CN105002229B - 一种制备γ-癸内酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备γ‑癸内酯的方法，以酵母CICC32859为菌种制成种子培养液，然后接种于转化培养基，通过向转化培养基中添加L‑肉碱，并在转化过程中向发酵液中添加少量的γ‑内酯化合物，以蓖麻油酸为底物进行生物转化制备γ‑癸内酯。本发明提供的γ‑癸内酯制备方法除了提升产物生成速率、缩短发酵周期，更重要的是提供了一种新的抑制酵母菌对产物γ‑癸内酯开环降解的方法，从而极大的提高了γ‑癸内酯的一次性累积量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种γ-癸内酯，具体来说是一种制备γ-癸内酯的方法。
背景技术
γ-癸内酯(gamma decalactone)，又名丙位癸内酯，是一种重要的含有五元内酯环的芳香化合物，呈愉快桃子和椰子香气，在香料工业中得到了广泛的应用。现阶段γ-癸内酯的获取方式有三种方法：天然提取、化学合成和生物法制备。γ-癸内酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，因此可以从水果中提取得到γ-癸内酯，但其在水果中的含量极少，经济效益低。化学合成法也可以得到γ-癸内酯，但其合成的γ-癸内酯主要为无旋光的外消旋体，没有从水果中提取出的具有光学活性的γ-癸内酯具有优势，且无法满足人们对天然产物的追求。生物法制备γ-癸内酯以其天然性及原料的廉价性日益成为中内外学者关注的焦点，并在这方面的研究越来越深入，为以后的产业化打下了基础。
生物法制备γ-癸内酯的研究中，较为成熟的为生物转化法。在生物转化法制备γ-癸内酯的研究中，采用最多的底物为蓖麻油，也有少量文献中提到用蓖麻油酸作为转化合成γ-癸内酯的底物。当底物为蓖麻油酸时，该生物转化体系中存在很多困难，如蓖麻油酸对酵母细胞的毒性、酵母对蓖麻油酸的利用率低、转化周期长、γ-癸内酯产量低等，严重阻碍了对以蓖麻油酸为底物生物转化制备γ-癸内酯的研究及其工业化的路程。而且，在生物转化制备γ-癸内酯时，当发酵液中γ-癸内酯的含量累积到一定浓度时，γ-癸内酯会与酵母细胞中的内酯酶的结合位点结合，进而造成产物的开环降解，即使当发酵液中底物充足时，γ-癸内酯被大量降解的情况依然存在。因此，有研究采用原位分离的方法，如向发酵液中添加大孔吸附树脂、利用双液相萃取法进行生物转化等，以此来将发酵液中γ-癸内酯部分移除，降低酵母对γ-癸内酯的降解；但这些方法在生产中仍存在明显的缺点，如生产成本高、两相分离提纯复杂、树脂易被污染造成转化过程非常容易染菌或交叉污染等。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种制备γ-癸内酯的方法，所述的这种制备γ-癸内酯的方法解决了现有技术中的方法成本高，分离困难的技术问题。
本发明提供了一种制备γ-癸内酯的方法，以酵母CICC32859为菌种制成种子培养液，然后接种于转化培养基，以蓖麻油酸为底物进行生物转化制备γ-癸内酯，在生物转化过程中向发酵液中添加γ-内酯化合物，添加到发酵液中的γ-内酯化合物的含量为0.01～0.5g/L。
进一步的，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)一个选取菌种的步骤，以酵母CICC32859为菌种；
(2)一个斜面培养的步骤，将酵母CICC32859接种于斜面培养基上，20～35℃培养24～36H；所述的斜面培养基的配方为：葡萄糖10g/L，氯化钠4g/L，氯化钙5g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH为7；
(3)一个配制种子液的步骤，将步骤(2)所得的菌株，接种到种子培养基中，在20～35℃条件下，150～250r/min摇床培养20～24H，得到成熟的种子培养液；所述的种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠5g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨5g/L，pH为7；
(4)一个转化培养的步骤，将步骤(3)获得的成熟种子液，按接种量10～20％接种到含有L-肉碱的转化培养基，所述的转化培养基的配方为：蓖麻油酸10～40g/L，L-肉碱0.01～0.5g/L，葡萄糖1～20g/L，氯化钠1～10g/L，磷酸氢二钾0.5～10g/L，七水硫酸镁3～15g/L，磷酸二氢铵0.5～15g/L，酵母膏1～20g/L，吐温-800.5～10g/L，pH为5.5～7.5，以蓖麻油酸为底物，在转速为150～250r/min，温度为25～35℃的条件下转化培养36～60H，然后无菌条件下添加γ-内酯化合物，所述的γ-内酯化合物的添加量为0.01～0.5g/L，在转速为150～250r/min，温度为25～35℃的条件下继续培养12～24H，转化培养结束，获得含有γ-癸内酯的发酵液。
进一步的，所述的γ-内酯化合物为γ-己内酯、γ-辛内酯、γ-十二内酯、或者γ-十四内酯。
本发明是一种通过酵母生物转化蓖麻油酸制备γ-癸内酯的方法，通过向转化培养基中添加L-肉碱，促进了酵母对底物蓖麻油酸的利用，缩短了转化周期、提高γ-癸内酯的产量，另一方面，L-肉碱还能在一定程度上降低底物蓖麻油酸对酵母的毒害作用，维护酵母细胞的活性。更重要的是，在生物转化过程中，通过向发酵液中添加少量或微量的其它的γ-内酯化合物，使其与γ-癸内酯对内酯酶的结合位点形成竞争，从而抑制酵母对γ-癸内酯的降解，从而极大地提高γ-癸内酯的累积浓度和产量。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供的γ-癸内酯制备方法除了提升产物生成速率、缩短发酵周期，更重要的是提供了一种新的抑制酵母菌对产物γ-癸内酯开环降解的方法，从而极大的提高了γ-癸内酯的一次性累积量，具有良好的工业应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明采用的酵母CICC32859是公开销售的微生物，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，该机构的地址为：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼(100015)，可以通过电话购买，也可以通过网站订购(http://www.china-cicc.org)，任何人只要支付相关的费用均可以购买。
实施例1
一种酵母生物转化蓖麻油酸制备γ-癸内酯的方法，包括下列步骤：将酵母CICC32859制成种子液，然后将其接种到含有L-肉碱的转化培养基中，以蓖麻油酸为底物，在摇瓶或发酵罐中进行好氧生物转化，温度控制在25～35℃，转化培养36～48H后，于无菌条件下向发酵液中添加γ-内酯0.01～0.5g/L，继续培养12～24H，生物转化结束，得到含有γ-癸内酯的发酵液；培养结束后，取一定体积的发酵液，用三倍体积的正己烷萃取，取有机相进行气相检测，得到发酵液中γ-癸内酯的含量，以下各实施例中均以此方法得到γ-癸内酯。
所述的转化培养基的配方为：蓖麻油酸10～40g/L，L-肉碱0.01～0.5g/L，葡萄糖1～20g/L，氯化钠1～10g/L，磷酸氢二钾0.5～10g/L，七水硫酸镁3～15g/L，磷酸二氢铵0.5～15g/L，酵母膏1～20g/L，吐温-800.5～10g/L，pH 5.5～7.5。
所述转化过程，摇瓶培养，控制转速150～250r/min；发酵罐培养，控制转速为200～600r/min，通气比为0.2～3.0v.v-1.m-1。
实施例2 对照实施例
将酵母CICC32859接种于斜面培养基中进行活化培养，用接种环从活化的斜面中挑取两环菌体接种到装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，于28℃恒温摇床中，180r/min培养20H，得到成熟的种子液；按体积百分比10％的接种量，转接到装有50mL转化培养基的250mL的三角瓶中，于30℃恒温摇床中，200r/min转化培养84H，生物转化结束，获得含有γ-癸内酯的发酵液；取2mL含有γ-癸内酯的发酵液，用6mL正己烷萃取，取有机相进行气相检测，测得60H时发酵液中的γ-癸内酯的含量最高且为3.5g/L，72H时发酵液中的γ-癸内酯的含量为3.1g/L,84H时发酵液中的γ-癸内酯的含量为2.7g/L。
所述的斜面培养基的配方为：葡萄糖10g/L，氯化钠4g/L，氯化钙5g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH 7；所述的种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠5g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨5g/L，pH 7；所述的转化培养基的配方为：蓖麻油酸15g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠7g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁5g/L，磷酸二氢铵2g/L，酵母膏10g/L，吐温-800.7g/L，pH 6.5。
实施例3 L-肉碱的添加对γ-癸内酯转化的影响
将酵母CICC32859接种于斜面培养基中进行活化培养，用接种环从活化的斜面中挑取三环菌体接种到装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，于28℃恒温摇床中，230r/min培养22H，得到成熟的种子液；按体积百分比12％的接种量，将种子液转接到装有50mL转化培养基的250mL的三角瓶中，于32℃恒温摇床中，250r/min转化培养84H，生物转化结束，获得含有γ-癸内酯的发酵液；取2mL含有γ-癸内酯的发酵液，用6mL正己烷萃取，取有机相进行气相检测；当转化培养基中L-肉碱的浓度为0.3g/L，测得36H时发酵液中的γ-癸内酯的含量最高且为4.7g/L，测得48H时发酵液中的γ-癸内酯的含量为4.5g/L，测得60H时发酵液中的γ-癸内酯的含量为3.9g/L；实验结果表明，转化培养基中L-肉碱的添加能够缩短转化周期并提高γ-癸内酯的产量，本实施例中当L-肉碱的添加浓度为0.3g/L时，转化周期较不添加L-肉碱缩短了20～24H，且添加L-肉碱时的γ-癸内酯的最高产量较对照组的γ-癸内酯的最高产量增加了约34.1％，达到了4.7g/L。
所述的斜面培养基的配方为：葡萄糖10g/L，氯化钠4g/L，氯化钙5g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH 7；所述的种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠5g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨5g/L，pH 7；所述的转化培养基的配方为：蓖麻油酸15g/L，L-肉碱0.3g/L，葡萄糖7g/L，氯化钠7g/L，磷酸氢二钾8g/L，七水硫酸镁12g/L，磷酸二氢铵7g/L，酵母膏17g/L，吐温-802g/L，pH 7；本实施例中对照组的转化培养基的配方为：蓖麻油酸15g/L，葡萄糖7g/L，氯化钠7g/L，磷酸氢二钾8g/L，七水硫酸镁12g/L，磷酸二氢铵7g/L，酵母膏17g/L，吐温-802g/L，pH 7。
实施例4 转化过程中添加其它γ-内酯对产物生成的影响
将酵母CICC32859接种于斜面培养基中进行活化培养，用接种环从活化的斜面中挑取三环菌体接种到装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，于28℃恒温摇床中，250r/min培养20H，得到成熟的种子液；按体积百分比15％的接种量，转接到装有50mL转化培养基的250mL的三角瓶中，于35℃恒温摇床中，200r/min转化培养36H；在转化培养36H后，于无菌条件下向发酵液中添加γ-内酯0.05g/L，添加的γ-内酯分别为γ-己内酯、γ-辛内酯、γ-十二内酯和γ-十四内酯，添加γ-内酯后继续培养24H后生物转化结束，获得含有γ-癸内酯的发酵液；取2mL发酵液，用6mL正己烷萃取，取有机相进行气相检测；实验结果表明，当在生物转化过程中向发酵液中添加的γ-内酯为γ-己内酯和γ-辛内酯时能够明显的抑制酵母对γ-癸内酯的降解，当添加的γ-内酯为γ-十二内酯和γ-十四内酯时对酵母降解γ-癸内酯的抑制效果不明显；与对照相比，当添加的γ-内酯时为γ-己内酯时γ-癸内酯的最终产量增加了约为33.6％，达到了5.5g/L。
所述的斜面培养基的配方为：葡萄糖10g/L，氯化钠4g/L，氯化钙5g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH 7；所述的液体种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠5g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨5g/L，pH 7；所述的转化培养基的配方为：蓖麻油酸10g/L，L-肉碱0.5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾5g/L，七水硫酸镁5g/L，磷酸二氢铵10g/L，酵母膏15g/L，吐温-801g/L，pH 7.5；本实施例中对照组的转化培养基的配方为：蓖麻油酸10g/L，L-肉碱0.5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾5g/L，七水硫酸镁5g/L，磷酸二氢铵10g/L，酵母膏15g/L，吐温-801g/L，pH 7.5。
实施例5 发酵罐转化实验1
将酵母CICC32859接种于斜面培养基中进行活化培养，之后接种于种子培养基中，于28℃恒温摇床中，200r/min培养23H，得到成熟的种子液；按体积百分比18％的接种量，转接到装有2.5L转化培养基的5L的机械搅拌发酵罐中，控制温度33℃，搅拌速率350r/min，通气比为1.6v.v-1.m-1，转化培养40H；在转化培养40H后，于无菌条件下向发酵罐中添加γ-己内酯0.07g/L，继续培养24H后获得含有γ-癸内酯的发酵液；气相检测结果表明，发酵液中γ-癸内酯的含量为6.9g/L。
所述的斜面培养基的配方为：葡萄糖10g/L，氯化钠4g/L，氯化钙5g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH 7；所述的液体种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠5g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨5g/L，pH 7；所述的转化培养基的配方为：蓖麻油酸30g/L，L-肉碱0.4g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠10g/L，磷酸氢二钾10g/L，七水硫酸镁15g/L，磷酸二氢铵15g/L，酵母膏20g/L，吐温-804g/L，pH 6.5。
实施例6 发酵罐转化实验2
将酵母CICC32859接种于斜面培养基中进行活化培养，之后接种于种子培养基中，于28℃恒温摇床中，210r/min培养24H，得到成熟的种子液；按体积百分比20％的接种量，转接到装有3L转化培养基的5L的机械搅拌发酵罐中，控制温度30℃，搅拌速率400r/min，通气比为2.1v.v-1.m-1，转化培养36H；在转化培养36H后，于无菌条件下向发酵罐中添加γ-己内酯0.1g/L，继续培养24H后获得含有γ-癸内酯的发酵液；气相检测结果表明，发酵液中γ-癸内酯的含量为6.2g/L。
所述的斜面培养基的配方为：葡萄糖10g/L，氯化钠4g/L，氯化钙5g/L，酵母膏12g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH 7；所述的液体种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠5g/L，酵母膏20g/L，蛋白胨5g/L，pH 7；所述的转化培养基的配方为：蓖麻油酸25g/L，L-肉碱0.2g/L，葡萄糖18g/L，氯化钠7g/L，磷酸氢二钾6g/L，七水硫酸镁12g/L，磷酸二氢铵11g/L，酵母膏15g/L，吐温-803g/L，pH 7。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种制备γ-癸内酯的方法，其特征在于：以酵母CICC32859为菌种制成种子培养液，然后接种于转化培养基，以蓖麻油酸为底物进行生物转化制备γ-癸内酯，在生物转化过程中向发酵液中添加γ-内酯化合物，所述的γ-内酯化合物为γ-己内酯或者γ-辛内酯，添加到发酵液中的γ-内酯化合物的含量为0.01~0.5 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种制备γ-癸内酯的方法，其特征在于：所述的制备方法包括如下步骤：
（1）一个选取菌种的步骤，以酵母CICC32859为菌种；
（2）一个斜面培养的步骤，将酵母CICC32859接种于斜面培养基上，20~35℃培养24~36H；所述的斜面培养基的配方为：葡萄糖10 g/L，氯化钠4 g/L，氯化钙5 g/L，酵母膏12 g/L，蛋白胨10 g/L，琼脂20 g/L，pH为 7；
（3）一个配制种子液的步骤，将步骤（2）所得的菌株，接种到种子培养基中，在20~35℃条件下，150~250 r/min摇床培养20~24H，得到成熟的种子培养液；所述的种子培养基的配方为：葡萄糖20 g/L，磷酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，氯化钠5 g/L，酵母膏20 g/L，蛋白胨5 g/L，pH 为7；
（4）一个转化培养的步骤，将步骤（3）获得的成熟种子液，按接种量10~20%接种到含有L-肉碱的转化培养基，所述的转化培养基的配方为：蓖麻油酸10~40 g/L，L-肉碱0.01~0.5g/L，葡萄糖1~20 g/L，氯化钠1~10 g/L，磷酸氢二钾0.5~10 g/L，七水硫酸镁3~15 g/L，磷酸二氢铵0.5~15 g/L，酵母膏1~20 g/L，吐温-80 0.5~10 g/L，pH为 5.5~7.5，以蓖麻油酸为底物，在转速为150~250 r/min，温度为25~35℃的条件下转化培养36~60H，然后无菌条件下添加γ-内酯化合物，所述的γ-内酯化合物为γ-己内酯或者γ-辛内酯，所述的γ-内酯化合物的添加量为0.01~0.5 g/L，在转速为150~250 r/min，温度为25~35℃的条件下继续培养12~24H，转化培养结束，获得含有γ-癸内酯的发酵液。
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