菌株ZY-8为产1,3-丙二醇的新菌株，命名为密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8，该菌种已于2019年8月28日保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2019672。
本发明还提供所述的菌株在生产1,3-丙二醇中的应用。
在本发明中，将密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8接种至发酵培养基，在35℃-40℃条件下发酵20-35h，发酵过程中控制发酵液的pH为6.8-7.2，菌体在对数生长期阶段进行甘油补料，控制发酵液中甘油浓度为5-10g/L；所述发酵培养基含有：酵母粉4-6g/L，K2HPO4·3H2O 9-11g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L，NH4Cl 0.8-1.2g/L，NaCl 0.3-0.7g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O0.02-0.04g/L，CoCl2·6H2O 0.004-0.006g/L，维生素B12 0.004-0.006g/L，甘油18.0-22.0g/L，pH 6.5-7.5。采用流加补料发酵的方法，用分离的密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8发酵纯甘油生产1,3-丙二醇，发酵30小时，发酵液中1,3-丙二醇浓度达到83g/L，生产强度达2.8g/Lh，质量转化率达0.45/g。表明该菌种具有较强的1,3-丙二醇生产能力，具备工业开发的潜力。
优选的技术方案中，种子液的接种量为1-3％，发酵过程中通气量为0.4-0.6vvm，搅拌转速为150-250rpm。
优选的技术方案中，将密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8活化，采用种子培养基培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基；所述种子培养基含有：酵母粉4.0-6.0g/L，蛋白胨9.0-11.0g/L，NaCl 9.0-11.0g/L，CaCO3 0.8-1.5g/L。
优选的技术方案中，密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8采用LB培养基活化。
优选的技术方案中，发酵过程中通气量为0.4-0.6vvm，搅拌转速为180-220rpm。
本发明的有益效果：本发明所筛选的菌株密歇根克雷伯氏菌(Klebsiellamichiganensis)ZY-8(CCTCC M 2019672)具有较强的利用甘油为底物合成1,3-丙二醇的能力，安全性高，好氧发酵，同时由于该菌株分离自富含有机质的污水排污口土壤，具有较强的甘油代谢能力，对多种抑制杂质具有较强的耐受力，即使直接利用生物柴油副产的粗甘油也能高效生产1,3-丙二醇。本发明的密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8对工业发酵生产1,3-丙二醇具有潜在的价值。
附图说明
图1是密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8发酵甘油生产1,3-丙二醇过程中产物及副产物随发酵时间的变化图。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1：菌种筛选及鉴定
1)菌种富集
从江苏省南京市浦口区南京工业大学江浦校区内东苑食堂污水排污口表层底泥，称取3.0克，将样本与磷酸盐缓冲液(PBS)以质量比1:50的比例混匀，静置30min，弃去下层沉淀，收集上层清液，5000g离心10min，取沉淀，用1ml PBS重悬沉淀。取100μL液体涂布于克雷伯氏菌分离培养基MIAC，37℃培养24-36h。挑选单个光滑、湿润、边缘整齐的红色菌落，直经为2-4mm，典型菌落突起、黏稠，相邻菌落会发生融合现象，从平板的背面观察，菌落具深红色心。将挑选的菌落再次在MIAC培养基上划线，培养，挑选大单菌落保存并进行进一步筛选。
其中，MIAC培养基的制备方法如下：分别称取蛋白胨20.0g、肌醇5.0g、阿东醇5.0g、氯化钠5.0g、猪胆盐5.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL，将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节pH至7.0±0.2，加入0.1％结晶紫水溶液1mL，1％中性红水溶液5mL，混合均匀后分装，121℃高压灭菌15min。灭菌后，当培养基温度降至60℃左右，加入100mg/mL氨苄青霉素(经0.22μm滤膜过滤除菌)1mL，充分混匀，制成平板。
2)菌种筛选
将挑选的单菌落进行摇瓶发酵，筛选生产1,3-丙二醇能力强的菌种。
首先，对各菌株进行活化。将步骤1)筛选得到的单菌落接种至LB培养基进行斜面活化，37℃下培养12小时活化种子。
然后，制备种子液。采用250mL三角瓶，种子培养基的装液量为100mL，接入活化的斜面菌苔一环，摇床中进行好氧种子培养，发酵温度37℃，摇床转速200rpm，培养12小时，获得种子液。
最后，发酵培养。采用250mL三角瓶，发酵培养基的装液量为100mL，将种子液接种到发酵培养基中，接种量为1％，发酵温度37℃，摇床转速200rpm，发酵过程中添加终浓度为1.0g/L的CaC03以调节pH。采用高效液相色谱分析发酵结果，筛选出生产1,3-丙二醇浓度、生产强度与得率最高的菌株ZY-8。
其中，以上所涉及培养基的配方如下：
LB培养基含有(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0，溶剂为水。平板培养时，加入琼脂使其终浓度为20g/L，用于菌种保藏及活化。
种子培养基含有(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10，NaCl 10，CaCO3 1.0，溶剂为水。
发酵培养基含有(g/L)：酵母粉5.0，K2HPO4·3H2O 10，KH2PO4 2.0，NH4Cl1.0，NaCl0.5，MgSO4·7H2O 0.1，FeCl3·6H2O 0.03，CoCl2·6H2O 0.005，维生素B12 0.005，甘油30.0，pH 7.0，溶剂为水。
发酵液中残留底物甘油、产物1,3-丙二醇以及各种副产物如乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醇和2,3-丁二醇等采用DIONEX summit P680高效液相色谱仪测定。色谱柱为AminexHPX-87H柱(Bio-Rad)，柱温为60℃，检测器为SHODEX RI-101折光示差检测器，流动相为0.005mol/L H2SO4水溶液，流速为0.2mL/min，进样量为20μL。采用重蒸水配制不同浓度的各种产物标准溶液(目标产物和各种副产物：1,3-丙二醇(Fluka)、乙酸(Sigma)、乳酸(Fluka)、2,3-丁二醇(Sigma)、乙醇(Sigma)、琥珀酸(Sigma))(这里的Fluka和Sigma代表标准品的商标限定，表示其是色谱纯标准品)，根据峰面积与各种产物标准溶液的浓度关系制作标准曲线，发酵样品经离心稀释后根据峰面积计算各种产物的含量。
3)菌种鉴定
采用16S rRNA序列测定与比对法鉴定菌株ZY-8。
提取菌株ZY-8的基因组DNA，采用细菌16S rRNA基因通用引物，F：AGTTTGATCCTGGCTCA，R：TACCTTGTTACGACTTCA，进行PCR扩增，取5μL PCR反应产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的PCR产物经过纯化进行测序，得到部分16S rRNA基因序列，序列如SEQ ID NO.1所示。
利用BLAST软件将测定得到的16S rRNA基因序列与GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行序列比对分析，结果表明菌株ZY-8的16S rRNA基因序列与已经测序并公布序列的密歇根克雷伯氏菌Klebsiella michiganensis W14(GenBankNo.:NR_118335.1)的16S rRNA序列最接近，相似性为99.93％(2543/2543)。根据16S rRNA序列测定与分析结果，鉴定菌株ZY-8为密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)，保藏信息如下：
分类命名：密歇根克雷伯氏菌ZY-8
Klebsiella michiganensis ZY-8；
保藏编号为CCTCC NO:M 2019672；
保藏日期：2019年8月28日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学。
实施例2采用纯甘油为底物发酵产1,3-丙二醇
利用实施例1分离得到的密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8发酵甘油生产1,3-丙二醇，具体包括如下步骤：
(1)对密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8进行活化
将密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8接种至LB培养基进行斜面活化，37℃下培养12小时活化种子。
(2)制备种子液
采用250mL三角瓶，种子培养基的装液量为100mL，接入活化的斜面菌苔一环，摇床中进行好氧种子培养，发酵温度37℃，摇床转速200rpm，培养12小时，获得种子液。其中，种子培养基含有(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10，NaCl10，CaCO3 1.0，溶剂为水。
(3)发酵培养
发酵培养基(g/L)：酵母粉5.0，K2HPO4·3H2O 10，KH2PO4 2.0，NH4Cl 1.0，NaCl0.5，MgSO4·7H2O 0.1，FeCl3·6H2O 0.03，CoCl2·6H2O 0.005，维生素B120.005，甘油20.0，pH 7.0，溶剂为水。
采用7L发酵罐进行补料发酵，发酵罐中发酵培养基装液量为5L，种子液的接种量为1％，通气量为0.5vvm，搅拌转速为200rpm，发酵温度为37℃，发酵过程中体系pH通过发酵罐pH探头的监测，反馈给控制中心，然后自动流加酸或碱控制发酵液的pH为7.0。碱是浓度为30％(质量百分浓度)的NaOH水溶液，酸是浓度为30％(体积百分含量)的H2SO4水溶液。菌株在对数生长期阶段(发酵开始后5小时-发酵开始后30小时)，进行甘油补料，控制发酵液中甘油浓度为8-9g/L；待菌株在平台期阶段(发酵开始后30小时-发酵开始后45小时)，进行甘油补料，控制发酵液中甘油浓度为25-26g/L。其中，补料液是500g/L的甘油水溶液。
发酵结果：发酵60h，1,3-丙二醇及副产物生产情况结果见图1。结果表明，发酵30h进入平台期。发酵时间达到30h时，1,3-丙二醇浓度达到83g/L，生产强度达2.8g/Lh，质量得率达0.45g/g。平台期后，菌种生产1,3-丙二醇缓慢，可以选择发酵30h停止发酵。
实施例3采用粗甘油为底物发酵产1,3-丙二醇
利用实施例1分离得到的密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8发酵甘油生产1,3-丙二醇。
(1)对密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8进行活化。将密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8接种至LB培养基进行斜面活化，37℃下培养12小时活化种子。
(2)制备种子液。采用250mL三角瓶，种子培养基的装液量为100mL，接入活化的斜面菌苔一环，摇床中进行好氧种子培养，发酵温度37℃，摇床转速200rpm，培养12小时，获得种子液。其中种子培养基含有(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10，NaCl 10，CaCO3 1.0，溶剂为水。
(3)发酵培养。
发酵培养基(g/L)：酵母粉5.0，K2HPO4·3H2O 10，KH2PO4 2.0，NH4Cl 1.0，NaCl0.5，MgSO4·7H2O 0.1，FeCl3·6H2O 0.03，CoCl2·6H2O 0.005，维生素B120.005，粗甘油20.0(生物柴油副产物，主要杂质为中和反应后所产生的各种盐类、残留甲醇、甲酯、皂和游离脂肪酸)，pH 7.0，溶剂为水。
采用7L发酵罐进行补料发酵，发酵罐中发酵培养基装液量为5L，种子液的接种量为1％，通气量为0.5vvm，搅拌转速为200rpm，发酵温度为37℃，发酵过程中体系pH通过发酵罐pH探头的监测，反馈给控制中心，然后自动流加酸或碱控制发酵液的pH为7.0。碱是浓度为30％(质量百分浓度)的NaOH水溶液，酸是浓度为30％(体积百分浓度)的H2SO4水溶液。菌株在对数生长期阶段(发酵开始后5小时-发酵开始后30小时)，进行粗甘油补料，控制发酵液中甘油浓度为5-10g/L；待菌株在平台期阶段(发酵开始后30小时-发酵开始后45小时)，控制发酵液中甘油浓度为20-30g/L。
发酵结果：采用粗甘油并未延长发酵周期，进入平台期的时间仍然在30h左右。发酵时间达到30h时，1,3-丙二醇浓度达到80g/L，生产强度达2.867g/Lh，质量得率达0.44g/g。
SEQUENCE LISTING
<110> 常州新东化工发展有限公司
南京工业大学
<120> 一株密歇根克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用
<130> 20191008
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1395
<212> DNA
<213> 密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis) ZY-8
<400> 1
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gccttgtaca caccg 1395

Claims (7)

1.一株产1,3-丙二醇的菌株，命名为密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)ZY-8，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2019672。
2.权利要求1所述的菌株在生产1,3-丙二醇中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于将密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis) ZY-8接种至发酵培养基，在35℃-40℃条件下发酵20-35h，发酵过程中控制发酵液的pH为6.8-7.2，菌体在对数生长期阶段进行甘油补料，控制发酵液中甘油浓度为5-10 g/L；所述发酵培养基含有：酵母粉4-6g/L，K2HPO4·3H2O 9-11g/L，KH2PO4 1.5-2.5g/L，NH4Cl 0.8-1.2g/L，NaCl 0.3-0.7g/L，MgSO4·7H2O 0.08-0.12g/L，FeCl3·6H2O 0.02-0.04g/L，CoCl2·6H2O 0.004-0.006g/L，维生素B12 0.004-0.006g/L，甘油18.0-22.0g/L，pH 6.5-7.5。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于种子液的接种量为1-3%，发酵过程中通气量为0.4-0.6vvm，搅拌转速为150-250rpm。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于将密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis) ZY-8活化，采用种子培养基培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基；所述种子培养基含有：酵母粉4.0-6.0g/L，蛋白胨9.0-11.0g/L，NaCl 9.0-11.0g/L，CaCO3 0.8-1.5g/L。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis) ZY-8采用LB培养基活化。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于发酵过程中通气量为0.4-0.6vvm，搅拌转速为180-220 rpm。
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