CN103224896B

CN103224896B - 可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌及其应用

Info

Publication number: CN103224896B
Application number: CN201310079222.2A
Authority: CN
Inventors: 赵天涛; 张丽杰; 邢志林; 全学军
Original assignee: Chongqing University of Technology
Current assignee: Chongqing University of Technology
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: CN103224896A

Abstract

本发明涉及一种可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌及其应用。该菌株的保藏号为CCTCCNO：M2013062。该菌能够利用乙醇、乙酸钠等多碳碳源，克服了甲烷氧化菌菌体密度低，菌体难于扩大培养等应用困难。该菌能够降解三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯等氯代烯烃，还能够降解四氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷等氯代烷烃。特别适用于废水、饮用水和土壤修复等领域应用。

Description

可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体的说涉及一种可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌及其应用。

背景技术

三氯乙烯（Trichloroethylene, TCE）、四氯乙烯（Tetrachloroethylene, PCE）等氯代烯烃和氯仿（Chloroform, CF）、三氯乙烷（Trichloroethane, TCA）等氯代烷烃作为重要的有机溶剂和产品中间体，在化工、医药、农药等领域被广泛使用。但由于使用和存储不当，通过挥发、泄漏、废水排放等方式致使环境中大量存在，严重危及人类健康。近年来的大量研究表明，三氯乙烯、氯仿等氯代烃污染物具有潜在的“三致”（致癌、致畸、致突变）效应和遗传毒性效应。如微量三氯乙烯暴露接触可导致肝、肾及中枢神经系统损伤，引起一系列机体功能紊乱症状。随着国际国内在可持续发展中对生态环境提出的更高要求，采取有效途径消除氯代烃污染已成为环境领域的重要研究内容。

从解决大面积污染的角度考虑，生物降解因其具有高效性及低成本，被认为是去除此氯代烃类污染物的最有效途径。生物降解包括了厌氧和好氧生物降解两种方式。厌氧降解常用Hyphomicrobium、Dehalococcoides等脱氯菌，能使高氯代有机物还原脱氯。脱氯菌常与产乙酸菌（homoacgtogens）和产甲烷菌（methanogens）形成聚生体，在碳源和外源电子供体存在条件下，氯代烃作为电子受体为厌氧微生物提供能源并同时被降解。但厌氧降解存在降解不彻底，脱氯后的产物往往具有更大的毒性和致癌性。而好氧降解途径可通过羟基化作用或环氧化作用使得氯代烃完全降解，具有显著优势。其中，甲烷氧化菌（Methanotrophs）降解氯代烃属于该领域的研究热点。由于甲烷单加氧酶（methane monooxygenase, MMO）的非特异性，研究人员发现其在污染物控制方面具有独特的性能。但由于甲烷氧化菌只能以甲烷或甲基化合物为碳源而难以用琼脂平板的方法分离，这使得菌体富集和扩大培养难度增加；此外细胞生长速度慢、密度低等问题也限制了甲烷氧化菌在工程上的应用。

相对专一营养甲烷氧化菌而言，兼性甲烷氧化菌（facultative methanotrophs）能够利用一些含碳碳键的有机物作为碳源和能源、更容易实现富集而展现出广阔的工程应用前景。已发现的兼性甲烷氧化菌包括了变形菌纲的Methylocella, Methylocystis和Methylocapsa。现在已有不少关于甲烷氧化菌可以利用多碳化合物为生长底物的报道，因此，兼性甲烷氧化菌似乎比原来想象中要更普遍。兼性甲烷氧化菌有着独特的生理学和底物选择特性。Methylocella是首先被确定和公认的兼性甲氧菌。大多数甲烷氧化菌都拥有颗粒甲烷单加氧酶（particulate methane monooxygenase, pMMO），也有少数同时拥有溶解甲烷单加氧酶（solution methane monooxygenase, sMMO）和pMMO。但Methylocella仅拥有sMMO，并且较常见甲烷氧化菌而言缺少广泛的胞内膜体系（intracytoplasmic membrane, ICM）。而其另一显著特点是能利用多碳化合物（乙酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸和乙醇等），有些多碳化合物是优先被兼性甲烷氧化菌利用的。

研究表明，兼性甲烷氧化菌不仅可以有效提高矿化垃圾生物覆盖层甲烷氧化能力，也对三氯乙烯、氯仿等氯代烃具有高耐受性。兼性甲烷氧化菌可以利用其它碳源，因此更易实现扩大培养。兼性甲烷氧化菌的深入研究和应用，有望在氯代烃生物降解的工程应用领域取得新的突破。

发明内容

本发明针对现有技术中氯代烃污染物好养生物降解无法工程化方面存在的不足之处，提供一种可以高效降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌，其保藏号为CCTCC NO: M 2013062（已于2013年2月27日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国湖北武汉武汉大学），分类命名为Methylocystis sp. JTA1，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌，属于甲基孢囊菌属。其细胞不能运动，无孢子，短棒状，中央凹陷，细胞外径0.2~ 0.4 μm, 长度0.6~0.8 μm。菌落直径1 mm左右，半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明；革兰氏染色阴性。最佳生长温度为25～40 ^oC，pH为6.5～7.5。

本发明所述的兼性甲烷氧化菌能够降解氯代烯烃和/或氯代烷烃。其中氯代烯烃选自三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯中的至少一种。氯代烷烃选自四氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的至少一种。

本发明所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌可在废水、饮用水和土壤修复等领域应用，可用于生物催化剂。

本发明所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌（本申请中命名为微杆菌JTA1），是从生活垃圾填埋场矿化垃圾中分离得到的，其可高效氧化甲烷。菌株DNA的测序委托大连宝生物公司完成，甲基孢囊菌属Methylocystis sp. JTA1的16S rDNA碱基测定的长度为1397 bp（SEQ ID NO:1），碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与甲基孢囊菌属（Methylocystissp.）的菌株H2s和菌株SB2同源性均在97%以上。通过对该菌株进行的一系列生理生化以及工艺优化试验表明，本发明提供的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌（Methylocystissp.）JTA1，既可利用多碳碳源生长，又可高效降解氯代烃，主要优点如下：

（1）甲基孢囊菌属（Methylocystissp.）JTA1的发现克服了甲烷氧化菌菌体密度低，菌体难于扩大培养等应用困难。

（2）用甲基孢囊菌属（Methylocystissp.）JTA1的完整细胞作为生物催化剂，液体培养菌体密度（600 nm下菌液吸光度）可达到1.23，比传统甲烷氧化菌液体培养密度高出近50%；脱离环境体系后仍可维持较高活性。

（3）该菌对氯仿具有高耐受性，可高效降解三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯等氯代烯烃和四氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷等氯代烷烃。

（4）甲基孢囊菌属（Methylocystissp.） JTA1扩大培养所需的培养基简单，成本低。特别适用于废水中氯代烃污染物降解和土壤生物修改，可以广泛推广。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1 菌株Methylocystis sp. JTA1的电镜扫描照片。

图2 菌株Methylocystis sp. JTA1以甲烷为碳源的生长曲线。

图3 菌株Methylocystis sp. JTA1 对不同浓度氯代的耐受效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

1. 实验材料

NMS培养基的组成如下(g/L)：NaNO₃，0.850；KH₂PO₄，0.530；Na₂HPO₄，0.170；MgSO₄·7H₂O，0.037；CaCl₂·2H₂O，0.007，FeSO₄·7H₂O， 0.011。微量元素溶液，2 mL；pH 6.8。微量元素溶液组成如下(mg/L)： ZnSO₄·7H₂O，0.204；CuSO₄·5H₂O，1.25；MnSO₄·4H₂O，0.223；H₃BO₃，0.062；Na₂M_OO₄·2H₂O，0.048；C_OCl₂·6H₂O，0.048。

垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场矿化垃圾，本实施例选取上海老港垃圾填埋场（上海市南汇区老港东部）已填埋10 年的垃圾，取4 mm筛下和2 mm筛上垃圾颗粒，添加一定量的氯仿并调节pH至适合兼性甲烷氧化菌生长，在甲烷和空气混合气中密闭驯化2周以实现菌株的复壮。

2. 菌种富集与优化实验

1）富集培养：称取矿化垃圾1 g放入100 ml NMS培养基中，置于30 ℃、160 转/min摇床振荡2 h。取菌悬液2 ml作为种子接入分装了20 ml NMS培养基的100 ml血清瓶中，加盖橡胶塞密封；用20 ml甲烷气置换瓶内20 ml空气，然后在30 ℃、160 转/min条件下振荡培养一周。

2）纯菌分离：用已冷却的无菌蒸馏水对菌液进行10倍系列稀释，制成稀释度为10^-1、10^-2的稀释液。采用倾注法进行NMS培养基培养。将平板倒置于真空干燥器中，并向干燥器中通入一定量的甲烷，然后用保鲜膜封口。将干燥器置于生化培养箱中，30 ℃培养4~5天。将长势好的菌种进行多次传代，纯化。

3）优化实验：利用纯菌株制备一定浓度的菌悬液，加入到装有一定量NMS培养基的血清瓶中；用甲烷置换瓶内空气，之后具塞密封。在30 ℃、160 转/min条件下振荡培养。间隔一段时间检测菌液浓度以及生物气浓度。随着甲烷的消耗，需定期补充一定体积的氮气，以消除瓶中负压。

3. 菌种鉴定实验

使用QIAquick Genomic DNA Buffer Set进行PCR扩增目的片段。取5 μl进行3%琼脂糖凝胶电泳，使用切胶回收目的片段进行DNA 测序。DNA的测序委托大连宝生物公司完成。以Seq Forward、Seq Reverse、Seq Internal 为引物进行DNA 测序。16S rRNA 扩增采用广谱引物F27 (SEQ ID NO:2 -AGAGTTTGATCATGGCTCAG) 和 R1492 (SEQ ID NO:3-TACGGTTACCTTGTTACGACTT), 溶解甲烷单加氧酶的特征基因mmoX扩增采用mmoXA (SEQ ID NO:4-ACCAAGGARCARTTCAAG )和mmoXB (SEQ ID NO:5-TGGCA CTCRTARCGCTC)，颗粒甲烷单加氧酶的特征基因pmoA扩增采用A189gc (SEQ ID NO:6-GGNGACTGGGACTTCTGG) 和mb661 (SEQ ID NO:7-CCGGMGCAACGTCYTTACC)。

4. 检测方法

菌液的OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为600 nm。活细胞浓度采用平板菌落计数法确定。菌体干重通过一定体积的菌液在80℃下烘干至恒重，用精密电子天平称量。每个实验最少做2组平行试验，确保RSD小于5%。

甲烷的检测采用气相色谱(安捷伦 6890N)。色谱条件：GDX不锈钢柱（10 m ×2 mm），进样口温度、柱温以及检测器（TCD) 温度分别为80、50、120 ℃，氢气为载气，流速为25 ml/min，进样量0.5 ml。

氯代烃的检测采用气相色谱(安捷伦 6890N)。色谱条件：GDX不锈钢柱（10 m ×2 mm），进样口温度、柱温以及检测器（ECD) 温度分别为80、50、120 ℃，氢气为载气，流速为25 ml/min，进样量0.2 ml。

实施例1 甲基孢囊菌属Methylocystissp. JTA1的纯化与鉴定

该菌属革兰氏阴性菌，菌落直径约1 mm，颜色呈白色半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽；革兰氏染色阴性。细胞电镜扫描照片见图2。细胞为短杆状，中间向内凹陷，似圆盆形，细胞外径0.2~ 0.4 μm, 长度0.6~0.8 μm。菌株JTA1的16S rDNA碱基测定的长度为1397 bp（SEQ ID NO:1），碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与甲基孢囊菌属（Methylocystissp.）的菌株H2s和菌株SB2同源性均在97%以上。

由甲基孢囊菌属Methylocystis sp. JTA1菌株的生长曲线（见图2）可知，甲基孢囊菌属Methylocystis sp. JTA1菌株的延迟期大约为15 h。当进入对数期后菌体生长迅速，OD值升至1.2仅用了25 h，之后便达到了平稳期，生长曲线说明了该菌可以甲烷为培养基得到较大的菌体浓度。

实施例2 菌株Methylocystis sp. JTA1利用碳源情况

用NMS培养基配置3 g/L的甲醇、甲酸钠、甲醛、甲胺、尿素、乙醇、乙酸钠、乳糖、葡萄糖和苹果酸钠等10种溶液备用；取上述10种NMS培养基20 ml加入100 ml血清瓶中，另取1个血清瓶加入20 ml NMS培养基但不加碳源作为对照。将上述培养基在121 ℃条件下高温蒸汽灭菌，待冷却后用微量移液器向瓶中加入1 ml种子菌液，盖好胶塞摇匀，放入摇床设定在30℃、160 转/min条件下培养3～5天。然后测定菌液的OD_600 nm值确定菌体生长情况，结果见表1。菌株JTA1可利用甲醇、乙醇和乙酸钠为碳源和能源，在乙酸钠中长势较好，但无法利用乳糖、葡萄糖等糖类化合物。

表1 Methylocystis sp. JTA1的碳源利用表

碳源	生长情况	OD_{600 nm}
			甲醇	+	0.357±0.017
甲酸钠	-	0.062±0.010
			甲醛	-	0.060±0.012
甲胺	-	0.065±0.009
			尿素	-	0.058±0.008
乙醇	+	0.213±0.016
			乙酸钠	+	0.521±0.033
乳糖	-	0.060±0.005
			葡萄糖	-	0.051±0.007
苹果酸钠	-	0.053±0.005

++：显著生长；+：生长； -：无生长

实施例3 Methylocystis sp. JTA1 对不同浓度氯代的耐受效果实验

添加OD_600 nm 1.05的JTA1菌液至20g 矿化垃圾，并分别添加50、60、80、100、150、200、300 mg/L的氯仿溶液1 ml至培养体系中。在30℃条件下培养22 天，考察其氧化甲烷的效果。由图3可知，当氯仿浓度小于80 mg/L时，菌株JTA1的活性较对照试验得到了加强。当氯仿浓度为50 mg/L时，甲烷在22天后完全氧化。当氯仿浓度大于200 mg/L时，由于氯仿的生物毒性导致了菌体完全失活。

实施例4 Methylocystis sp. JTA1 对不同氯代烃降解效果实验

配置浓度为2 g/L的三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯、四氯甲烷、三氯甲烷和二氯乙烷溶液，并各取100 uL分别添加至含有20ml NMS培养基的100 ml血清瓶中，将上述培养基在121 ℃条件下高温蒸汽灭菌，待冷却后用微量移液器向瓶中加入1 ml种子菌液，盖好胶塞摇匀，放入摇床设定在30℃、160 转/min条件下培养40小时，然后测定用气相色谱顶空测定氯代烃的含量确定氯代烃的降解效果，测定菌液的OD_600 nm值确定菌体生长情况，结果见表2。菌株JTA1可以很好的降解6种氯代烃。

表2 Methylocystis sp. JTA1 对氯代烃的降解效果

氯代烃种类	氯代烃降解量（%）	菌体生长情况
			三氯乙烯	58.9	++
二氯乙烯	36.5	++
			氯乙烯	57.1	++
四氯甲烷	53.0	++
			三氯甲烷	58.3	++
二氯乙烷	34.7	+

以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 重庆理工大学

<120> 可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌及其应用

<130> 13P99321-CN

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 甲基孢囊菌属Methylocystis sp. JTA1的16S rDNA序列

<400> 1

acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacggtga agcccagctt gctgggtgga 60

tcagtggcga acgggtgagt aacacgtgag caatctgccc ctgactctgg gataagcgct 120

ggaaacggcg tctaatactg gatacgagct gcgatcgcat ggtcagtagc tggaaagatt 180

ttttggtcag ggatgagctc gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag 240

gcgtcgacgg gtagccggcc tgagagggtg accggccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360

aacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct cttttagcag ggaagaagcg 420

aaagtgacgg tacctgcaga aaaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480

cgtagggcgc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg 540

cgtctgctgt gaaatcccga ggctcaacct cgggtctgca gtgggtacgg gcagactaga 600

gtgcggtagg ggagattgga attcctggtg tagcggtgga atgcgcagat atcaggagga 660

acaccgatgg cgaaggcaga tctctgggcc gtaactgacg ctgaggagcg aaagggtggg 720

gagcaaacag gcttagatac cctggtagtc caccccgtaa acgttgggaa ctagttgtgg 780

ggtccattcc acggattccg tgacgcagct aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac 840

ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggc ggagcatgcg 900

gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacacca gaacaccgta 960

gaaatacggg actctttgga cactggtgaa caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgttctatg ttgccagcac 1080

gtaatggtgg gaactcatgg gatactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg 1140

tcaaatcatc atgcccctta tgtcttgggc ttcacgcatg ctacaatggc cggtacaaag 1200

ggctgcaata ccgtgaggtg gagcgaatcc caaaaagccg gtcccagttc ggattgaggt 1260

ctgcaactcg acctcatgaa gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt 1320

gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcaagtc atgaaagtcg gtaacacctg 1380

aagccggtgg cccaacc 1397

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 2

agagtttgat catggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 3

tacggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 4

accaaggarc arttcaag 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 5

tggcactcrt arcgctc 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

ggngactggg acttctgg 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 7

ccggmgcaac gtcyttacc 19

Claims

1.一种可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌，其特征在于，其保藏号为CCTCC NO: M 2013062，所述兼性甲烷氧化菌属于甲基孢囊菌属。

2.根据权利要求1所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌，其特征在于，所述兼性甲烷氧化菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌，其特征在于，所述兼性甲烷氧化菌能够降解氯代烯烃和/或氯代烷烃。

4.根据权利要求3所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌，其特征在于，所述氯代烯烃选自三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌，其特征在于，所述氯代烷烃选自四氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的至少一种。

6.权利要求1所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌在降解氯代烯烃和/或氯代烷烃中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述氯代烯烃选自三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述氯代烷烃选自四氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的至少一种。

9.权利要求1所述的可降解氯代烃的兼性甲烷氧化菌在制备生物催化剂中的应用。