CN102071160B - 可利用甲烷的微杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可利用甲烷的微杆菌及其应用。该微杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2010099。其可用于制备甲烷生物吸收剂、垃圾处理剂、生物催化剂。该微杆菌克服了甲烷氧化菌菌体密度低，菌体难于扩大培养等应用困难，对甲烷有较高的亲和性。特别适用于生活垃圾填埋场、水稻田等甲烷人为源，可以广泛推广。

Description

可利用甲烷的微杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体的说涉及一种可利用甲烷的微杆菌及其应用。 
背景技术
甲烷氧化菌是一种特殊的、以甲烷为唯一碳源和能源的甲基营养型微生物，分布范围很广，在酸、碱、盐、高温、低温、贫瘠等很多环境下都发现甲烷氧化菌存在。其特殊的代谢过程和代谢产物对全球环境具有重大影响，已经引起广泛的关注。甲烷氧化菌不仅在全球甲烷消耗中起重要作用，而且在碳、氮、氧循环中也发挥着重要作用。 
甲烷氧化菌是一种革兰氏阴性菌，严格寡营养型。自1906年首次分离出甲烷氧化菌以来，至今已经发现的甲烷氧化菌共有8个属，主要包括甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊菌属(Methylocytis)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、Methylocaldum和Methylospera。根据代谢途径、膜结构、主要磷脂脂肪酸成分等系列特征，可将甲烷氧化菌分为I型、II型和X型三大类型。甲烷氧化菌对甲烷氧化途径有两条，一条是通过由乙醛酸到丝氨酸的途径，另一条是甲醛结合在磷酸核糖上生成6-磷酸阿洛酮糖的途径。这些菌可以利用任何一条途径来进行同化，总反应式： 
CH4→CH3OH→HCHO→HCOOH→CO2
甲烷氧化菌的特征酶是催化第一步反应的甲烷单加氧酶(methane monooxygenase，MMO)，MMO能断裂非常稳定的C-H键，将分子氧中的一个氧原子插入C-H中，另一个氧原子则生成水。它有两种不同的类型：颗粒状或膜结合甲烷单加氧酶(particulatemethane monooxygenase，pMMO)和可溶性甲烷单加氧酶(soluble methane monooxygenase，sMMO)。 
甲烷氧化菌研究速度过快导致了目前国内外研究报道中对该类细菌的称谓存在着不统一和歧义。以文献报道为依据，对甲烷氧化菌进行全面介绍最早可追溯到1958年，Leadbetter总结了自1906年首次发现甲烷氧化菌以来的研究成果，文章之所以提及甲烷利用细菌而不是甲烷氧化菌，主要是因为当时研究条件以及研究深度和广度的局限，并不能给出这一类菌的共同特征。在伯杰细菌手册第八版(1984)中，将这一类菌归属于了甲基单胞菌科，并定义这一类菌仅利用单碳有机化合物作为碳源，属于革兰氏阴性菌。1996年，Hanson对甲烷氧化菌的称谓进行了统一，即Methane-oxidation bacteria和Methane-utilizing bacteria都可称为methanotrophs。 
在伯杰细菌手册关于甲基单胞菌科的描述中发现了另一个重要的信息，“许多细菌是能利用多碳化合物以及单碳化合物，而不是专依靠甲烷或甲醇作为碳源和能源”。与传统意义上只以甲烷为唯一碳源和能源的甲烷氧化菌相区别，此类细菌称之为兼性营养甲烷氧化菌(facultative methanotrophs)。经典生物学研究在培养基优化中很少关注以甲烷为碳源，目前，已有一些文献报道了非甲烷氧化菌可以消耗甲烷。Wolf早在1979年就发现了可以利用甲烷的酵母菌，目前有许多甲烷利用酵母被分离和纯化，其中包括Pichiapastoris，Hansensula polymorpha，Candida spp.，and Trichsporon spp.。 
兼性营养甲烷氧化菌可以利用其它碳源，因此更易实现扩大培养。生活垃圾在漫长的降解过程中富含了丰富的微生物，前期研究表明矿化垃圾具有很好的降解甲烷能力，从生活垃圾填埋场中提取兼性营养甲烷氧化菌有望在生活垃圾填埋场等人为源甲烷减排的工程化方面取得新的突破，并为甲烷氧化在温室气体方面的工程应用提供新的平台。 
发明内容
本发明针对现有技术中甲烷生物无法工程化方面存在的不足之处，提供一种可以高效利用甲烷的微杆菌，其保藏号为CCTCC NO：M2010099，其16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。 
本发明所述的可利用甲烷的微杆菌，其菌落直径1mm左右，淡黄色，半透明，突起，边缘光滑；革兰氏染色阴性；最佳生长温度为25～40℃，pH为6.5～ 7.5。 
本发明所述的可利用甲烷的微杆菌可用于制备甲烷生物吸收剂、垃圾处理剂或生物催化剂。 
本发明的微杆菌DH(保藏号为CCTCC NO：M2010099，保藏单位为中国典型培养物保藏中心-武汉大学保藏中心，保藏日期为2010年4月25日)，从生活垃圾填埋场矿化垃圾中分离得到的。该菌可高效利用甲烷。菌株DNA的测序委托大连宝生物公司完成，微杆菌DH 16S rDNA碱基测定的长度为1397bp(SEQ ID NO：1)，碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与微杆菌属(Microbacterium sp.)的3个菌株的同源性在99％以上。通过对该菌株进行的一系列生理生化以及工艺优化试验表明，本发明提供的可利用甲烷的微杆菌(Microbacterium sp.)DH(保藏号为CCTCC NO：M2010099)，可有效解决人为源甲烷的减排，主要优点如下： 
(1)微杆菌(Microbacterium sp.)DH的发现克服了甲烷氧化菌菌体密度低，菌体难于扩大培养等应用困难。 
(2)用微杆菌(Microbacterium sp.)DH的完整细胞作为生物催化剂，液体培养菌体密度(560nm下菌液吸光度)可达到1.1以上，比传统甲烷氧化菌液体培养密度高出约50％；脱离环境体系后仍可维持较高的甲烷氧化活性；适用于高浓度甲烷氧化，血清瓶中浓度为40％(v/v)的甲烷可完全降解。 
(3)该菌利用甲烷的半饱和常数KS为7.097mmol/L，远低于目前报道的66mmol/L。半饱和常数KS越低说明菌体与底物的亲和性越高，因此该菌对甲烷有较高的亲和性。 
(4)微杆菌(Microbacterium sp.)DH扩大培养所需的培养基简单，成本低。特别适用于生活垃圾填埋场、水稻田等甲烷人为源，可以广泛推广。 
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。 
附图说明
图1是微杆菌(Microbacterium sp.)DH菌株切胶回收目的片段的DNA电 泳图，M：DL2000 DNA Marker；1：DH-PCR产物；+：正对照；-：负对照； 
图2是微杆菌(Microbacterium sp.)DH菌株的电镜扫描照片； 
图3表示微杆菌(Microbacterium sp.)DH菌株以甲烷为碳源的生长曲线； 
图4是不同碳源培养的微杆菌(Microbacterium sp.)DH菌株对甲烷降解效果图； 
图5是不同碳源培养的微杆菌(Microbacterium sp.)DH菌株代谢过程二氧化碳生产效果图。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。 
1.实验材料 
NMS培养基的组成如下(g/L)：KH2PO4 1.0g·L-1，Na2HPO4·12H2O 2.9g·L-1，MgSO4·7H2O 0.32g·L-1，(NH4)2SO4 3.0g·L-1，微量元素溶液10ml，蒸馏水990ml，pH 6.8。微量元素溶液组成如下(mg/L)：ZnSO4·7H2O 0.287；MnSO4·7H2O0.223；H3BO3 0.062；Na2MoO4·2H2O 0.048；COCl2·6H2O 0.048；KI 0.083；CaCl2·2H2O 3.5。 
垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场矿化垃圾，本实施例选取上海老港垃圾填埋场(上海市南汇区老港东部)已填埋10年的垃圾，取4mm筛下和2mm筛上垃圾颗粒，在甲烷和空气混合气中密闭驯化2周以实现菌株的复壮。 
2.菌种富集与优化实验 
1)富集培养：称取矿化垃圾1g放入100ml NMS培养基中，置于30℃、160转/min摇床振荡2h。取菌悬液2ml作为种子接入分装了20ml NMS培养基的100ml血清瓶中，加盖橡胶塞密封；用20ml甲烷气置换瓶内20ml空气，然后在30℃、160转/min条件下振荡培养一周。 
2)纯菌分离：用已冷却的无菌蒸馏水对菌液进行10倍系列稀释，制成稀释度为10-1、10-2的稀释液。采用倾注法进行NMS培养基培养。将平板倒置于真空干燥器中，并向干燥器中通入一定量的甲烷，然后用保鲜膜封口。将干燥器 置于生化培养箱中，30℃培养4～5天。将长势好的菌种进行多次传代，纯化。 
3)优化实验：利用纯菌株制备一定浓度的菌悬液，加入到装有一定量NMS培养基的血清瓶中；用甲烷置换瓶内空气，之后具塞密封。在30℃、160转/min条件下振荡培养。间隔一段时间检测菌液浓度以及生物气浓度。随着甲烷的消耗，需定期补充一定体积的氮气，以消除瓶中负压。 
3.菌种鉴定实验 
使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)进行PCR扩增目的片段。取5μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收目的片段进行DNA测序。DNA的测序委托大连宝生物公司完成。以Seq Forward、Seq Reverse、Seq Internal为引物进行DNA测序。 
4.检测方法 
菌液的OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为560nm。活细胞浓度采用平板菌落计数法确定。菌体干重通过一定体积的菌液在80℃下烘干至恒重，用精密电子天平称量。每个实验最少做2组平行试验，确保RSD小于5％。 
甲烷的检测采用气相色谱(安捷伦6890N)。色谱条件：GDX不锈钢柱(10m×2mm)，进样口温度、柱温以及检测器(TCD)温度分别为80、50、120℃，氢气为载气，流速为25ml/min，进样量0.5ml。 
实施例1微杆菌Microbacterium sp.DH的纯化与鉴定 
该菌属革兰氏阴性，平铺在整个培养皿中，表面光滑，呈现一层黄色油脂状，有的上面有淡黄色小菌落，菌落直径1mm左右，半透明，突起，边缘光滑；颜色有淡黄、黄色和桔黄色，根据培养基及培养条件颜色有所不同。细胞电镜扫描照片见图2。细胞为短杆状，中间向内凹陷，似圆盆形，外径0.6～0.7um，内径0.2～0.4um，可产生有荧光的扩散性黄色素。菌株的主要生理生化特性见表1。 
表1微杆菌Microbacterium sp.DH的理化特性 
  生理生化指标   特征   生理生化指标   特征
  苯丙氨酸脱氨酶   -   淀粉水解酶   +
  吲哚反应   -   明胶水解   -
  乙酰甲基甲醇反应   -   接触酶   +
  H2S气体产生   -   细胞色素氧化酶 -
  反硝化反应   -   柠檬酸盐利用   -
  甲基红反应   -    
+阳性，-阴性 
对微杆菌Microbacterium sp.DH菌株的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳(图1)，可以看到PCR产物的凝胶条带非常清晰，基本可以判断为纯菌株。 
实施例2菌株Microbacterium sp.DH的生长曲线 
由微杆菌Microbacterium sp.DH菌株的生长曲线(见图3)可知，微杆菌Microbacterium sp.DH菌株的延迟期较长，大约为180h。但当进入对数期后菌体生长迅速，OD值从0.161升至1.037仅用了60h，之后便达到了平稳期，生长曲线说明了该菌可以甲烷为培养基得到较大的菌体浓度。 
实施例3菌株Microbacterium sp.DH利用多碳化合物增殖实验 
用NMS培养基配置3g/L葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、淀粉、和棉子糖等7种溶液备用；取上述7种NMS培养基20ml加入100ml血清瓶中。另取1个血清瓶加入20ml NMS培养基但不加碳源作为对照。将上述培养基在121℃条件下高温蒸汽灭菌，待冷却后用微量移液器向瓶中加入1ml种子菌液，盖好胶塞摇匀，放入摇床设定在30℃、160转/min条件下培养3～5天。然后测定菌液的OD560nm值确定菌体生长情况，另抽取1.2ml左右菌液高速离心，然后取上清液以硫酸蒽酮法检测糖浓度确定碳源的消耗情况。结果见表2。所有的碳源都可被微杆菌DH利用，其中棉籽糖为碳源时消耗的最快。当以蔗糖和甘露糖为碳源时，菌液OD值分别达到了0.758和0.742，这说明以这两种糖为碳源时微杆菌DH菌增殖较快；以其它几种糖为碳源时，菌液OD值均有明显增长，表明微杆菌DH菌是一种可利用多种碳源的兼性营养甲烷氧化菌。7种常见碳源 因此对菌体生长均有促进作用，将7瓶培养的微杆菌DH菌液进行甲烷消耗实验以期获得能够降解甲烷的碳源。 
表2以不同糖为碳源培养微杆菌DH的菌体吸光度糖浓度的变化 
Figure GDA0000109584170000071
实施例4多碳化合物增殖的微杆菌DH利用甲烷效果实验 
取用实施例3中的不同多碳化合物增殖后的菌液1ml，用无碳源的NMS营养液稀释至20ml，在30℃、160转/min条件下培养22天，考察其利用甲烷的效果。由图4可知，7种碳源培养的微杆菌DH在经过约1周的调整后均可有效地氧化甲烷，其中以淀粉为碳源的效果最佳，在22天内消耗甲烷约47ml。由图5可知，二氧化碳生成体积与甲烷的消耗基本上成正比，每生成1mol的二氧化碳，消耗甲烷2mol，其余的甲烷转化为了菌体。乳糖和甘露糖为碳源的DH菌液在氧化甲烷过程中，二氧化碳的生成量较小，这说明甲烷更多转化为了菌体。 
综上可知，微杆菌DH不仅可以利用淀粉和蔗糖等经济型碳源快速生长，而且可以在此基础上实现高效地甲烷氧化。 
以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 
Figure IDA0000024876710000011
Figure IDA0000024876710000021

Claims (4)

1.一种可利用甲烷的微杆菌（Microbacterium sp.），其特征在于，其保藏号为CCTCC NO：M2010099。
2.根据权利要求1所述的可利用甲烷的微杆菌，其特征在于，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的可利用甲烷的微杆菌，其特征在于，菌落直径1 mm，淡黄色，半透明，突起，边缘光滑；革兰氏染色阴性。
4.权利要求1所述的可利用甲烷的微杆菌在制备甲烷生物吸收剂中的应用。
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