CN104830726B

CN104830726B - 降解氯代烃复合菌剂及其应用

Info

Publication number: CN104830726B
Application number: CN201510225401.1A
Authority: CN
Inventors: 赵天涛; 袁建华; 李雷; 何芝; 杨旭
Original assignee: Chongqing University of Technology
Current assignee: Chongqing University of Technology
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2035-05-06
Also published as: CN104830726A

Abstract

本发明涉及一种降解氯代烃复合菌剂及其应用，复合菌剂包括甲基胞囊菌、甲基杆菌、微杆菌和贪铜菌复合而成，其中甲基胞囊菌、甲基杆菌、微杆菌和贪铜菌的比例为10～30％：20～40％：10～30％：5～20％。本发明通过多种微生物的共代谢和直接氧化的方式，实现对难降解氯代烃的高效降解，有效解决了氯代烃厌氧降解过程中存在的降解不彻底或脱氯后产物毒性更大的问题，有望在氯代烃生物降解的工程应用领域取得新的突破。

Description

降解氯代烃复合菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种降解氯代烃复合菌剂及其应用。

背景技术

氯代烃作为重要的有机溶剂和产品中间体，广泛应用在化工、医药、农药等领域。由于使用和存储不当，氯代烃通过挥发、泄漏、废水排放等方式排入到自然环境中。近年来的大量研究表明，三氯乙烯等氯代烃污染物具有潜在的“三致”(致癌、致畸、致突变)效应和遗传毒性效应，如微量三氯乙烯暴露接触可导致肝、肾及中枢神经系统损伤，引起一系列机体功能紊乱症状，严重危及人类健康。随着国际、国内在可持续发展中对生态环境提出越来越高的要求，如何有效的消除氯代烃污染已成为环境保护领域的重要研究内容。

从解决大面积污染的角度考虑，生物降解因其具有高效性及低成本性，被认为是消除氯代烯烃污染物最有效的途径。生物降解包括了厌氧和好氧生物降解两种方式。厌氧降解常用Hyphomicrobium、Dehalococcoides等脱氯菌，使高氯代有机物还原脱氯。脱氯菌常与产乙酸菌(homoacgtogens)和产甲烷菌(methanogens)形成聚生体，在碳源和外源电子供体存在的条件下，氯代烃作为电子受体为厌氧微生物提供能源并同时被降解。但厌氧降解存在降解不彻底的缺陷，脱氯后的产物往往具有更大的生物毒性和致癌性。而好氧降解途径可通过羟基化作用或环氧化作用使得氯代烃完全降解，相对于降解不彻底的厌氧生物降解，好氧生物降解具有显著优势。

目前好氧降解氯代烃属于生物降解领域的研究热点。但好氧生物降解过程一般需添加碳源，并通过共代谢的形式实现对氯代烃的降解，存在着菌体难以培养，氯代烃降解活性等等问题，这在一定程度上限制了氯代烃好氧氧化在工程上的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种降解氯代烃复合菌剂，通过多种微生物的共代谢和直接氧化的方式，实现对难降解氯代烃的高效降解，并可有效解决了厌氧降解存在的降解不彻底或脱氯后产物毒性更大的问题。

本发明的技术方案是：降解氯代烃的复合菌剂，所述复合菌剂包括甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1、甲基杆菌Methylobacterium sp.R1、微杆菌Microbacteriumsp.DH、和贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1复合而成。

其中甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1、甲基杆菌Methylobacterium sp.R1、微杆菌Microbacterium sp.DH和贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1的比例为10～30％：20～40％：10～30％：5～20％。

上述降解氯代烃的复合菌剂的制备方法，有以下步骤，

1)菌种的驯化

采用氯代烃梯度驯化的方法，对甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1、甲基杆菌Methylobacterium sp.R1、微杆菌Microbacterium sp.DH和贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1进行氯代烃定向驯化；

2)菌种的扩大培养

以含碳化合物为碳源，在NMS液体培养基中分别对步骤1)驯化后的菌种进行扩大培养；

3)复合菌剂的制备

取步骤2)所得的菌液，按甲基胞囊菌：甲基杆菌：微杆菌：贪铜菌为10～30％：20～40％：10～30％：5～20％的比例混合，得到种子液，种子液富集培养至OD₆₀₀＝0.6±0.1，即得复合菌剂。

所述复合菌剂的制备方法，步骤2)中含碳化合物为葡萄糖、甲烷、乙酸钠、三氯乙烯中的任意一种。

所述复合菌剂的制备方法，步骤2)中各菌种扩大培养的方法为：

甲基胞囊菌

挑单菌落5-10环至NMS液体培养基中，密封，以甲烷为碳源，在30 ℃、160r/min条件下振荡培养7d；

甲基杆菌

挑单菌落5-10环至NMS液体培养基中，密封，以3％浓度葡萄糖为碳源，在30℃、160r/min条件下振荡培养2-4d；

微杆菌

贪铜菌

挑单菌落5-10环至NMS液体培养基中，添加饱和三氯乙烯溶液，密封，在27℃、160r/min条件下振荡培养7d。

降解氯代烃的复合菌剂在用于高效降解废水中氯代烃的用途。

本发明所述的甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1，其细胞不能运动，无孢子，短棒状，中央凹陷，细胞外径0.2-0.4μm，长度0.6-0.8μm。菌落直径1mm左右，半透明突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明；革兰氏染色阴性，最佳生长温度为25-40℃，pH为6.5-7.5。

甲基杆菌Methylobacterium sp.R1，属于甲基杆菌属，菌落直径1～2mm，半透明，圆形规则菌落，低凸起，边缘整齐，质地均匀，表面有光泽，颜色多呈黄色，为革兰氏阴性菌，无孢子，有鞭毛，以单侧生极性鞭毛运动，专性需氧，最佳生长温度为28～30℃，pH为7.0。

微杆菌Microbacterium sp.DH，其菌落直径1mm左右，淡黄色，半透明，突起，边缘光滑；革兰氏染色阴性；最佳生长温度为25-40℃，pH为6.5-7.5。

贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1，属于贪铜菌属，菌落直径1mm左右，半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明；革兰氏染色阴性。最佳生长温度为25～40℃，pH为6.5～7.5。

本发明从经氯代烃漫长驯化的生活垃圾覆盖层中富集并优化得到了可高效降解氯代烃的功能复合菌剂，不仅对复杂废水中高浓度有机物具有良好的耐受性，而且对不同环境具有良好的适应性和抗污染能力。复合菌剂中各微生物具有良好的协同作用，通过多种微生物的共代谢或者直接氧化的方式，实现对废水中难降解氯代烃的高效降解，包括三氯乙烯等氯代烯和三氯乙烷等氯代烷烃。本复合菌剂的使用可有效解决厌氧降解存在的降解不彻底或脱氯后的产物毒性更大等问题，有望在氯代烃生物降解的工程应用领域取得新的突破。

本发明所述复合菌剂中的甲基胞囊菌见授权公开号为“CN 103224896 B”的发明专利；

本发明所述复合菌剂中的甲基杆菌的保藏号为“CCTCC NO:M 2015046”(已于2015年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，分类命名为：Methylobacterium sp.R1，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所述；

本发明所述复合菌剂中的微杆菌见授权公开号为“CN 102071160 B”的发明专利；

本发明所述复合菌剂中的贪铜菌的保藏号为“CCTCC NO：M 2015045”(已于2015年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，分类命名为：Cupriavidus sp.SWA1，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:2所述。

下面结合附图和具体实施例，对本发明作详细的说明。

附图说明

图1为复合菌剂以甲烷为碳源的生长曲线图；

图2为复合菌剂对不同浓度三氯乙烯的降解柱状图；

图3为复合菌剂对不同类型氯代烃的降解曲线图。

具体实施方式

1、实验材料

NMS液体培养基的组成如下(g/L):NaNO₃，0.850；KH₂PO₄，0.530；Na₂HPO₄，0.170；MgSO₄·7H₂O，0.037；CaCl₂·2H₂O，0.007；FeSO₄·7H₂O，0.011。

微量元素溶液，体积为2ml，pH为6.8。微量元素溶液组成如下(mg/L)：ZnSO₄·7H₂O，0.204；CuSO₄·5H₂O，1.25；MnSO₄·4H₂O，0.223；H₃BO₃，0.062；Na₂M_OO₄·2H₂O，0.048；C_OCl₂·6H₂O，0.048。

其余试剂为市售分析纯产品。

2、检测方法

各菌液的光密度OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为600nm。活细胞浓度采用平板菌落计数法确定。菌体干重通过10ml菌液在80℃下烘干至恒重，用精密电子天平称量。每个实验最少做2组平行试验，确保相对标准偏差RSD小于5％。

氯代烃的检测采用气相色谱(安捷伦6890N)。色谱条件：GDX不锈钢柱(10m×2mm)，进样口温度、柱温以及检测器(ECD)温度分别为80℃、50℃、120℃，氢气为载气，流速为25ml/min，进样量为0.2ml。

实施例1：

步骤1)菌种的驯化

甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1氯化烃定向驯化：垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场矿化垃圾，本实施例选取上海老港垃圾填埋场(上海市南汇区老港东部)已填埋10年的垃圾，取4mm筛下和2mm筛上垃圾颗粒，添加一定量的氯仿并调节pH至适合甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1生长，在甲烷和空气混合气中密闭驯化2周以实现菌株的复壮。

甲基杆菌Methylobacterium sp.R1氯化定向驯化：垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场覆盖层，本实施例选取重庆长生桥垃圾填埋场(重庆市南岸区)，取4mm筛下和2mm筛上垃圾颗粒，添加一定量的氯仿并调节pH至适合甲基杆菌Methylobacterium sp.R1生长，在甲烷和空气混合气中密闭驯化2周以实现菌株的复壮。

微杆菌Microbacterium sp.DH氯化定向驯化：垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场矿化垃圾，本实施例选取上海老港垃圾填埋场(上海市南汇区老港东部)已填埋10年的垃圾，取4mm筛下和2mm筛上垃圾颗粒，在甲烷和空气混合气中密闭驯化2周以实现菌株的复壮。

贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1氯化定向驯化：垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场覆盖层，本实施例选取重庆长生桥垃圾填埋场(重庆市南岸区025乡道)，取4mm 筛下和2mm筛上垃圾颗粒，添加一定量的氯仿并调节pH至适合贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1生长，在甲烷和空气混合气中密闭驯化2周以实现菌株的复壮。

步骤2)菌种的扩大培养

甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1的培养方法

挑单菌落5-10环至分装了20ml NMS液体培养基的100ml血清瓶中，加盖橡胶塞密封；用20ml甲烷气体置瓶内20ml空气，在30℃、160r/min条件下振荡培养7d。

甲基杆菌Methylobacterium sp.R1的培养方法

挑单菌落5-10环至分装了20ml NMS液体培养基的100ml血清瓶中，其中葡萄糖浓度为3％，加盖橡胶塞密封，在30℃、160r/min条件下振荡培养2d。

微杆菌Microbacterium sp.DH的培养方法

贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1的培养方法

挑单菌落5-10环至分装了20ml NMS培养基的100ml血清瓶中，添加0.5ml30℃的饱和三氯乙烯溶液为碳源，加盖橡胶塞密封，在27℃、160r/min条件下振荡培养7d。

3)复合菌剂的制备

取步骤2)所得甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1菌液1～3ml，甲基杆菌Methylobacterium sp.R1菌液2～4ml，微杆菌Microbacterium sp.DH菌液1～3ml，贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1菌液1～2ml，混合，得到种子液。将10ml种子液接入分装了100ml NMS液体培养基的500ml血清瓶中，以甲烷或葡萄糖为碳源，用内衬硅胶/聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养2～4d。采用UV2000分光光度计检测菌液的OD₆₀₀值，菌体细胞的生长状况如图1所示。

由图1可知，菌体细胞的延迟期在15h左右，当进入对数期后菌体细胞生长迅速，OD₆₀₀值升至0.7仅用了25h，之后达到平稳期，得到复合菌剂。

实施例2：复合菌剂对不同浓度三氯乙烯的降解

1、取含有浓度为1.65mg/L三氯乙烯的复合菌剂(OD₆₀₀＝0.6±0.1)20ml接入100ml血清瓶中，用内衬聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养24h，用气相色谱法检测三氯乙烯的降解率为95％，表明复合菌剂具有良好的三氯乙烯耐受性和降解效果。

2、取含有浓度为2.73mg/L三氯乙烯的复合菌剂(OD₆₀₀＝0.6±0.1)20ml接入100ml血清瓶中，用内衬聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养24h，用气相色谱法检测三氯乙烯的降解率为96％，表明复合菌剂具有良好的三氯乙烯耐受性和降解效果。

3、取含有浓度为5.39mg/L三氯乙烯的复合菌剂(OD₆₀₀＝0.6±0.1)20ml接入100ml血清瓶中，用内衬聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养24h，用气相色谱法检测三氯乙烯的降解率为97％，表明复合菌剂具有良好的三氯乙烯耐受性和降解效果。

4、取含有浓度为8mg/L三氯乙烯的复合菌剂(OD₆₀₀＝0.6±0.1)20ml接入100ml血清瓶中，用内衬聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养24h，用气相色谱法检测三氯乙烯的降解率为50％，表明三氯乙烯浓度过高对复合菌剂有一定的抑制作用。

复合菌剂对不同浓度三氯乙烯的降解柱状图如图2所示，表明复合菌剂在三氯乙烯浓度小于8mg/L的条件下具有良好的耐受性和降解效果，当三氯乙烯浓度为1.65mg/L、2.73mg/L和5.39mg/L时，降解率分别达到了95％、96％和97％。实施例3：复合菌剂对废水中不同类型氯代烃的降解

1、取含有浓度为0.30mg/L 1,3-三氯丙烷的复合菌剂(OD₆₀₀＝0.6±0.1)20ml接入100ml血清瓶中，用内衬聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养6h，用气相色谱法检测1,3-三氯丙烷的降解速率为0.03mg/(L*h)，培养2d后降解率达到了90％以上，表明复合菌剂具有良好的1,3-三氯丙烷耐受性和降解效果。

2、取含有浓度为0.07mg/L 1,2-二氯乙烷的复合菌剂(OD₆₀₀＝0.6±0.1)20ml接入100ml血清瓶中，用内衬聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养5h，用气相色谱法检测1,2-二氯乙烷的降解速率为0.014mg/(L*h)，培养2d后降解率达到了90％以上，表明复合菌剂具有良好的1,2-二氯乙烷耐受性和降解效果。

3、取含有浓度为0.004mg/L四氯化碳的复合菌剂(OD₆₀₀＝0.6±0.1)20ml接入100ml血清瓶中，用内衬聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养6h，用气相色谱法检测四氯化碳的降解速率为5×10^-4mg/(L*h)，培养2d后降解率达到了90％以上，表明复合菌剂具有良好的四氯化碳耐受性和降解效果。

4、取含有浓度为0.04mg/L 1,1,2-三氯乙烷的复合菌剂(OD₆₀₀＝0.6±0.1)20ml接入100ml血清瓶中，用内衬聚四氟乙烯胶塞封口，外加铝盖密封，在30℃、170r/min条件下振荡培养5h，用气相色谱法检测1,1,2-三氯乙烷的降解速率为2.8×10^-3mg/(L*h)，培养2d后降解率达到了90％以上，表明复合菌剂具有良好的1,1,2-三氯乙烷耐受性和降解效果。

复合菌剂对不同类型氯代烃的降解曲线图如图3所示，表明复合菌剂对不同类型的氯代烃均具有良好的耐受性和降解效果。

实验中发现，在其它条件不变的情况下，甲基胞囊菌Methylocystis sp.JTA1比例在10～30％，甲基杆菌Methylobacterium sp.R1比例在20～40％，微杆菌Microbacteriumsp.DH比例在10～30％，贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1的比例为5～20％，均能达到本发明的实验效果。复合菌剂与废水体积比为1～10％时，能达到本发明的实验效果，综合考虑时间因素和经济性因素，复合菌剂为废水体积2.0～4.0％的比例时，降解氯代烃的效果最佳。

Claims

1.一种降解氯代烃的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括甲基胞囊菌JTA1（Methylocystis sp.JTA1）、甲基杆菌R1（Methylobacterium sp.R1）、微杆菌DH（Microbacterium sp.DH）和贪铜菌SWA1（Cupriavidus sp.SWA1）复合而成，其中，甲基胞囊菌JTA1的保藏号为CCTCC NO: M 2013062，甲基杆菌R1的保藏号为CCTCC NO:M 2015046，微杆菌DH的保藏号为CCTCC NO ：M2010099，贪铜菌SWA1的保藏号为CCTCC NO ：M 2015045，甲基胞囊菌JTA1、甲基杆菌R1、微杆菌DH和贪铜菌SWA1的比例为10～30%：20～40%：10～30%：5～20%。

2.权利要求1所述降解氯代烃的复合菌剂的制备方法，其特征在于，有以下步骤，

1）菌种的驯化

采用氯代烃梯度驯化的方法，对权利要求1所述各菌种进行氯代烃定向驯化；

2）菌种的扩大培养

以含碳化合物为碳源，在NMS液体培养基中分别对步骤1）驯化后的菌种进行扩大培养；

3）复合菌剂的制备

取步骤2）所得的菌液，按权利要求1所述比例混合，得到种子液，种子液富集培养至OD₆₀₀ =0.6±0.1，即得复合菌剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中含碳化合物为葡萄糖、甲烷、乙酸钠、三氯乙烯中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述扩大培养的方法为：

甲基胞囊菌

挑单菌落5-10环至NMS液体培养基中，密封，以甲烷为碳源，在30℃、160 r/min条件下振荡培养7 d；

甲基杆菌

挑单菌落5-10环至NMS液体培养基中，密封，以3%浓度葡萄糖为碳源，在30℃、160 r/min条件下振荡培养2-4d；

微杆菌

挑单菌落5-10环至NMS液体培养基中，密封，以3%浓度葡萄糖为碳源，在30℃、160 r/min条件下振荡培养2-4 d；

贪铜菌

挑单菌落5-10环至NMS液体培养基中，添加饱和三氯乙烯溶液，密封，在27℃、160 r/min条件下振荡培养7 d。

5.权利要求1所述降解氯代烃的复合菌剂在用于高效降解废水中氯代烃的用途。