CN100392072C - 甲烷氧化菌的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲烷氧化菌的培养方法。该方法是在常规培养甲烷氧化菌的培养基中添加经甲烷饱和的油酸；其中，当对甲烷氧化菌进行液体培养时，将经甲烷饱和的油酸直接加入培养基中，经甲烷饱和的油酸在培养基中的质量百分含量为0.1-20%；当对甲烷氧化菌进行固体培养时，将经甲烷饱和的油酸涂布在固体培养基表面，涂层的厚度为0.5-3mm。与常规培养方法相比，本发明的方法可以成倍地提高甲烷氧化菌的生长速度，最高达50倍。在用该方法对甲烷氧化菌进行固体平板培养时，不再需要频繁地给固体平板补充甲烷气体，菌体的生长速度也得到显著提高。本发明将在甲烷氧化菌及其相关产品的工业化生产中发挥巨大作用，应用前景广阔。

Description

甲烷氧化菌的培养方法
技术领域
本发明涉及微生物的培养方法，特别是涉及一种甲烷氧化菌的快速培养方法。
背景技术
甲烷氧化菌是自然界中一类非常特殊的微生物，它以甲烷为唯一的碳源及能源。虽然某些甲烷氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。研究表明甲烷氧化菌可以广泛地应用于生物转化及环境治理中。甲烷单加氧酶是甲烷氧化菌利用甲烷的关键酶，在该酶的作用下，甲烷氧化菌能够利用空气中的氧气作为电子受体将甲烷直接氧化为甲醇。一般情况下，由于甲烷在水溶液中的溶解度较低，导致甲烷氧化菌生长速率慢、所得细胞浓度低，成为限制甲烷氧化菌工业化应用的瓶颈。提高气液传质是强化甲烷氧化菌生长和甲醇生产的关键技术之一。因此，如何强化气液传质，提高气液传质速率，是实现甲烷氧化菌的高密度细胞培养首先需要解决的问题。传统的解决办法是增加气速和搅拌速率。但增加气速和搅拌速率，一方面可导致大量的泡沫生成，从而降低反应器使用效率；另一方面气速和搅拌速率的增加必然增大动力消耗，增加操作成本。和一般好氧微生物细胞的培养不同，甲烷氧化菌的细胞培养过程，不仅需要空气或氧气，而且需要甲烷。甲烷与空气或氧气的混合比例超过一定范围时具有爆炸危险，而且，增大气流速度必然导致气体的大量循环，且工艺复杂，动力消耗增加。
传统的甲烷氧化菌的固体平板培养法操作复杂，培养时间长。不仅需要每天换气，而且培养到菌落出现一般需4-6周的时间，在反复地换气过程中又极易造成杂菌的污染。因此有必要发明一种快速、简便的甲烷氧化菌的固体平板培养方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可显著提高甲烷氧化菌的生长速率的培养方法。
本发明所提供的甲烷氧化菌的快速培养方法，是在常规培养甲烷氧化菌的培养基中添加脂肪酸。
所述脂肪酸可为任意一种碳链长度大于10，且常温下呈液态的脂肪酸，如油酸、亚油酸、十一酸、十二酸，十三酸、十四酸、十五酸或十六酸等。
上述培养方法对甲烷氧化菌的液体培养和固体培养同时适用。
对甲烷氧化菌进行液体培养时，只需将脂肪酸直接加入培养基中即可。脂肪酸的使用量与培养容器的形状有关，其在培养基中的质量百分含量优选为0.1-20％，勿使培养基表面覆盖的脂肪酸层太厚。
对甲烷氧化菌进行固体培养时，需将经甲烷饱和的脂肪酸涂布在固体培养基表面。
所述对脂肪酸用甲烷进行饱和的方法，是将脂肪酸置于充满甲烷的密闭器皿中进行振荡，使甲烷分子尽可能地溶解于脂肪酸中；若在50-250rpm的振速下，振荡12-24小时即可。
在固体培养基表面涂布的脂肪酸层的厚度可为0.5-3mm，勿使培养基表面覆盖的脂肪酸层太厚。
为获得更好的培养效果，可将表面涂布有用甲烷饱和的脂肪酸的固体培养基在30℃下放置12-24小时，再按常规方法进行接种、培养。
本发明提供了一种甲烷氧化菌的快速培养方法。本发明具有以下优点：1)脂肪酸受到机械力的作用形成微小的小球，这些小球可以在气相与菌体之间穿梭运动，从而源源不断地将空气中的甲烷直接供给菌体生长之用；2)脂肪酸与菌体代谢物联合作用产生极为稳定的微乳相，该微乳相的增容作用有利于甲烷氧化菌的生长。本发明人先前申请的专利(缑仲轩，邢新会等，一种培养甲烷氧化菌的方法，申请号：200510105989.3)中的方法只具有第一个优点，因而培养效果无法与本发明的方法相比。此外，与常规培养方法相比，本发明的方法可以成倍地提高甲烷氧化菌的生长速度，最高可达50倍。此外，在用本发明的方法对甲烷氧化菌进行固体平板培养时，不再需要频繁地给固体平板补充甲烷气体，菌体的生长速度也得到显著提高。基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌及其相关产品的工业化生产中发挥巨大作用，具有广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为经甲烷饱和的不同甲烷溶剂对甲烷氧化菌生长速度影响的比较试验中培养第2、3、4天菌液OD600光密度值的测定结果
图2为经甲烷饱和的不同甲烷溶剂对甲烷氧化菌生长速度影响的比较试验中培养结束后细胞干重的统计结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为去离子水。
NMS培养基配方：每升培养基中含有NaNO30.85克，KH2PO40.53克，Na2HPO42.17克，K2SO40.17克，MgSO4·7H2O 0.037克，CaCl2·2H2O 0.007克，微量元素贮存液2mL，1mmol/L H2SO4 0.5毫升，FeSO4·7H2O 11.2毫克，CuSO4·5H2O 2.5毫克(固体培养基再添加1.5％的琼脂)，pH 7.0。
微量元素贮存液的配方为：每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042克，MnSO4·4H2O0.223g，H3BO30.062g，Na2MoO4·2H2O 0.048g，CoCl2·6H2O 0.048g，KI 0.083g。
实施例1、甲烷氧化菌的种子培养
1)用灭菌的接种环挑取甲烷氧化菌保存液(Methylosinus trichosporium)OB3b(Sullivan JP et al.Methanotrophs，Methylosinus trichosporium OB3b，sMMO，and their application to bioremediation，Crit.Rev.Microbiol.，1998，4(24)：335-373；Takeguchi M et al.，Properties of the membranes containing theparticulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b，Biometals，1998，11：229-234)，用划线的方法将其接种于NMS平板固体培养基表面，每天用注射器通过O.2μ的过滤器向培养皿中加入5-10毫升的甲烷气体，30℃培养四周后，平板上有明显的单菌落产生。
2)取50毫升的培养瓶，装入NMS液体培养基10毫升，灭菌后，从步骤1)的固体平面上挑一单菌落接种到该NMS液体培养基中，每天用注射器通过0.2μ的过滤器加入5-10毫升的甲烷气体，30℃、150rpm振荡培养四周后，培养基可见混浊，用此甲烷氧化菌的常规培养方法获得了甲烷氧化菌的种子。
实施例2、不同甲烷溶剂对甲烷氧化菌生长速度影响的比较
1、甲烷溶剂的饱和处理
取6个50毫升的培养瓶，分别装入20毫升的油酸，121℃15分钟灭菌后，通过O.2μ的过滤器加入40毫升的甲烷，在30℃的摇床上振荡12小时(中间通过0.2μ的过滤器补充甲烷数次)，得到经甲烷饱和的油酸。
2、经甲烷饱和的不同甲烷溶剂对甲烷氧化菌生长速度影响的比较试验
取50毫升的培养瓶7个，均装入NMS液体培养基10毫升，灭菌后每个培养瓶中分别加入1毫升上述经甲烷饱和的不同甲烷溶剂(苯、环己烷、癸烷、辛烷、甲苯、石蜡油、油酸)，再加入500微升实施例1制备的种子液，然后用注射器通过0.2μ的过滤器加入20毫升的甲烷气体，在30℃、150rpm下培养1周，以常规培养方法为对照，并分别于第2、3、4天记录菌液OD600的光密度值，光密度值测定结果如图2所示(1为常规的甲烷氧化菌培养结果；2为利用苯作为甲烷溶剂的培养结果；3为利用环己烷作为甲烷溶剂培养甲烷氧化菌的培养结果；4为利用癸烷作为甲烷溶剂的培养结果；5为利用辛烷作为甲烷溶剂的培养结果；6为利用甲苯作为甲烷溶剂的培养结果；7为利用石蜡油作为甲烷溶剂的培养结果；8为利用油酸作为甲烷溶剂的培养结果)，培养结束后，统计细胞干重，统计结果如图2所示(1号为空白组，2号为辛烷实验组的细胞回收率，3号为庚烷实验组的细胞回收率，4号为石蜡油实验组的细胞回收率，5号为油酸实验组的细胞回收率)，实验结果表明油酸实验组的甲烷氧化菌的细胞浓度明显高于其它处理组，OD600的光密度值可达到32，干细胞回收率可达13±2.85克/升。
实施例3、利用油酸进行甲烷氧化菌的固体平面培养
取200微升实例2中的经甲烷饱和的油酸，涂布于NMS固体平板的培养基表面，30℃放置20小时后，用接种环取实例1中的菌液划线接种于固体培养平板上，30℃培养，以传统的甲烷氧化菌的固体培养为对照。结果培养一周后有明显的菌落产生，而对照组在4-6周后才有菌落产生，且操作复杂。该实验结果表明本发明的培养方法也可显著提高甲烷氧化菌固体培养的生长速率。

Claims (4)

1.一种培养甲烷氧化菌的方法，是在常规培养甲烷氧化菌的培养基中添加经甲烷饱和的油酸；其中，当对甲烷氧化菌进行液体培养时，将经甲烷饱和的油酸直接加入培养基中，油酸在培养基中的质量百分含量为0.1-20％；当对甲烷氧化菌进行固体培养时，将经甲烷饱和的油酸涂布在固体培养基表面，涂层的厚度为0.5-3mm。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述经甲烷饱和的油酸是将油酸置于充满甲烷的密闭器皿中进行振荡得到的。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述振荡的速度为50-250rpm，振荡时间为12-24小时。
4.根据权利要求1或2或3所述的培养方法，其特征在于：所述将表面涂布有经甲烷饱和的油酸的固体培养基在30℃下放置12-24小时，再进行接种。
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