CN100567478C - 甲烷氧化菌的一种培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲烷氧化菌的培养方法。该方法是在甲烷氧化混合菌常规培养方法的基础上，在培养基中添加正十六烷。在用本发明的方法对甲烷氧化菌进行振荡培养的过程中，正十六烷受到机械力的剪切作用形成微小的分散液滴，这些液滴可以提高甲烷的溶解度，而且由于其与菌体细胞的亲和性，细胞可以在水相和有机相之间穿梭，强化了微生物利用甲烷的速度。与常规培养方法相比，本发明方法可以极大程度的提高甲烷氧化菌的生长速度和细胞密度，且培养方法简单，具有较高的工业化应用可行性。基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌的培养及其工业应用中发挥巨大作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的培养方法，特别是涉及甲烷氧化菌的一种快速、高密度的培养方法。
背景技术
甲烷氧化菌是自然界中一类特殊的微生物，它以甲烷为唯一碳源及能源。虽然某些甲烷氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能以多碳化合物作为碳源进行生长。
甲烷氧化菌不但在全球甲烷温室气体控制方面起到重要作用，而且在水陆生态环境的元素循环中也发挥着不可忽视的作用。甲烷氧化菌以其多样的催化功能，在大宗化学品生产、新功能酶开发、瓦斯气体的安全预警和应急技术开发以及环境污染物的生物修复方面都具有极大的应用潜力。
甲烷氧化菌利用甲烷的第一步是在甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase，MMO)的作用下将甲烷直接转化为甲醇。甲烷单加氧酶是生物体系中唯一能够在常温常压下选择性氧化甲烷生成甲醇的酶系，具有转化效率高，选择性好的优点(Richard S.Hanson，Thomas E.Hanxon.Methanotrophic Bacteria.Microbiological Reviews.1996(60)：439-471)。利用含MMO的甲烷氧化菌不仅可以将甲烷部分氧化成中间代谢产物甲醇，进一步转化成二氧化碳，还可以催化C1-C20烷烃化合物羟基化和C2-C10烯烃化合物的环氧化。甲烷氧化菌的MMO还具有氧化三氯甲烷、三氯乙烯、二氯甲烷等卤代烃类化合物的特性，在难降解的有机化合物的污染治理方面应用前景广阔。目前，国外在利用甲烷氧化菌治理三氯乙烯的污染方面进行了应用研究(Laurence H.Smith，Peter K.Kitanidis，Perry L.M cCarty.Numerical Modeling andUncertianties in Rate Coefficients for Methane Utilization and TCECometabolism by a Methane-Oxidizing Mixed Cuture.Biotechnol Bioeng 1997(53)：320-331.)。此外，由于甲烷氧化菌可以代谢利用甲烷，对于煤矿和气田的瓦斯气体泄漏的处理也具有重要的应用价值。由于甲烷单加氧酶氧化甲烷生成甲醇的过程需要NADH，因此该酶价格昂贵，此外该酶的体外再生技术不成熟，纯化过程复杂，稳定性差，因此利用含MMO的甲烷氧化菌进行整细胞催化成为上述工业应用的主要途径。一般情况下，由于甲烷在水溶液中的溶解度低，甲烷氧化菌利用甲烷的效率低，导致甲烷氧化菌生长速率慢、所得细胞浓度低，并且纯培养的甲烷氧化菌通常增长缓慢，因此细胞密度低成为限制甲烷氧化菌及其混合菌工业化应用的瓶颈问题。强化气液传质是建立甲烷氧化菌快速高密度培养及其应用体系的关键技术之一。因此，强化气液传质，提高气液传质速率是实现甲烷氧化菌及其混合菌高密度细胞培养首先需要解决的问题。传统的解决办法是增加气速和搅拌速率，但增加气速和搅拌速率，一方面将导致大量泡沫生成，从而降低反应器的使用效率；另一方面，气速和搅拌速率的增加，必然会增大动力消耗，增加操作成本。与培养一般好氧微生物细胞不同，在甲烷氧化菌的细胞培养过程中，不仅需要空气或氧气，而且需要甲烷气体。此外，当甲烷与空气或氧气的混合比例超过一定范围时还会有爆炸的危险；增大气流速度必然会使气体大量循环，导致工艺复杂，动力消耗增加。因此迫切需要一种甲烷氧化混合菌的快速、高密度培养方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲烷氧化菌较快速、高密度的培养方法。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种甲烷氧化菌的快速、高密度培养方法，是在常规培养甲烷氧化菌的液体培养基中添加正十六烷，形成两相培养体系，其它培养条件与常规培养方法相同。
用上述方法对甲烷氧化菌进行培养时，只需将正十六烷直接加入常规培养甲烷氧化菌的液体培养基中即可。正十六烷的添加量与培养容器的形状及培养方法有关，其在培养基中的体积百分含量优选为0.1-20％。
为获得更高的培养效率，所述正十六烷优选为经甲烷饱和的正十六烷。
所述对正十六烷用甲烷进行饱和的方法，是将正十六烷置于充满甲烷和空气的密闭器皿中进行振荡，使甲烷和氧分子尽可能地溶解于正十六烷中。
此外，还可在上述甲烷氧化菌的培养过程中，向所述液体培养基中通入甲烷和氧气，气体通入量为10-20mL/升培养基，其中，甲烷和氧气的体积比范围为1∶0.5-1.5。
用上述方法培养得到的甲烷氧化菌也属于本发明的保护范围。
本发明公开了一种甲烷氧化菌的培养方法。该方法是在甲烷氧化菌常规培养方法的基础上，在培养基中添加正十六烷。在用本发明的方法对甲烷氧化菌进行振荡培养的过程中，正十六烷受到机械力的剪切作用形成微小的分散液滴，这些液滴可以提高甲烷的溶解度，而且由于其与菌体细胞的亲和性，细胞可以在水相和有机相之间穿梭，强化了微生物利用甲烷的速度。与常规培养方法相比，本发明的方法可以极大程度地提高甲烷氧化菌的生长速度和细胞密度，且培养方法简单，具有较高的工业化应用可行性。基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌的培养及其工业应用(如生物催化、瓦斯气体治理、垃圾填埋场甲烷气的降解和/或生物修复等)中发挥巨大作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为甲烷氧化菌的液体培养装置示意图
图2为正十六烷对甲烷氧化菌Methylosinus.trichosporium R(CGMCC NO.1894)生长速度影响的比较实验中1mL培养菌液中菌体湿重的测定结果
图3为正十六烷对甲烷氧化菌Methylosinus.trichosporium R(CGMCC NO.1894)生长速度影响的比较实验中1mL培养菌液中的菌体重悬后的OD600值测定结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为去离子水。
NMS(Higgens nitrate minimal salt)液体培养基配方：每升培养基中含有NaNO30.85克，KH2PO4 0.53克，Na2HPO4 2.17克，K2SO4 0.17克，MgSO4·7H2O 0.037克，CaCl2·2H2O0.007克，微量元素贮存液2毫升，1mmol/L H2SO4 0.5毫升，FeSO4·7H2O 11.2毫克，CuSO4·5H2O 2.5毫克(固体培养基再添加1.5％的琼脂)，pH 7.0。
微量元素贮存液的配方为：每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042克，MnSO4·4H2O0.223克，H3BO3 0.062克，Na2MoO4·2H2O 0.048克，CoCl2·6H2O 0.048克，KI 0.083克。
LB液体培养基配方：每升溶液中含有酵母粉5克，胰蛋白胨10克，氯化钠5克(固体培养基还需添加1.5％的琼脂)。
实施例1、本发明的甲烷氧化菌培养方法与甲烷氧化菌常规培养方法的比较
以甲烷氧化菌Methylosinus.trichosporium R(CGMCC NO.1894，该菌已于2006年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号，保藏号为CGMCC NO.1894)为例，比较本发明培养方法与甲烷氧化菌常规培养方法的培养效果，具体过程如下：
1、甲烷氧化菌Methylosinus.trichosporium R(CGMCC NO.1894)的常规培养
用常规方法对甲烷氧化菌Methylosinus.trichosporium R CGMCC NO.1894进行培养，具体方法包括以下步骤：
1)在100mL带有挡板的密闭玻璃培养瓶(因需密封，在常规发酵培养瓶的瓶口添加带进气口的盖，中科院微生物所制备)中分装30mL NMS液体培养基，121℃高压灭菌15分钟，冷却；
2)接入1.2mL OD600值为0.312的甲烷氧化菌Methylosinus.trichosporium RCGMCC NO.1894菌悬液，即接种量为4％(V/V)，加盖橡胶塞，密封；
3)用已灭菌的医用注射器抽取瓶内空气30mL，然后用已灭菌的滤膜孔径为0.2μm的气体过滤器(Sartorius，
2000)向瓶中注入相同体积的甲烷，使瓶中空气与甲烷的体积比约为1∶1，实验装置如图1所示；
4)在30℃、170rpm下振荡培养，每24h重新充入混合气体(空气∶甲烷＝1∶1，V/V)，并在相同条件下继续培养。
2、利用正十六烷对甲烷氧化菌Methylosinus.trichosporium R(CGMCC NO.1894)进行培养
取100mL带有挡板的密闭玻璃培养瓶4个，分装30mL NMS液体培养基，再分别添加0.3mL、0.75mL、1.5mL和3.0mL正十六烷(体积百分含量分别为1.0％、2.5％、5.0％、10％)，121℃高压灭菌15分钟，冷却，然后，用与上述步骤1中相同的培养方法进行培养。同时，以用步骤1中未添加正十六烷的常规培养方法培养的甲烷氧化菌为对照。培养4天后，实验组和对照组的水相菌液各取1mL，充分离心后，称取湿重，菌体湿重的统计结果如图2所示，对照组的菌体湿重为2.13g/L，1.0％、2.5％、5.0％和10％正十六烷添加组的菌体湿重分别为6.31g/L、8.25g/L、10.73g/L和12.07g/L。
为了排除正十六烷对光密度的影响，上述不同实验组的菌液各取1mL，离心，弃上清，用1mL去离子水重悬后测600nm处的光密度值，OD600值测定结果如图3所示，对照组的OD600值为0.314，1.0％、2.5％、5.0％和10％正十六烷添加组的OD600值分别为0.928、1.213、1.578和1.776。由上述实验结果可以看出，实验组的菌体湿重和OD600值均显著高于对照组的，表明本发明的培养方法可显著提高甲烷氧化菌的生长速率，从而可实现甲烷氧化菌的快速、高密度培养。
实施例2、甲烷氧化菌的培养
用本发明的方法对甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b(ATCC 55314)进行培养，具体方法如下：
1)正十六烷的甲烷溶剂饱和处理
在100mL带有挡板的密闭玻璃培养瓶中装入20mL正十六烷，121℃高压灭菌15分钟后，用已灭菌的滤膜孔径为0.2μm的气体过滤器向瓶中注入40mL甲烷，在30℃、150rpm下振荡12小时(每3小时通过0.2μm的气体过滤器补充甲烷)，得到经甲烷饱和的正十六烷。
2)利用经甲烷饱和的正十六烷对甲烷氧化菌进行培养
在100mL带有挡板的密闭玻璃培养瓶中分装30mL NMS液体培养基，再加入3mL经甲烷饱和的正十六烷，121℃高压灭菌15分钟，冷却，再用与实施例1中甲烷氧化菌常规培养方法中相同的培养条件进行培养。同时，以用实施例1中常规培养方法培养的甲烷氧化菌为对照。培养结束后，用与实施例1中相同的方法测定实验组和对照组的菌体湿重和OD600值，结果实验组的菌体湿重和OD600值均显著高于对照组的，表明本发明的培养方法可显著提高甲烷氧化菌的生长速率，从而可实现甲烷氧化菌的快速、高密度培养。
Claims (3)
1、一种甲烷氧化菌的培养方法，是在常规培养甲烷氧化菌的液体培养基中添加正十六烷；所述正十六烷在液体培养基中的体积百分含量为1.0-10％。
2、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述正十六烷为经甲烷饱和的。
3、根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述经甲烷饱和的正十六烷是将正十六烷置于充满甲烷和空气的密闭器皿中进行振荡得到的。
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| 高密度培养甲烷氧化菌的研究. 吴昊等.第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集（上）. 2006 |
| 高密度培养甲烷氧化菌的研究. 吴昊等.第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集（上）. 2006 * |
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